張丹丹 周延清 楊珂

摘要：基因特異性分子標(biāo)記是基于基因序列中功能性單核苷酸多態(tài)性（SNP）或插入和缺失（InDels）位點(diǎn)開發(fā)而成，具有選擇效率高、共顯性、與目標(biāo)基因共分離、不受遺傳背景影響等優(yōu)點(diǎn)，且與生物表型性狀高度相關(guān)，在生物表型性狀的鑒定中更突顯出其準(zhǔn)確性和直接性，可以準(zhǔn)確地跟蹤、定位不同遺傳背景下的目標(biāo)等位基因，是農(nóng)作物分子標(biāo)記輔助選擇育種中理想的分子標(biāo)記類型。對(duì)基因特異性分子標(biāo)記的原理、開發(fā)及在植物育種的應(yīng)用進(jìn)行論述，并探討了基因特異性分子標(biāo)記的發(fā)展趨勢(shì)，以期為分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：SNP；InDel；PCR檢測(cè)；分子標(biāo)記輔助育種；基因特異性分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：Q341 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）11-0005-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.001

Abstract： Gene-specific molecular markers are directly developed from functional SNPs or InDels of the gene itself. It has several advantages such as high selective efficiency， co-dominant， co-separate with the target gene， unaffected by genetic background， high correlation to trait， accuration and directness， exactly track and location of target alleles gene under different genetic background， which is an ideal molecular marker for crop marker-assisted selection breeding. The present review concerned the advances on the principle， development， application and development trend of gene-specific molecular markers， which will provide reference to the molecular assisted breeding.

Key words： SNP；InDel；PCR detection；molecular marker-assisted breeding；gene-specific markers

分子標(biāo)記（Molecular marker）是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)而發(fā)展起來(lái)的一種遺傳標(biāo)記?？蛇z傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)被稱為廣義的分子標(biāo)記，而DNA分子標(biāo)記被稱為狹義的分子標(biāo)記[1]。DNA分子標(biāo)記能夠直接反映DNA分子水平上的差異，具有穩(wěn)定性、成本低廉和使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于基因組作圖、基因定位、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化分析和法醫(yī)研究[2]、圖位克隆、功能基因組學(xué)研究、轉(zhuǎn)基因植物鑒定與分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面[3，4]。

基因特異性標(biāo)記是基于目標(biāo)基因內(nèi)部DNA序列多態(tài)性開發(fā)的標(biāo)記，與目標(biāo)基因共分離，不受遺傳背景影響，與生物表型性狀高度相關(guān)，在生物表型性狀的鑒定中更突顯出其準(zhǔn)確性和直接性，將成為生物分子標(biāo)記輔助選擇育種中理想的分子標(biāo)記類型[5]，已在水稻和小麥抗病基因[6-8]、油菜脂肪酸代謝基因[9，10]得到應(yīng)用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)逐步發(fā)展和完善，功能性分子標(biāo)記提高生物品種改良效率的作用和優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越凸顯出來(lái)，其開發(fā)與應(yīng)用必將越來(lái)越多。本研究從原理、開發(fā)及在植物育種的應(yīng)用對(duì)基因特異性分子標(biāo)記的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為該方面的研究提供參考。

1 基因特異性分子標(biāo)記的原理和特點(diǎn)

基因特異性分子標(biāo)記是從目標(biāo)功能基因序列中功能性SNP（單核苷酸多態(tài)性）位點(diǎn)或InDels（堿基的插入-缺失）開發(fā)有效的功能標(biāo)記。由于基因特異性分子標(biāo)記是涉及表型性狀變異的功能基因內(nèi)部多態(tài)性位點(diǎn)的開發(fā)，與隨機(jī)DNA分子標(biāo)記相比，分子標(biāo)記輔助育種具有以下優(yōu)勢(shì)：①能準(zhǔn)確跟蹤、定位功能等位基因，在作物表型性狀的鑒定中更具準(zhǔn)確性；②高效率地篩選出育種所需的有利基因；③將影響相同或不同性狀的等位基因特異性分子標(biāo)記組合，用于分子設(shè)計(jì)育種；④由于是直接來(lái)自基因位點(diǎn)上決定功能的多態(tài)性基序，一旦基因特異性分子標(biāo)記被開發(fā)出來(lái)，可直接應(yīng)用于人工育種群體和自然群體中。

2 基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)

明確與作物表型性狀緊密相關(guān)的功能基因，并將其成功分離、克隆是基因特異性分子標(biāo)記開發(fā)的首要條件。功能基因可以從公共數(shù)據(jù)庫(kù)、相關(guān)文獻(xiàn)或通過(guò)重測(cè)序獲得，將獲得的功能基因和等位基因進(jìn)行序列比對(duì)，尋找功能基因內(nèi)部的特定區(qū)域的SNP、InDel等多態(tài)性基序，開發(fā)出鑒定該功能基因特異SNP或InDel位點(diǎn)的分子標(biāo)記。

2.1 基于SNP的基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于單個(gè)核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。SNP位點(diǎn)在基因內(nèi)區(qū)域分布較多，有的功能SNP位點(diǎn)的改變，會(huì)引起基因堿基序列的改變，進(jìn)而造成其所翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生變化，對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響，從而引起生物性狀的改變，利用引起該變異的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)功能基因特異性分子標(biāo)記。然后，可以對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行快速篩選，分析具有目標(biāo)基因的材料，對(duì)分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。如在作物抗性育種過(guò)程中，同一個(gè)抗性位點(diǎn)可能存在多個(gè)抗譜，多個(gè)不同的功能性等位基因，它們?cè)谛蛄猩细叨认嗨?，?duì)抗病等位基因進(jìn)行序列比對(duì)，尋找各基因特異的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)該SNP位點(diǎn)特異性擴(kuò)增，對(duì)抗性等位基因準(zhǔn)確篩選，能提高植物抗性育種的精確性和效率。如水稻抗瘟病基因Pi9[11，12]、Pi35[13]、Piz-t[14]等，開發(fā)出了其特異性分子標(biāo)記，對(duì)利用抗病基因培育水稻優(yōu)良抗病品種提供重要依據(jù)。

SNP分子標(biāo)記具有多態(tài)性豐富，在作物基因組中分布密度大、富有代表性、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)[15]，但SNP的高檢測(cè)成本曾一度限制其在農(nóng)作物育種中的使用，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量基因組序列的開發(fā)，為科研工作者提供了眾多物種的基因組序列信息，用基于PCR的方法對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)，使其變?yōu)楹?jiǎn)單而高效的分子標(biāo)記。

2.1.1 將SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為CAPS或dCAPS標(biāo)記 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）技術(shù)和衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性（Derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS）技術(shù)是基于PCR擴(kuò)增與酶切反應(yīng)相結(jié)合的方法，即利用能夠區(qū)分識(shí)別目標(biāo)SNP位點(diǎn)序列的某種限制性內(nèi)切酶，對(duì)不同SNP區(qū)段的PCR片段進(jìn)行酶切并電泳分型[16，17]。CAPS和dCAPs分子標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①通?；谝阎幕?；②僅需少量的DNA；③共顯性，僅用PCR和瓊脂糖凝膠電泳就能鑒定純合基因型和雜合基因型；其中最大的優(yōu)勢(shì)是基于候選基因特征的基因型CAPS/dCAPS多態(tài)性，提高了育種程序中遺傳作圖和可靠分子標(biāo)記應(yīng)用的能力[18，19]。

通過(guò)對(duì)相關(guān)等位基因進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得目的基因特異的SNP，若SNP位于限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上，選擇合適的內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)酶切片段分析建立與目標(biāo)基因緊密連鎖的共顯性CAPS標(biāo)記；若SNP所處的位置不是限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在該SNP位點(diǎn)的上游或下游設(shè)計(jì)引物時(shí)，引進(jìn)錯(cuò)配堿基以構(gòu)成一個(gè)可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的位點(diǎn)，通過(guò)酶切片段的差異來(lái)獲得目的基因的特異性分子標(biāo)記。王彩芬等[20]以水稻耐鹽基因SKC1基因的SNP突變體為材料，分析SNP突變位點(diǎn)前后的限制性酶切位點(diǎn)，建立了SKC1突變位點(diǎn)的CAPS標(biāo)記，可用于耐鹽分子標(biāo)記輔助選擇育種。華麗霞等[12]通過(guò)對(duì)抗稻瘟基因Pi9及其他在Pi2/9位點(diǎn)上鑒定到的抗性基因進(jìn)行序列比對(duì)，在Pi9的第一內(nèi)含子處存在一個(gè)特異SNP，在該SNP上游作為正向引物的3′末端引入一個(gè)錯(cuò)配堿基G，將其轉(zhuǎn)化為dCAPS分子標(biāo)記，所開發(fā)的Pi9特異性分子標(biāo)記Pi9SNP可以將Pi9與定位于該位點(diǎn)上的其他抗性基因進(jìn)行區(qū)分。

2.1.2 等位基因特異PCR（AS-PCR）策略 同CAPS和dCAPS標(biāo)記一樣，用等位基因特異PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）檢測(cè)的SNP標(biāo)記也是共顯性標(biāo)記，不同之處在于AS-PCR使用的是自然錯(cuò)配堿基，通過(guò)擴(kuò)增不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)等位基因BLAST比對(duì)，來(lái)獲得目的基因的特異SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的特異性引物的3′末端和SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的等位堿基完全匹配，需要在3′末端不同位置引入錯(cuò)配堿基，若樣品中的SNP位點(diǎn)與特異性引物的3′末端相匹配，便能進(jìn)行有效PCR擴(kuò)增，反之則不能進(jìn)行有效的PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增條帶的有無(wú)來(lái)檢測(cè)目的基因。徐薪惟等[21]通過(guò)對(duì)I-2基因及其他等位基因進(jìn)行序列比對(duì)，在I-2特異的SNP置于引物3′端，并在特異引物的3′端引入C-T堿基錯(cuò)配的引物，退火溫度在58 ℃能根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無(wú)和片段大小，將I-2基因的突變位點(diǎn)和感病品種區(qū)分開，為番茄抗枯萎病輔助育種提供有力工具。等位基因特異PCR法（AS-PCR）通過(guò)巧妙設(shè)計(jì)特異引物，僅通過(guò)PCR反應(yīng)就能將不同的SNP基因型分開，具有程序簡(jiǎn)單、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，可用于分子標(biāo)記輔助育種，但該方法由于特異性引物的穩(wěn)定性較差，對(duì)擴(kuò)增條件要求比較嚴(yán)格，操作繁瑣，只適合于小規(guī)模SNP的檢測(cè)。

2.1.3 PCR-CTPP方法 兩對(duì)交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法是根據(jù)SNP位點(diǎn)不同的基因型設(shè)計(jì)2對(duì)不同的引物，經(jīng)一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析SNP等位基因的方法。PCR-CTPP方法的巧妙之處在于2對(duì)引物的設(shè)計(jì)，引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，具有較高的穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)合理的錯(cuò)配類型及在合適的位置引入人為錯(cuò)配發(fā)生堿基錯(cuò)配，在合適的PCR條件下，擴(kuò)增效率較低，而正確的配對(duì)則可以使PCR擴(kuò)增順利進(jìn)行。通過(guò)設(shè)計(jì)的4條引物并利用待測(cè)品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增條帶類型鑒定基因型。如抗稻瘟病基因Pi25[22]和Pi35[13]，通過(guò)改進(jìn)的PCR-CTPP方法開發(fā)出了鑒定該功能基因的特異SNP位點(diǎn)的分子標(biāo)記，利用該標(biāo)記可快速鑒定水稻種質(zhì)資源的基因型和進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種。PCR-CTPP方法具有快速簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但是由于將2對(duì)引物放入同一個(gè)PCR體系中，可能存在復(fù)雜的相互作用，因此2對(duì)引物Tm值的設(shè)計(jì)、合理的錯(cuò)配類型及錯(cuò)配堿基的引入位置[23]都能提高PCR-CTPP的成功率。另外，改進(jìn)的PCR-CTPP法如兩步法PCR-CTPP[24]、OPA-CTPP[25]的應(yīng)用，使得PCR-CTPP技術(shù)有著更廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 基于InDel的基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)

功能基因序列中堿基的插入、缺失會(huì)對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄激活活性產(chǎn)生一定影響，從而影響植物的性狀[26]。InDel標(biāo)記可通過(guò)片段長(zhǎng)度差異直接檢測(cè)，是共顯性分子標(biāo)記?；贗nDel的基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)是將等位基因BLAST比對(duì)后，查找篩選出特異的InDel位點(diǎn)，針對(duì)InDel位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小區(qū)分等位基因，從而獲得目的基因的InDel標(biāo)記。聶京濤等[27]通過(guò)圖位克隆的方法獲得黃瓜白粉病抗性基因Mlo，并通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)第11外顯子上的1 449 bp片段的插入/缺失，根據(jù)此插入/缺失突變?cè)O(shè)計(jì)InDel標(biāo)記，對(duì)設(shè)計(jì)的3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物差異較大，可以清晰區(qū)分抗、感親本，該InDel標(biāo)記適合大多數(shù)黃瓜材料的白粉病抗性鑒定和分子標(biāo)記輔助育種。

InDel標(biāo)記本質(zhì)上屬于長(zhǎng)度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，可基于PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)InDel進(jìn)行檢測(cè)。因此，用電泳平臺(tái)即可分型，相對(duì)于SNP標(biāo)記操作更加簡(jiǎn)單方便，電泳分型平臺(tái)有瓊脂糖凝膠電泳、變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及毛細(xì)管電泳。InDel長(zhǎng)度變化較大，應(yīng)選擇多態(tài)性差異5～20 bp的InDel，這類InDel設(shè)計(jì)的成功率較高，并且便于檢測(cè)[28]。作為分布密度較廣的SNP和InDel標(biāo)記，它們的分布不均勻，位置有一定互補(bǔ)性，可以根據(jù)目的基因的位置設(shè)計(jì)不同的分子標(biāo)記[29]。明確功能基因的SNP和InDel位點(diǎn)，發(fā)掘出大量的功能基因，有利于進(jìn)一步開發(fā)優(yōu)良基因，并應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種中。

3 基因特異性分子標(biāo)記的應(yīng)用

3.1 基因特異性分子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記輔助育種利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)個(gè)體進(jìn)行優(yōu)勢(shì)基因型的篩選，可在任何生長(zhǎng)期進(jìn)行，不受環(huán)境條件影響，可排除非等位基因相互作用造成的干擾，具有快速、經(jīng)濟(jì)、效率高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[30]。其中基因特異性分子標(biāo)記是基于功能基因內(nèi)部序列多態(tài)性開發(fā)的，與功能基因共分離，在分子標(biāo)記輔助育種中更突顯出其準(zhǔn)確性和直接性。Ramkumar等[6]根據(jù)抗稻瘟病基因Pi54的外顯子區(qū)域中的144 bp插入/缺失的多態(tài)性，創(chuàng)建InDel標(biāo)記——Pi54MAS，可用于水稻分子標(biāo)記輔助育種中。聶京濤等[27]開發(fā)了與黃瓜白粉病抗性主效基因/QTL共分離的3個(gè)共顯性InDel分子標(biāo)記，可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種中；Jin等[31]將茶樹TCS1基因的1個(gè)SNP4318位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成功能性標(biāo)記dCAPS1，可用于分子標(biāo)記輔助選擇中來(lái)提高茶質(zhì)量。

3.2 基因特異性分子標(biāo)記在功能基因鑒定、定位及遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

基因特異性分子標(biāo)記可以將抗病等位基因進(jìn)行鑒定和區(qū)分，用于抗病農(nóng)作物品種的培育。利用基因特異性分子標(biāo)記分布密度大和多態(tài)性高的特點(diǎn)，SNP或InDel位點(diǎn)與某些功能基因或QTL間的連鎖關(guān)系，可將功能基因精細(xì)定位和構(gòu)建遺傳圖譜。華麗霞等[12]利用SNP-dCAPS標(biāo)記，將抗稻瘟病基因pi2/pi9/piz-t與該位點(diǎn)上的其他抗性等位基因及感病等位基因分開，這為分子標(biāo)記輔助育種及抗病基因聚合提供了有效的分子標(biāo)記；蔡海亞等[14]檢測(cè)到水稻抗稻瘟病基因piz-t的特異性SNP位點(diǎn)，通過(guò)特異性引物對(duì)該SNP位點(diǎn)特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)piz-t等位基因的鑒定；張圣平等[32]獲得的黃瓜果實(shí)苦味（Bt）基因的InDel標(biāo)記Bt-InDel-1，可用于無(wú)苦味黃瓜的分子標(biāo)記輔助選擇育種及Bt基因的精細(xì)定位；張成才等[33]將8個(gè)茶樹品種中檢測(cè)到的39個(gè)SNPs轉(zhuǎn)化為CAPS標(biāo)記，此標(biāo)記可以用于茶樹遺傳多態(tài)性檢測(cè)和茶樹遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究；Lv等[34]利用InDel標(biāo)記，將結(jié)球甘藍(lán)抗枯萎病基因（FOC）定位于C06染色體上，為分子標(biāo)記輔助選擇甘藍(lán)抗性育種奠定基礎(chǔ)。

3.3 基因特異性分子標(biāo)記在種質(zhì)資源分析中的應(yīng)用

新品種的鑒定和篩選是作物育種中的重要環(huán)節(jié)，將不同種質(zhì)資源進(jìn)行分類，可以為種間的遺傳差異比較、雜交育種親本選擇等提供參考依據(jù)。馬建等[8]通過(guò)比對(duì)水稻抗、感品種中Pi35等位基因序列檢測(cè)出來(lái)的特異SNP，開發(fā)出Pi35基因的功能性分子標(biāo)記pi35-dCAPS，對(duì)中國(guó)水稻核心種質(zhì)資源和部分育成品種進(jìn)行鑒定，以期發(fā)掘攜帶Pi35基因的新品質(zhì)；Zhou等[35]選定的55個(gè)SNP標(biāo)記和基因分型方法是咖啡種質(zhì)資源管理的輔助工具。朱東旭等[36]篩選出286個(gè)結(jié)球甘藍(lán)相對(duì)于大白菜的特異InDel標(biāo)記，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室獲得的大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系進(jìn)行初步鑒定，為大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系的精確鑒定開辟了新途徑。郭廣君等[37]獲得的辣椒2號(hào)染色體35個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記可有效區(qū)分24份辣椒種質(zhì)的多樣性和特異性，其聚類結(jié)果與表型特征吻合?；蛱禺愋苑肿訕?biāo)記在種質(zhì)資源的遺傳分析、品種區(qū)分上有很好的精確性，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

4 展望

分子標(biāo)記一直在不斷發(fā)展，不同分子標(biāo)記各有其優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)研究目的，科學(xué)家可以選擇最合適的分子標(biāo)記。各種分子標(biāo)記的結(jié)合使用可節(jié)省標(biāo)記的開發(fā)時(shí)間和成本，提高遺傳圖譜的精度和多態(tài)性，加快輔助育種的進(jìn)度。如基于EST-SNP的CAPS標(biāo)記的開發(fā)[38，39]；如基于RAPD、AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化的SCAR標(biāo)記，提高了標(biāo)記的穩(wěn)定性，在輔助育種中更靈活、有效[40-43]。

RFLP、RAPD、AFLP及SSR等隨機(jī)DNA分子標(biāo)記是基于基因組中隨機(jī)多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)而成，這些分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖關(guān)系常常因基因重組而被破壞，從而影響標(biāo)記的可靠性[44，45]。而基因特異性分子標(biāo)記是基于植物表型性狀連鎖的目標(biāo)功能基因序列中，特定區(qū)域位點(diǎn)上的 SNPs或 InDels開發(fā)的[5]，能準(zhǔn)確地跟蹤、定位群體中的目標(biāo)等位基因?；蛱禺愋苑肿訕?biāo)記的開發(fā)首先要獲得與植物表型性狀密切相關(guān)的功能基因以及主效功能基因，而大量基因組序列未知，導(dǎo)致InDel和SNP的引物設(shè)計(jì)與開發(fā)存在一定的難度。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，大量基因組序列的開發(fā)，可利用的國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息的日益豐富，使得SNP和InDel標(biāo)記的開發(fā)空間進(jìn)一步提高。如SNP位點(diǎn)的開發(fā)方法有EST數(shù)據(jù)庫(kù)、擴(kuò)增子重測(cè)序、全基因組序列、第二代測(cè)序技術(shù)等[46]；如分離、克隆功能基因的方法有圖位克隆[47]、比較基因組學(xué)[48]、電子克隆[49]等；如全基因組酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化測(cè)序技術(shù)RAD-seq技術(shù)[50]、TILLING和TS-PCR技術(shù)的結(jié)合[51]，使得SNP標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用的效率大大提高；基因的功能鑒定通常能根據(jù)相似功能基因之間的序列同源性推測(cè)表達(dá)序列可能具有的功能；另外，表達(dá)譜分析等高通量的檢測(cè)方法、RNA干擾、定向誘變（TILLING）等也可以用來(lái)鑒定基因的功能[52]。如何使更多的功能基因被分離與鑒定，如何開發(fā)與功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，尤其是基因位點(diǎn)特異性標(biāo)記，對(duì)于精準(zhǔn)鑒定農(nóng)作物抗性品種以及培育抗病品種具有重要意義。

隨著生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、基因芯片等的不斷發(fā)展與分子標(biāo)記的相互融合，將出現(xiàn)更具體、更實(shí)用、更簡(jiǎn)單的分子標(biāo)記，分子標(biāo)記在植物的研究方面將有更加廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周延清，楊清香，張改娜.生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

[2] GROVER A，SHARMA P C. Development and use of molecular markers：Past and present.[J].Critical Reviews in Biotechnology，2014，36（2）：1-13.

[3] 熊發(fā)前，蔣 菁，鐘瑞春，等.分子標(biāo)記技術(shù)的兩種新分類思路及目標(biāo)分子標(biāo)記技術(shù)的提出[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（10）：60-64.

[4] 周延清，王婉珅，王向楠，等.地黃DNA分子標(biāo)記與基因功能研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2015，50（5）：665-672.

[5] LIU Y，HE Z，APPELS R，et al. Functional markers in wheat：Current status and future prospects[J].Theoretical & Applied Genetics，2012，125（1）：1-10.

[6] RAMKUMAR G，SRINIVASARAO K，MOHAN K，et al. Development and validation of functional marker targeting an InDel in the major rice blast disease resistance gene Pi54（Pikh）[J].Molecular Breeding，2011，27（1）：129-135.

[7] 江 崢，王琪琳，吳建輝，等.基于基因特異性標(biāo)記分析Pm21在中國(guó)冬小麥品種（系）中的分布[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（11）：2078-2087.

[8] 馬 建，馬小定，趙志超，等.水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子標(biāo)記的開發(fā)及其應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào)，2015，41（12）：1779-1790.

[9] 楊慶勇. 油菜種子高油酸低亞麻酸的遺傳控制及等位基因特異標(biāo)記開發(fā)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[10] LEMESH V A，MOZGOVA G V，GRUSHETSKAYA Z E，et al. The use of specific DNA markers for the identification of alleles of the FAD3 genes in rape（Brassica napus L.）].[J]. Russian Journal of Genetics，2015，51（8）：895-904.

[11] 朱立煌，呂啟明，黃志遠(yuǎn)，等.抗稻瘟病基因Pi9的特異性CAPS標(biāo)記Pi9caps及其應(yīng)用[P].中國(guó)專利：CN104630364A，2015.

[12] 華麗霞，汪文娟，陳 深，等.抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2015，29（3）：305-310.

[13] 徐華山，周 雷，劉 凱，等.水稻抗稻瘟病基因Pi35基因內(nèi)特異SNP共顯性分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（21）：20-21.

[14] 蔡海亞，周 雷，閘雯俊，等.水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用[J].分子植物育種，2015（7）：1457-1461.

[15] 唐立群，肖層林，王偉平.SNP分子標(biāo)記的研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（12）：154-158.

[16] IYER-PASCUZZI A S，MCCOUCH S R. Functional markers for xa5 -mediated resistance in rice（Oryza sativa L.）[J].Molecular Breeding，2007，19（4）：291-296.

[17] 楊廣闊，陳子強(qiáng)，陳在杰，等.基于二代測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)以93-11為親本的水稻SNP-dCAPS標(biāo)記的研究實(shí)例[J].分子植物育種，2014（6）：1288-1295.

[18] ABDURAKHMONOV I Y，ABDUKARIMOV A. Application of association mapping to understanding the genetic diversity of plant germplasm resources[J].International Journal of Plant Genomics，2008：574927.

[19] KUSHANOV F N，PEPPER A E，YU J Z，et al. Development，genetic mapping and QTL association of cotton PHYA，PHYB，and HY5-specific CAPS and dCAPS markers[J].BMC Genetics，2016，17：141.

[20] 王彩芬，劉冬成，馬曉玲，等.水稻耐鹽基因SKC1特異性CAPS標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證[J].分子植物育種，2015，13（11）：2437-2440.

[21] 徐薪惟，李景富，姜景彬，等.番茄抗枯萎病I-2基因的SNP分型[J].植物保護(hù)，2012，38（6）：22-26.

[22] 周 雷，蔡海亞，戴鳳美，等.水稻稻瘟病抗性基因Pi25功能性SNP分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用[J].分子植物育種，2016（10）：2680-2685.

[23] 王 柯，章金濤，運(yùn)玉霞，等.PCR-CTPP：一種基于錯(cuò)配技術(shù)的SNP分型方法的改良[J].遺傳，2011，33（2）：182-188.

[24] 劉 勇，王 珍，朱 紅，等.兩步法PCR-CTPP技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性研究中的應(yīng)用[J].山西醫(yī)藥雜志，2007，36（5）：391-393.

[25] YIN G，MITSUDA Y，EZAKI T， et al. A New PCR Method：One primer amplification of PCR-CTPP products[J].Molecular Biotechnology，2012，52（2）：180-183.

[26] 靳 哲，張揚(yáng)勇，方智遠(yuǎn)，等.結(jié)球甘藍(lán)BoCBF1與BoCBF2基因的CAPS標(biāo)記及其對(duì)耐寒性的影響[J].中國(guó)蔬菜，2012（14）：23-30.

[27] 聶京濤，李曉丹，姚永康，等.用于黃瓜白粉病抗性鑒定的InDel標(biāo)記[J].中國(guó)蔬菜，2015（9）：26-30.

[28] 楊 潔，赫 佳，王丹碧，等.InDel標(biāo)記的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].生物多樣性，2016，24（2）：237-243.

[29] LI X，GAO W，GUO H，et al. Development of EST-based SNP and InDel markers and their utilization in tetraploid cotton genetic mapping[J].Bmc Genomics，2014，15（1）：1-11.

[30] 李昌明，旦 巴.分子標(biāo)記在黃籽油菜育種中的應(yīng)用進(jìn)展[J].西藏科技，2014（11）：3-5.

[31] JIN J Q，YAO M Z，MA C L，et al. Association mapping of caffeine content with TCS1 in tea plant and its related species[J].Plant Physiology & Biochemistry，2016，105：251-259.

[32] 張圣平，苗 晗，程周超，等.黃瓜果實(shí)苦味（Bt）基因的插入缺失（Indel）標(biāo)記[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（4）：649-653.

[33] 張成才，王麗鴛，韋 康，等.基于茶樹EST-SNP的CAPS標(biāo)記開發(fā)[J].分子植物育種，2013（6）：817-824.

[34] LV H H，YANG L M，KANG J G，et al. Development of InDel markers linked to Fusarium wilt resistance in cabbage[J].Molecular Breeding，2013，32（4）：961-967.

[35] ZHOU L，VEGA F E，TAN H，et al. Developing single nucleotide polymorphism （SNP） markers for the identification of coffee germplasm[J].Tropical Plant Biology，2016，9：1-14.

[36] 朱東旭，王彥華，趙建軍，等.結(jié)球甘藍(lán)相對(duì)于大白菜連鎖群特異InDel標(biāo)記的建立及應(yīng)用[J].園藝學(xué)報(bào)，2014，41（8）：1699-1706.

[37] 郭廣君，孫 茜，劉金兵，等.基于辣椒基因組重測(cè)序的InDel標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（6）：1400-1406.

[38] 郭大龍，李 猛，張國(guó)海，等.葡萄SNP標(biāo)記的CAPS和TSP分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（11）：2307-2315.

[39] 劉 峰，謝玲玲，弭寶彬，等.辣椒轉(zhuǎn)錄組SNP挖掘及多態(tài)性分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2014，41（2）：343-348.

[40] 趙軍勝，陳 瑩，高明偉，等.陸地棉HB紅花性狀特異SCAR分子標(biāo)記的開發(fā)[J].植物生理學(xué)報(bào)，2012（6）：565-570.

[41] 趙婷婷，宋寧寧，姜景彬，等.番茄抗葉霉病基因Cf12的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（5）：985-991.

[42] 李 丹，袁成國(guó)，吳海彬，等.普通小麥品種農(nóng)大399抗白粉病基因SSR和AFLP-SCAR分子標(biāo)記[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（1）：104-108.

[43] 趙會(huì)彥，肖 麓，趙 志，等.青海大黃油菜粒色性狀分子標(biāo)記的開發(fā)和圖譜整合[J].作物學(xué)報(bào)，2014，40（6）：965-972.

[44] ANDERSEN J R，L？譈BBERSTEDT T. Functional markers in plants[J].Trends in Plant Science，2003，8（11）：554-560.

[45] 樂(lè)素菊，劉鵬飛，曾慕衡，等.超甜玉米bt2基因SNP位點(diǎn)的分析及分子標(biāo)記輔助篩選[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012（11）：73-78.

[46] 王 俊.枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）SNP位點(diǎn)篩選及遺傳多樣性分析[D].重慶：西南大學(xué)，2013.

[47] 譚振華.水稻白條紋葉基因OsPPR3的圖位克隆及功能分析[D].長(zhǎng)沙：湖南大學(xué)，2012.

[48] VOGEL J P，GARVIN D F，MOCKLER T C，et al. Genome sequencing and analysis of the model grass Brachypodium distachyon[J].Nature，2010，463（7282）：763-768.

[49] MA D，YAN J，HE Z，et al. Characterization of a cell wall invertase gene TaCwi-A1，on common wheat chromosome 2A and development of functional markers[J].Molecular Breeding，2012，29（1）：43-52.

[50] BARCHI L，LANTERI S，PORTIS E，et al. Identification of SNP and SSR markers in eggplant using RAD tag sequencing[J].Bmc Genomics，2011，12（1）：93-98.

[51] JEGADEESAN S，YU K，WOODROW L，et al. Molecular analysis of glycinin genes in soybean mutants for development of gene-specific markers[J].Theoretical & Applied Genetics，2012， 124（2）：365-72.

[52] 王昊龍，韓俊杰，李淼淼，等.功能標(biāo)記的開發(fā)及在禾谷類作物中的應(yīng)用[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，28（11）：1963-1971.