周林宗，徐文博，楊申明*

(1.楚雄師范學(xué)院 地理科學(xué)與旅游管理學(xué)院，云南 楚雄 675000；2.楚雄師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

毛頭鬼傘(Copyinds comatus)別名毛鬼傘、雞腿蘑、刺蘑菇，它屬鬼傘科(Coprinaceae)、鬼傘屬(Coprinus)，是一種分布較廣的食用菌，它屬大型真菌[1]。在我國(guó)各省區(qū)均有種植，菇體白色，單生或叢生，未開傘前狀如雞腿，又稱其為"刺蘑菇"，它的子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、維生素和微量元素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[2-3]。但目前對(duì)毛頭鬼傘多糖的提取及抗氧化性的研究報(bào)道相對(duì)較少，本研究采用微波輔助法從毛頭鬼傘中提取多糖，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取毛頭鬼傘菇多糖的提取條件，并就所提取的毛頭鬼傘多糖對(duì)1,1-苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基和羥基自由基的清除作用進(jìn)行初步研究，以期為毛頭鬼傘多糖的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

毛頭鬼傘，采于云南省楚雄市，經(jīng)鑒定為鬼傘屬鬼傘科毛頭鬼傘(Copyinds comatus)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，其他所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)，G80F23CN3P-Q5型微波爐，CP214C型電子天平，HH-2型恒溫水浴鍋，SHZ-ⅢA型循環(huán)水式真空泵，202-00型電執(zhí)鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 供試材料的處理

將新鮮的毛頭鬼傘用超純水洗凈、切片風(fēng)干后，放入55 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，得毛頭鬼傘干粉。再將毛頭鬼傘干粉用濾紙包好放入索氏提取中，加入石油醚(沸程30～60 ℃)冷浸36 h，然后將其置于水浴中回流提取，直到除去樣品中脂溶性色素后，取出樣品風(fēng)干至石油醚全部揮發(fā)，再將毛頭鬼傘干粉放入55 ℃烘箱中烘干，得去除色素的毛頭鬼傘干粉，備用。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，參考文獻(xiàn)[4]的方法，采用苯酚濃硫酸法測(cè)定毛頭鬼傘多糖的含量。所得線性回歸方程A=38.17274C-0.0013，相關(guān)系數(shù)R=0.9994。結(jié)果表明吸光度與葡萄糖質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系，因此，可用于毛頭鬼傘多糖含量測(cè)定。

多糖提取率(%)=C×N×V/M×100%

式中：C為根據(jù)回歸方程計(jì)算出的多糖濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為去除色素的毛頭鬼傘樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1料液比對(duì)毛頭鬼傘多糖提取率影響

準(zhǔn)確稱取5份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘粉末樣品，分別置于100 mL錐形瓶中，加20、30、40、50、60 mL蒸餾水，將樣品置于微波爐中，在600W功率下處理60 s。提取完畢后冷卻抽濾。將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，再精確移取溶液10 mL于50 mL容量瓶中定容。移取0.10 mL試液于10 mL比色管中，加1 mL 5%苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸邊加邊振蕩，放置10 min；在40℃水浴中顯色20 s，放置10min冷卻，在490 nm波長(zhǎng)處，以試劑空白作參比測(cè)定吸光度，計(jì)算提取率。

1.2.3.2微波功率對(duì)毛頭鬼傘多糖提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘粉末樣品，分別置于100 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，將樣品置于微波爐中，分別在200、400、600、800、1000 W功率下處理60 s。其他操作同1.2.3.1節(jié)，計(jì)算提取率。

1.2.3.3微波輻射時(shí)間對(duì)毛頭鬼傘多糖的提取影響

準(zhǔn)確稱取5份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘粉末樣品，分別置100 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，將樣品置于微波爐中，在600 W功率下分別處理20、30、40、50、60 s。其他操作同1.2.3.1節(jié)，計(jì)算提取率。

1.2.4 加樣回收率測(cè)定

取1.0 mL已測(cè)得毛頭鬼傘多糖提取率的樣品溶液，分別加入質(zhì)量濃度為0.1000 mg/mL葡萄糖對(duì)照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。

1.2.5 毛頭鬼傘多糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取3份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘樣品，在料液比1∶40(g/mL)、微波功率600 W下分別提取60 s。其他操作同1.2.3.1節(jié)，計(jì)算平均提取率。

1.2.6 毛頭鬼傘多糖抗氧化性的測(cè)定

將微波輔助提取得到的毛頭鬼傘多糖溶液分別配制成0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/mL 5種質(zhì)量濃度，研究其抗氧化性。

1.2.6.1清除DPPH·能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[5]的方法測(cè)定毛頭鬼傘多糖溶液對(duì)DPPH·的清除能力。毛頭鬼傘多糖對(duì)DPPH·清除率計(jì)算公式為：

式中：Ac為不加毛頭鬼傘多糖溶液空白對(duì)照的吸光度；Ai為DPPH溶液加毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度；Ab為無水乙醇加毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度。

1.2.6.2清除·OH能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]的方法測(cè)定毛頭鬼傘多糖對(duì)·OH的清除能力。毛頭鬼傘多糖對(duì)·OH清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為毛頭鬼傘多糖溶液的空白對(duì)照溶液的吸光度；AX為加過氧化氫毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度；AX0為不加過氧化氫毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)毛頭鬼傘多糖提取影響

在微波功率600 W，微波時(shí)間60 s的條件下，考察料液比對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，料液比為1∶20～1∶40(g/mL)時(shí)，毛頭鬼傘多糖提取率隨提取溶劑用量的增大而增大，當(dāng)液料比增大到1∶40(g/mL)時(shí)，提取率達(dá)到最大為5.39 %；之后隨提取溶劑用量的繼續(xù)增大，毛頭鬼傘多糖提取率下降。這可能是溶劑用量影響有效成分浸出溶液的濃度差，從而影響原料內(nèi)部與外部之間提取成分的傳質(zhì)過程。在液料比較小時(shí)，短時(shí)間內(nèi)多糖的溶出就達(dá)到平衡，不利于多糖的進(jìn)一步溶出，但液料比太大受溶解度的作用變小，且溶劑用量過多導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)困難，而底物濃度過低使得提取得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[7]。因此，確定適宜的料液比為1∶40(g/mL)。

圖1 液料比對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

2.1.2 微波功率對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

在料液比1∶40(g/mL)，微波時(shí)間60 s的條件下，考察微波功率對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，微波功率為200～600 W時(shí)，毛頭鬼傘多糖提取率隨微波功率的增大而增大，當(dāng)微波功率增大到600 W時(shí)，提取率達(dá)到最大為5.37%；之后隨微波功率的繼續(xù)增大，毛頭鬼傘多糖提取率下降。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是當(dāng)微波時(shí)間一定時(shí)，微波功率升高，物料吸收的微波熱能隨之增加，有效促進(jìn)植物細(xì)胞的破碎，溶出物質(zhì)增加；當(dāng)微波功率增加達(dá)到一定水平后，會(huì)引起多糖降解，多糖提取率反而減小[8]。因此，確定適宜的微波功率600 W。

圖2 微波功率對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

在料液比1∶40(g/mL)，微波功率600 W的條件下，考察微波時(shí)間對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)微波時(shí)間為40～60min時(shí)，毛頭鬼傘多糖的提取率隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)微波時(shí)間延長(zhǎng)到60min時(shí)，提取率達(dá)到最大為5.41 %；之后隨微波提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，毛頭鬼傘多糖的提取率逐漸減小。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是在較短的時(shí)間內(nèi)微波對(duì)毛頭鬼傘細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破壞作用大，導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)大量溶出，提取率顯著提高；另一方面隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中其他雜質(zhì)的溶出增加，使得多糖得率下降[9]。因此，確定適宜的微波提取時(shí)間60min。

圖3 微波時(shí)間對(duì)毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

2.2 多糖平均提取率及回收率的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所確定的提取工藝條件對(duì)毛頭鬼傘中的多糖進(jìn)行提取，并對(duì)其平均提取率及回收率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果毛頭鬼傘多糖的平均提取率為5.40%，平均加樣回收率為98.76%，RSD值為0.73%，表明本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)毛頭鬼傘多糖提取率測(cè)量的準(zhǔn)確度較高。

2.3 毛頭鬼傘多糖對(duì)DPPH·和·OH的清除作用

毛頭鬼傘多糖對(duì)DPPH·和·OH的清除作用如表1所示?？梢?，毛頭鬼傘多糖對(duì)DPPH·和·OH都有清除作用，且清除能力隨著毛頭鬼傘多糖質(zhì)量濃度的增大而清除能力增大，即清除率與毛頭鬼傘多糖質(zhì)量濃度間存在一定量效關(guān)系。

表1 毛頭鬼傘多糖對(duì)DPPH·和·OH的清除作用

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助提取毛頭鬼傘多糖，通過因素實(shí)驗(yàn)得到微波輔助提取毛頭鬼傘多糖的條件為料液比1∶40(g/mL)，微波功率600 W，微波時(shí)間60 s，在該條件下測(cè)得毛頭鬼傘多糖的平均提取率為5.40%，加樣回收率為98.76%，RSD值為0.73%。該提取方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、回收率高，是一種較為理想的提取毛頭鬼傘多糖的方法，可為毛頭鬼傘多糖的提取提供依據(jù)。

本研究從清除DPPH·和·OH的能力2個(gè)方面測(cè)定了毛頭鬼傘多糖的抗氧化性。試驗(yàn)結(jié)果表明，毛頭鬼傘多糖對(duì)DPPH·和·OH具有較強(qiáng)的清除作用，在多糖質(zhì)量濃度為0.0040～0.020 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)DPPH·和·OH的清除率分別達(dá)到76.28%和54.24%，說明所提取的毛頭鬼傘多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性。毛頭鬼傘多糖有望開發(fā)成天然抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)，為毛頭鬼傘多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，毛頭鬼傘多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，相關(guān)研究結(jié)果對(duì)毛頭鬼傘多糖的提取及抗氧化活性成分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。但由于本研究?jī)H對(duì)微波輔助提取的毛頭鬼傘多糖進(jìn)行抗氧化性測(cè)定，而采用微波輔助提取是否會(huì)影響毛頭鬼傘多糖多糖生物活性尚未知曉，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中可對(duì)不同提取方法與活性之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究。