席斌　陳效威　高雅琴

摘要：研究建立了肉制品中亞麻酸的氣相色譜檢測(cè)方法，樣品經(jīng)氫氧化鉀-甲醇溶液甲酯化后用GC法分析，通過(guò)比對(duì)亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜，其保留時(shí)間為26.212 min，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，建立的牛肉中亞麻酸的分析方法在0.01～10.00 mg/mL線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 95，日內(nèi)、日間精密度范圍分別為0.73%～1.08%和0.75%～1.01%，均小于15%，回收率為83.3%～95.79%，說(shuō)明該方法靈敏度好、準(zhǔn)確度高、線性好，可用于測(cè)定牛肉中的亞麻酸含量。

關(guān)鍵詞：氣相色譜法（GC）；牛肉；亞麻酸；亞麻酸甲酯

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）09-0097-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.09.023

Determination of Linolenate in Beefs-Gas Chromatographic Method

XI Bin，CHEN Xiao-wei，GAO Ya-qin，LI Wei-hong，GUO Tian-fen，DU Tian-qing，YANG Xiao-ling

（Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Pharmaceutical Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Quality Safety Risk Assessment of Animal Products （Lanzhou），Ministry of Agriculture/Quality Supervising，Inspection and Testing Center for Animal Fiber，F(xiàn)ur，Leather and Products，Ministry of Agriculture，Lanzhou 730050，China）

Abstract： Linolenate was extracted with Isooctane from beefs，and methylified with KOH-CH3OH solution. Then content of methyl linolenate，which could be translated to the content of linolenate，was quantified with gas chromatographic. The retention time for methyl linolenate was 26.212 min. This method was appicable in a linear range of 0.01～10.00 mg/mL with the correlation coefficient at 0.999 95. The relative standard deviation（RSD） of intra-day and inter-day were 0.73%～1.08% and 0.75%～1.01%，which were less than 15%. The recovery rate was 83.3%～95.79%. The method gave high sensitivity，wide linearity，and specificity，which is suitable for determination of linolenate in beef.

Key words： gas chromatographic； beef； linolenate； methyl linolenate

脂肪酸含量及組成是評(píng)定營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一[1，2]，人體必需脂肪酸只有兩種，亞麻酸名列首位。亞麻酸作為人體必需不飽和脂肪酸，在醫(yī)藥、保健、食品市場(chǎng)需求量巨大。當(dāng)人體攝入亞麻酸后，在酶的作用下，經(jīng)過(guò)肝臟代謝生成EPA和DHA[3-5]。EPA和DHA對(duì)促進(jìn)胎兒和嬰幼兒的大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育有不可替代的作用，此外，亞麻酸還具有降血壓、降血脂、抑制過(guò)敏反應(yīng)、抗血栓、抗癌以及對(duì)視覺(jué)功能和學(xué)習(xí)行為活動(dòng)的促進(jìn)作用等功效，是一種營(yíng)養(yǎng)性和功能性極高的食用油脂[6-8]。

人們通過(guò)食物中獲取亞麻酸的主要途徑有兩種：一是植物源性的，如核桃、花生等干果；二是動(dòng)物源性的，如含有豐富的亞麻酸代謝物的深海魚(yú)類(lèi)等肉制品[9-12]，但是深海魚(yú)類(lèi)資源貧乏且價(jià)格昂貴。

20世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)外才開(kāi)始認(rèn)知并接受亞麻酸的功能性營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并逐漸開(kāi)始進(jìn)行研究。中國(guó)在2002年以后才逐步認(rèn)識(shí)到亞麻酸對(duì)人體健康的重要性[13-16]。目前，對(duì)亞麻酸的研究主要集中在植物油脂中的脂肪酸，對(duì)動(dòng)物中尤其是西北牛種肉制品中功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)亞麻酸的研究較少，尤其是肉制品中氣相色譜法（Gas chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)GC）直接用于肉制品中亞麻酸的檢測(cè)并不多見(jiàn)。因此，本研究運(yùn)用GC法對(duì)西北內(nèi)陸地區(qū)牛肉中的亞麻酸進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在建立牛肉等肉制品中亞麻酸的氣相色譜分析方法，為以后攝取分析亞麻酸提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）；甲醇（色譜純，Bcl international trading ltd.co）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市百世化工有限公司）；乙醚（洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（60～90 ℃，分析純，天津市百世化工有限公司）；異辛烷（色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）；一水合硫酸氫鈉（分析純，天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，萊陽(yáng)市雙雙化工有限公司）；氫氧化鉀（分析純，天津市百世化工有限公司）。

Agilent 7890A氣相色譜儀（配有FID檢測(cè)器）（Agilent公司）；BUCHI Mixer B-400均質(zhì)儀（BUCHI Labortechnik AG 9320 Flawil/Switzerland）；AB-105電子天平（Mettler Toledo Group）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

牛肉樣品分別采于甘肅省康樂(lè)牛肉市場(chǎng)、蘭州市柏樹(shù)巷牛羊肉市場(chǎng)、平?jīng)雠Ｈ馐袌?chǎng)和平?jīng)黾茵B(yǎng)牛肉。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent J&W; 123-3233 （30 m×320 μm，0.5 μm）。載氣為氮?dú)?；檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為260 ℃。氫氣30 mL/min；空氣300 mL/min；進(jìn)樣量2 μL，流速1.3 mL/min，平均速率20.806 cm/s。升溫程序：起始溫度150 ℃，保持運(yùn)行2 min；4 ℃/min 到210 ℃，保持運(yùn)行8 min；5 ℃/min 到220 ℃，保持運(yùn)行5 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精確稱(chēng)取亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg，異辛烷定容到10 mL容量瓶中，得到10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 樣品的制備 稱(chēng)取牛肉試樣2.00 g，置于100 mL試管內(nèi)，加8 mL水，混合均勻后加10 mL鹽酸，將大試管和內(nèi)容物置于60 ℃水浴中加熱40～50 min。每隔5～10 min用玻璃棒攪拌一次，至試樣消化完全。加入10 mL乙醇，混合均勻，冷卻至室溫加入25 mL乙醚，劇烈振蕩1 min，再加入25 mL石油醚，振搖2 min，靜置分層，將有機(jī)溶劑層轉(zhuǎn)移到50 mL試管中，于60 ℃下將有機(jī)溶劑蒸干，保留脂肪[17-19]。

1.2.4 氫氧化鉀-甲醇溶液的配制 稱(chēng)取13.1 g氫氧化鉀，溶于約80 mL甲醇中。冷卻至室溫，用甲醇定容至100 mL，加入5 g事先處理好的無(wú)水硫酸鈉，充分?jǐn)嚢韬筮^(guò)濾，保留濾液，備用。

1.2.5 亞麻酸甲酯的制備 稱(chēng)取60.00 mg（精確到0.01 mg）經(jīng)“1.2.3”方法提取的脂肪，置于10 mL具塞試管中，依次加入4 mL異辛烷、0.2 mL氫氧化鉀-甲醇溶液（2 mol/L），塞緊試管塞，劇烈振蕩2 min，至試管內(nèi)混合溶液澄清。加入1 g一水合硫酸氫鈉，劇烈振蕩1 min，靜置，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 通過(guò)亞麻酸甲酯色譜峰的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的峰面積比較定量，按下述公式計(jì)算得出：

X=■

式中，X為試樣中亞麻酸的含量，mg/g；C為樣品中亞麻酸甲酯的含量，mg/mL；V為待測(cè)樣品最終定容體積，mL；m為稱(chēng)樣量，g；D為稀釋因子。根據(jù)亞麻酸甲酯的含量直接得出亞麻酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC的定性與分離

采用“1.2.1”的色譜柱和色譜條件，對(duì)牛肉中的亞麻酸具有良好的分離效果，采用保留時(shí)間比對(duì)法確定亞麻酸甲酯的峰位置。由圖1可見(jiàn)，亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為26.212 min。

2.2 線性范圍

分別配制0.01、0.05、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/mL的亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述試驗(yàn)條件進(jìn)樣，對(duì)亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的GC吸收峰面積（Y）與待測(cè)樣品中濃度（X）進(jìn)行線性回歸（圖2）。由圖2可知，在濃度為0.01～10.00 mg/mL時(shí)，亞麻酸甲酯的色譜吸收峰面積與待測(cè)樣品中亞麻酸甲酯濃度具有良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=1 569.200 07X+20.203 23，R2=0.999 95。

2.3 精密度

配制0.10、0.50和1.00 mg/mL 3個(gè)濃度的亞麻酸甲酯樣品溶液按“1.2.3”和“1.2.4”方法操作，每個(gè)樣品在同1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得日內(nèi)精密度；將每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定3 d，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得日間精密度。方法精密度和準(zhǔn)確度的結(jié)果如表1所示。在本試驗(yàn)中0.10、0.50和1.00 mg/mL三個(gè)不同濃度的日內(nèi)、日間精密范圍分別為0.73%～1.08%和0.75%～1.01%，均小于15%，表明本試驗(yàn)所建立的方法重復(fù)性良好，符合樣品的檢測(cè)要求。

2.4 回收率

本試驗(yàn)中亞麻酸甲酯在牛肉中的回收率通過(guò)“1.2.3”和“1.2.4”的方法進(jìn)行處理，0.10、0.50和1.00 mg/mL 3個(gè)不同濃度每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，以測(cè)定亞麻酸甲酯的濃度與加入的標(biāo)準(zhǔn)品濃度的比值計(jì)算回收率。

按照回收率測(cè)定方法，本試驗(yàn)中0.10、0.50和1.00 mg/mL 3個(gè)不同濃度亞麻酸甲酯在牛肉中的回收率在83.33%～95.79%（表2），其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%～0.91%，均小于1.12%，適合分析方法學(xué)的需要。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

12種牛肉樣品中亞麻酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，家養(yǎng)牛肉中亞麻酸的含量明顯高于市賣(mài)牛肉，不同地區(qū)的牛肉中亞麻酸含量具有一定的差異，表明不同的飼糧以及飼養(yǎng)條件影響肉制品脂肪酸含量。

3 小結(jié)

亞麻酸作為人體必需不飽和脂肪酸，在醫(yī)藥、保健、食品市場(chǎng)需求量巨大。但亞麻酸迄今不能人工合成，只能依賴(lài)于有限的自然資源[19]。然而α-亞麻酸動(dòng)植物自然資源因?yàn)楹繂?wèn)題無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)高純度α-亞麻酸原料的需求。雖然通過(guò)一些工藝方法可以提純?chǔ)?亞麻酸，但因成本、金屬殘留等客觀條件，限制了其推廣和應(yīng)用。

通過(guò)運(yùn)用建立的肉制品中亞麻酸的GC檢測(cè)方法得到的色譜圖可以看出，亞麻酸甲酯的峰形對(duì)稱(chēng)，處理后的樣品雜質(zhì)成分少，該方法靈敏度好、準(zhǔn)確度高、線性好以及分離度好，說(shuō)明本研究建立的試驗(yàn)方法和色譜條件適合肉制品中亞麻酸的分析檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李玉琪，朱永詳，陶寧萍，等.氣相色譜法測(cè)定不同水域刀鱭肉中脂肪酸含量[J].食品工業(yè)科技，2014，35（20）：57-65.

[2] 馬 聘，梁 琪，文鵬程，等.歲齡對(duì)甘南牦牛肉中脂肪酸與氨基酸含量的影響[J].食品工業(yè)科技，2015，36（19）：361-365.

[3] FATEMI S H，HAMMOND E G.Analysis of oleate，linoleate and linolenate hydroperoxides in oxidized ester mixtures[J].Lipids，1980，15（5）：379-385.

[4] 吳俏槿，杜 冰，蔡尤林，等.α-亞麻酸的生理功能及開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（10）：386-390.

[5] 岳巧云，張 靜，劉恭源，等.氣相色譜法測(cè)定干果中的α-亞麻酸[J].食品科學(xué)，2009，30（24）：359-361.

[6] 徐永群，王巍偉.亞麻油中主要組分的定量分析法[J].黃岡師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22（6）：50-52.

[7] CONG Y，SU Z，ZOU W，et al. GC determination content of seven fatty acid hydrophobic group in ween-80[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2011，31（4）：651-654.

[8] 黃 芳，朱萍萍.亞麻油對(duì)子代小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（19）：3504-3506.

[9] 孟 甜.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定胡麻油中α-亞麻酸的含量[J].食品安全導(dǎo)刊，2017（15）：153-154.

[10] 張春華，孫海洲，趙存發(fā)，等.氣相色譜法測(cè)定動(dòng)物肉中脂肪酸組成[J].畜牧與飼料科學(xué)，2012，33（7）：4-7.

[11] 楊成對(duì)，宋莉暉.亞麻油中脂肪酸的氣相色譜質(zhì)譜分析[C].中國(guó)化學(xué)會(huì)第七屆全國(guó)儀器分析及樣品預(yù)處理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[A].北京：中國(guó)化學(xué)會(huì)，2013.

[12] 鮑忠定，秦志榮，顧秀英，等.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定食品中反式脂肪酸[J].食品工業(yè)科技，2005，26（3）：176-177.

[13] 李麗萍，韓 濤.富含α-亞麻酸植物資源的開(kāi)發(fā)與利用[J].食品科學(xué)，2007，28（11）：614-618.

[14] 高大文.α-亞麻酸的藥用價(jià)值及研究概況[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47（31）：28.

[15] 武彥文，李冰寧，汪 雨，等.氣相色譜法測(cè)定食品中反式脂肪酸的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015（9）：3329-3334.

[16] 倪冉熹.α-亞麻酸的提取分離技術(shù)研究進(jìn)展[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2017（13）：76.

[17] GB/T 22110-2008，食品中反式脂肪酸的測(cè)定 氣相色譜法[S].

[18] 曹 君，李 靜，覃 雯，等.氣相色譜法測(cè)定奶茶中的反式脂肪酸[J].食品科學(xué)，2011，32（18）：159-163.

[19] 邱鵬程，王四旺，王劍波，等.α-亞麻酸的資源研究及其應(yīng)用前景[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)藥，2010，21（3）：760-762.