劉炳楠，熊利平，姜申德，要少波

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 PET/CT影像診斷科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 血液內(nèi)科，天津 300052；3.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100730)

1955年，Marrian成功從孕婦尿液中分離得到一種雌激素化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)表征后確定是16-表雌三醇[1]，表雌三醇是在Marrian和Doisy從孕婦尿液中分離得的雌三醇后的又一種雌激素[2-3]。在隨后的數(shù)十年中，又有許多種雌激素被發(fā)現(xiàn)并確定結(jié)構(gòu)，例如16α-羥基雌酚酮[4]、16β-羥基雌酚酮和16-羰基-17β雌二醇[5-6]、18-羥基雌酚酮[7]等。16-表雌三醇具有甾體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，屬于糖皮質(zhì)激素，其主要臨床應(yīng)用是制備抗炎藥物[8-10]；并且，除了糖皮質(zhì)激素作用以外，16-表雌三醇還是正電子斷層顯像(positron emission tomography, PET)研究中放射性探針18F-FES(18F-16α-fluoro-17β-estradiol)的合成前體[11]，18F-FES在PET臨床研究中主要用于特異性結(jié)合原發(fā)和繼發(fā)乳腺癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的雌激素受體水平，能夠早期精準(zhǔn)診斷乳腺癌[12-14]。因此在臨床中，表雌三醇的用處很多。

迄今為止，16-表雌三醇主要通過化學(xué)合成，已知的表雌三醇合成方法主要有：在Huffman報(bào)道的合成路線中，以雌酚酮為起始原料經(jīng)過5步反應(yīng)，包括16-肟基衍生物制備、酯化反應(yīng)、還原水解肟基和乙烯醇的氫化還原[15]，這條合成路線較低的收率限制了表雌三醇的大規(guī)模生產(chǎn)；1957年，在Biggerstaff報(bào)道的合成路線中，主要包括四醋酸鉛氧化和氫化鋰鋁還原反應(yīng)[16]，該路線用到了重金屬鉛化合物，對環(huán)境污染較大，還用到了易燃易爆的試劑氫化鋰鋁，該路線不適合大規(guī)模生產(chǎn)；1983年，Numazawa報(bào)道了另外一條合成路線，包括溴代反應(yīng)、醇酮重排和PdCl2催化還原[17]，該路線中用到的單質(zhì)溴容易揮發(fā)，對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，對環(huán)境尤其是空氣污染較大，并且還用到了價(jià)格昂貴的鈀試劑。

本研究報(bào)道了兩條以雌酚酮為起始原料合成16-表雌三醇的簡便合成路線，主要包括乙?；?、選擇性保護(hù)、脫保護(hù)、氧化還原和重排等反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和、收率較高、所用試劑成本低，適合放大生產(chǎn)。同時(shí)，在對16-表雌三醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，完成了18F-FES的放射性標(biāo)記和注射液的質(zhì)量控制，經(jīng)檢測，制備的18F-FES注射液滿足臨床要求。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

電磁攪拌器：德國IKA；熔點(diǎn)測定儀：奧地利Reichert-Thermovar；1H NMR譜數(shù)值測定儀Viarian INOVA(400 MHz或500 MHz)：德國Bruker公司，使用四甲基(δ=0.00)作為內(nèi)標(biāo)，偶合常數(shù)用Hz作為單位，峰形分別記為s(singlet)、d(doublet)、t(triplet)、br(broad)和m(multiplet)；快速硅膠柱色譜：300～400目柱層析硅膠；薄層層析色譜檢測鋁板(Kieselgel 60 F254)：德國Merck公司，通過UV和高錳酸鉀氧化顯色；Cyclone RDS111加速器：德國Siemens公司；PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模塊：北京派特科技有限公司；Waters HPLC工作系統(tǒng)：美國Waters公司。

1.2 主要試劑

18-冠-6(18-Crown-6)、無水乙腈(MeCN，99.9%)、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)：美國Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、石油醚(60-90)、乙醇、二氯甲烷、醋酐、吡啶、醋酸、四氫呋喃、硼氫化鉀、氫氧化鈉、高氯酸：天津江天化工；標(biāo)準(zhǔn)品19F-FES：德國ABX公司；Sep-Pak light QMA柱和Sep-Pak plus C18柱：美國Waters公司。QMA柱的預(yù)處理(活化)依次用NaHCO3(8.4%水溶液)和注射用水沖洗；C18柱的預(yù)處理(活化)依次用乙醇和注射用水沖洗。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 16-表雌三醇的合成路線1

2.1.1烯醇二醋酸酯2的合成

對雌酚酮的雙乙?；襟E參照文獻(xiàn)[18]，合成路線示于圖1，將雌酚酮(13.50 g，50 mmol)溶解于醋酸異丙烯酯(120 mL，1.1 mol)，并加入對甲苯磺酸(4.05 g，23.5 mmol)，攪拌下加熱回流3.5 h。將反應(yīng)溶液冷卻，減壓旋干溶劑，向反應(yīng)瓶中加入乙酸乙酯300 mL將殘余物溶解，依次用冷的5%碳酸氫鈉和水洗，并用無水硫酸鈉干燥，將有機(jī)溶劑旋干后即得到類白色固體，用乙酸乙酯重結(jié)晶得到白色固體12.5 g，收率73%，熔點(diǎn)147～149 ℃，文獻(xiàn)149～150 ℃[18]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.94(s,3H,18-CH3),2.20(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),5.54(d,1H,J=1.3 Hz,16α-H),6.82-7.28(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.2環(huán)氧化物3的合成

將化合物2 (6.40 g，18 mmol)、70%間氯過氧苯甲酸(8.90 g，36 mmol)溶解在170 mL二氯甲烷中，置于室溫?cái)嚢? h，反應(yīng)完畢使用5%碳酸氫鈉和水洗，并用無水硫酸鈉干燥并將溶液蒸干后得到類白色固體，在乙酸乙酯中重結(jié)晶得到白色固體4.35 g，收率65%，熔點(diǎn)148～151 ℃，文獻(xiàn)150～152 ℃[18]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.95(s,3H,18-CH3),2.13(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),3.94(s,1H,16β-H),6.81-7.28(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.3雌三醇4的合成

向含有5.83 g環(huán)氧化物3的乙醇溶液116 mL，并緩慢加入硼氫化鉀(1.20 g，22.2 mmol)和氫氧化鉀(5.03 g，89 mmol)的24 mL水溶液，將混合溶液置于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，減壓旋蒸除去大部分乙醇，并加入50 mL 5%稀鹽酸溶液，并用80 mL乙酸乙酯萃取3次，將乙酸乙酯溶液合并后用無水硫酸鈉干燥并旋干得到固體，并用乙酸乙酯重結(jié)晶得到白色固體即為雌三醇3.63 g，收率80%，熔點(diǎn)275～280 ℃，文獻(xiàn)279～284 ℃[19]。1H NMR(400 MHz,MeSO-d6)δ,0.67(s,3H,18-CH3),3.79-3.88(m,1H,16α-OH),4.59(d,1H,J=5.1 Hz,17α-H),4.66(d,1H,J=4.8 Hz,16β-H),6.43-7.04(m,3H,aromatic),7.96(s,1H,17β-H),8.97(s,1H,3-OH)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1 16-表雌三醇的合成路線1Fig.1 The first synthetic route of 16-epiestriol

2.1.416α-叔丁基二甲基硅基雌三醇5的合成

選擇性保護(hù)16α-羥基的實(shí)驗(yàn)步驟參考已發(fā)表文獻(xiàn)方法[19-20]，將雌三醇(2.00 g，6.9 mmol)和咪唑(1.10 g，16.6 mmol)溶于36 mL DMF中，冷卻至-40 ℃攪拌下逐滴加入溶有叔丁基二甲基氯硅烷(2.30 g，15.3 mmol)的10 mL DMF溶液，加畢在此溫度下攪拌反應(yīng)1.5 h，隨后將反應(yīng)溶液倒入冰水中靜置過夜，抽濾并收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于50 mL乙酸乙酯中，乙酸乙酯溶液用水洗并用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得到灰白色固體，用快速硅膠柱色譜分離得到白色固體2.2 g，收率79%，熔點(diǎn)192～195 ℃，文獻(xiàn)194 ℃[20]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.11(d,6H,J=2.1 Hz,-Si(CH3)2),0.81(s,3H,18-CH3),0.94(s,9H, -SiC(CH3)3),2.83(d,1H,J=3.8 Hz,17β-OH),3.59(d,1H,J=4.8 Hz,17α-H),4.09-4.13(m,1H,16β-H),4.59(s,1H,3-OH),6.58-7.17(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.53,17β-二乙酰-16α-叔丁基二甲基硅基雌三醇6

將化合物5(4.09 g，10.2 mmol)溶于16.1 mL吡啶和8 mL醋酐中，置于室溫?cái)嚢柽^夜，將溶液倒入冰水中待沉淀充分析出過濾，將沉淀溶于100 mL乙酸乙酯中依次用水洗和無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后使用快速硅膠柱分離得到白色固體4.7 g，收率95%，熔點(diǎn)108～110 ℃，文獻(xiàn)110～112 ℃[19]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.05(d,6H,J=5.6 Hz, -Si(CH3)2),0.80(s,3H,18-CH3),0.90(s,9H,-SiC(CH3)3),2.11(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),4.30-4.33(m,1H,16β-H),4.86(d,1H,J=5.6 Hz,17α-H),6.81-7.28(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.63,17β-二乙?；?16α-雌三醇7

選擇性脫除硅保護(hù)基過程參照文獻(xiàn)報(bào)道[19,21]，將化合物6溶解于141 mL醋酸-四氫呋喃-水(3∶1∶1)溶液中，室溫?cái)嚢?4 h，加入200 mL乙酸乙酯并用碳酸氫鈉洗和無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干后得到類白色固體，通過快速硅膠柱色譜分離得到白色固體1.58 g，收率92%，熔點(diǎn)136～138 ℃，文獻(xiàn)132 ℃[20]和140 ℃[19]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.88(s,3H,18-CH3),2.17(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),3.73(s,1H,16α-OH),4.14-4.19(m,1H,16β-H),4.30(d,1H,J=4.1 Hz,17α-H),6.81-7.29(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.73,17β-二乙?；?16-酮化合物8

氧化反應(yīng)依照經(jīng)典條件進(jìn)行[22]，將化合物7(1.47 g，3.9 mmol)、1.8 g分子篩粉末、PDC(1.9 g，4.9 mmol)[23]加入18 mL二氯甲烷中，逐滴加入醋酸0.3 mL，將反應(yīng)物置于室溫?cái)嚢?.5 h，加入水稀釋并用60 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后減壓蒸干溶劑得到棕色沉淀，使用快速硅膠柱色譜純化得到白色固體1.15 g，收率79%，熔點(diǎn)130～132 ℃，文獻(xiàn)133.5～135.5 ℃[24]。1H NMR(400 MHz CDCl3)δ,0.88(s,3H,18-CH3),2.21(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),5.13-5.15(m,1H,17α-H),6.84-7.31(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.816-表雌三醇9

還原反應(yīng)過程類似于制備雌三醇4的過程，還原反應(yīng)完畢后使用甲醇重結(jié)晶得到白色固體粉末，收率81%，熔點(diǎn)285～287 ℃，文獻(xiàn)281～289 ℃[16]。1H NMR(500 MHz,Me2SO-d6))δ,0.72(s,3H),4.05-4.28(m,1H,17α-H),4.55(br,1H,16α-H),6.42-7.02(m,3H,aromatic),9.00(s,1H,3-OH)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。以雌酚酮為起始原料計(jì)，總收率19%。

2.2 16-表雌三醇的合成路線2

2.2.1化合物10的合成

合成步驟示于圖2，環(huán)氧化物的開環(huán)反應(yīng)依照文獻(xiàn)中報(bào)道步驟[18]，將化合物3(1.00 g，2.7 mmol)、6.4 mL醋酸和混合酸(醋酸：高氯酸4∶1)混合后置于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，加入100 mL乙酸乙酯并用冷的5%碳酸氫鈉和水洗，無水硫酸鈉干燥后旋干后得到棕紅色油狀物，加入醋酐和吡啶完成乙?；磻?yīng)，結(jié)束后萃取并旋干溶劑，用快速硅膠柱色譜分離，得到化合物10 0.89 g，收率89%，熔點(diǎn)164～167 ℃，文獻(xiàn)168～171 ℃[16]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,1.01(s,3H,18-CH3),2.14(s,3H,-OCOCH3),2.29(s,3H,-OCOCH3),5.46(d,1H,J=8.8 Hz,16β-H),6.82-7.29(m,3H,aromatic)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2.2化合物8的合成

甾體D環(huán)的開環(huán)反應(yīng)依照參考文獻(xiàn)中方法[18,25-26]，將化合物10(0.89 g，2.4 mmol)溶于26.8 mL甲醇和13.2 mL 5%氫氧化鉀水溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)5 h，將反應(yīng)溶液倒入50 mL 2%稀鹽酸溶液中，并用80 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥并旋干，經(jīng)醋酐和吡啶乙?；笥每焖僦V分離，得到白色固體0.54 g，收率61%。

2.2.3由化合物8制備表雌三醇

該合成步驟同2.1.8中描述，最終得到表雌三醇。以雌酚酮為起始原料計(jì)，總收率22%。

2.3 18F-FES前體合成與標(biāo)記

2.3.1化合物11的合成

合成步驟示于圖3，將化合物9(50 mg，0.14 mmol)，1 mol/L氫氧化鉀水溶液(0.14 mL，0.14 mmol)，10 mL乙腈混合后攪拌反應(yīng)10 min，得到白色的渾濁反應(yīng)體系，旋蒸蒸干溶劑，再加入乙腈10 mL，蒸干，重復(fù)3次，向單口燒瓶中加10 mL乙腈，滴加甲氧基氯甲烷(20 mg，0.16 mmol)，常溫?cái)嚢?2 h，減壓旋干溶劑，加水20 mL，15 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相并用無水硫酸鈉干燥，經(jīng)快速柱色譜純化得到白色的固體中間體。將中間體和硫酰二咪唑溶解于干燥四氫呋喃中，并在冰浴條件下緩慢加入氫化鈉，室溫反應(yīng)2 h后處理并經(jīng)快速柱色譜分離純化，得到白色固體11。1H NMR(CDCl3):7.18(d,J=8.5 Hz,1H,H-1),6.85(dd,J=8.5 Hz,2.5 Hz,1H,H-2),6.79(d,J=2.5 Hz,1H,H-4),5.16(m,overlapping,1H,H-16),5.15(s,2H,OCH2),4.60(d,J=7.5 Hz,1H,H-17),3.48(s,3H,OCH3),2.95-2.84(m,2H),2.50-2.24(m,overlapping,3H),2.14-2.10(m,1H),1.92-1.80(m,2H),1.68-1.54(m,3H),1.02(s,3H,18-CH3)。鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖2 16-表雌三醇的合成路線2Fig.2 The second synthetic route of 16-epiestriol

2.3.218F-FES的放射性標(biāo)記

回旋加速器通過18O(p,n)18F核反應(yīng)生產(chǎn)得到18F離子，經(jīng)過QMA柱俘獲后用18-Crown-6/KHCO3的乙腈-水混合溶液1 mL淋洗到反應(yīng)瓶中；通氮?dú)?100 mL/min)并在116 ℃加熱條件下將液體蒸發(fā)至干燥；加入1.5 mL無水乙腈，通氮?dú)獠⒓訜嶂?16 ℃，使殘留的水和乙腈共沸再次除水；將5 mg前體11的乙腈溶液加入至含有活性[18F]KF/18-Crown-6/KHCO3的反應(yīng)管，在封閉的反應(yīng)管中加熱至100 ℃并保持20 min；鼓氮?dú)鈱⒎磻?yīng)管中的乙腈在80 ℃下蒸干，將0.1 mol/L稀鹽酸溶液加入至反應(yīng)管，加熱至140 ℃保持15 min，再次加熱至80 ℃下鼓氮?dú)獬セ旌先芤褐械囊掖?；使用半制備液相色譜進(jìn)行分離純化，流速為5 mL/min，流動(dòng)相為50%(乙醇/水)，收集產(chǎn)物峰(保留時(shí)間為7 min左右)并加入適量生理鹽水稀釋使乙醇含量小于10%，將含有18F-FES的注射液的通過0.22 μm的無菌濾膜至無菌產(chǎn)品瓶中，18F-FES注射液使用radio-HPLC分析其放化純度，Waters系統(tǒng)分析型HPLC: Waters C18柱，4.6 mm×250 mm;流速:1 mL/min;流動(dòng)相:乙醇∶水=1∶1。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)合成

兩條表雌三醇的合成路線中，以雌酚酮為起始原料，經(jīng)過簡單的反應(yīng)，分別得到19%和22%表雌三醇，各步反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過了熔點(diǎn)和1H NMR譜確定其結(jié)構(gòu)身份。反應(yīng)簡單、收率較高，較適合放大生產(chǎn)。

3.2 放射性標(biāo)記

以化合物11為前體，經(jīng)過兩步簡單的氟化和水解反應(yīng)，產(chǎn)物并經(jīng)過半制備HPLC分離純化即得。18F-FES注射液可在60 min內(nèi)完成制備，注射液為無色澄清透明的溶液，pH為6.5～7.5，放化收率(30±4)%(n=7)，比活度(1.75±0.25) Ci/μmol。注射液經(jīng)過分析型radio-HPLC檢測，保留時(shí)間為11.9 min，放化純度>99%(圖4)，滿足臨床要求，與標(biāo)準(zhǔn)品19F-FES經(jīng)HPLC檢測的紫外譜圖對比保留時(shí)間一致，可確定合成產(chǎn)物為18F-FES。

圖4 18F-FES注射液的radio-HPLC分析Fig.4 Radio-HPLC analysis of 18F-FES injection

3.3 合成中無法進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)步驟

對甾體環(huán)的16α-羥基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和反應(yīng)時(shí)，總結(jié)了幾種不成功的反應(yīng)，具體示于圖5。

3.3.116α-羥基硅保護(hù)基的脫保護(hù)

在脫除化合物6的16α-羥基的叔丁基二甲基硅基保護(hù)基時(shí)，最初嘗試經(jīng)典方法四丁基氟化銨-四氫呋喃系統(tǒng)[20-21,27-29]，發(fā)現(xiàn)并不奏效，即使時(shí)間延長至48 h，仍然沒有發(fā)生反應(yīng)(通過TLC檢測)，與Laurent等[20]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖，因此嘗試了Wu等[19]報(bào)道的方法，使用醋酸四氫呋喃-水的體系，該反應(yīng)在溫和的條件下完成。

3.3.216α-羥基的Mitsunobu反應(yīng)

當(dāng)成功得到化合物7時(shí)，曾想是否可以通過Mitsunobu反應(yīng)[30-31]直接將16α-羥基構(gòu)型轉(zhuǎn)化變?yōu)?6β-羥基，可直接得到表雌三醇。然而在嘗試反應(yīng)過程中，親核試劑分別試過對甲苯磺酸和苯甲酸，攪拌10 h反應(yīng)仍未發(fā)生。

圖5 實(shí)驗(yàn)中無法進(jìn)行的反應(yīng)Fig.5 Representative failed reactions

3.3.316α-羥基的甲磺酰化

對化合物7的16α-羥基嘗試甲磺?；磻?yīng)，可以通過親核氟化反應(yīng)，直接完成標(biāo)記，進(jìn)而得到16β-18F-FES，可以探究16β-18F-FES和18F-FES兩種雌激素結(jié)構(gòu)類似物在體內(nèi)的生物學(xué)活性差異，然而該磺?；磻?yīng)并未進(jìn)行，反應(yīng)過夜仍未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物。

總結(jié)以上三種針對16α-羥基進(jìn)行的反應(yīng)可以看出，由于18位甲基的空間位阻較大，導(dǎo)致針對16α-羥基進(jìn)行的反應(yīng)不容易發(fā)生，也就是不夠活潑，因此不能完成理想反應(yīng)。

4 結(jié)論

本文中以雌酚酮為原料，成功完成兩種表雌三醇的合成路線，收率較高、產(chǎn)率穩(wěn)定，條件溫和，適合放大生產(chǎn)。并以表雌三醇為前體進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，成功制備滿足臨床要求的雌激素受體類PET顯像劑18F-FES，可為臨床使用提供有力支持。