彭非，鄧潔紅，*，劉永紅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410127）

刺葡萄（Vitis davidii Fo?x.），植物學(xué)分類上是東亞種群葡萄屬（Vitis）[1]，果皮為紫色，湖南省西北以及湘南地區(qū)分布廣泛。刺葡萄皮中蘊(yùn)含豐富的花色苷，以錦葵色素為主，是制備花色苷單體的理想原料[2]。在自然條件下，花色苷通常由花色苷配基（花色素）與糖通過(guò)糖苷鍵相結(jié)合，僅有少部分以有機(jī)酸?；男问酱嬖?。酰化反應(yīng)通常發(fā)生在與花色素相連的糖基上的羥基上，如Saito N等[3]從紫羅蘭花中分離出了5種?；ㄉ眨l(fā)現(xiàn)是咖啡酸與其在3位和5位上的葡萄糖發(fā)生的?；?。植物中部分花色苷含?；?，是由于?；D(zhuǎn)移酶的作用，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中累積而成，但天然含?；幕ㄉ諗?shù)量較少。王維茜等[4]在分離純化刺葡萄花色素時(shí)，發(fā)現(xiàn)分離的4種刺葡萄花色苷單體僅有1種具有酰基結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有研究已證明花色苷穩(wěn)定性與其酰基結(jié)構(gòu)存在密切關(guān)系，由于內(nèi)源酰基的輔色作用，單個(gè)花色苷依賴自身芳香?；拇嬖?，加強(qiáng)分子間的鍵合，使花色苷母核免遭水分子的攻擊，進(jìn)而提高其穩(wěn)定性[5]。Cevallos-Casals B A[6]的研究結(jié)果表明，紫甘薯酰化花色苷含量較豐富，因此其穩(wěn)定性要優(yōu)于非酰化的紫玉米花色苷。

花色苷的穩(wěn)定性會(huì)受到溫度的影響，而熱處理是食品加工中的必要步驟，比如濃縮、干燥、滅菌等。因此，提高花色苷自身熱穩(wěn)定性是擴(kuò)大花色苷系列產(chǎn)品應(yīng)用的關(guān)鍵。外源?；囊胧歉纳苹ㄉ辗€(wěn)定性的新思路。利用酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)花色苷糖苷?；翘岣呋ㄉ战Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的新方法。酶法對(duì)催化底物具有良好的專一性和選擇性，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，彌補(bǔ)了化學(xué)法?；瘏^(qū)域選擇性差、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、需要基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)等諸多缺點(diǎn)[7]，而且是不可逆反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，優(yōu)于單純使用有機(jī)酸或酚酸?；o色。

花色苷在保存條件下的含量變化可以反映其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，另外，花色苷呈色與含量也是息息相關(guān)[8]。結(jié)合花色苷的含量變化及測(cè)色指標(biāo)，可以較為全面地反映花色苷的穩(wěn)定特性。如González等[9]通過(guò)色差指標(biāo)探究花色苷自聚反應(yīng)及其輔色素對(duì)新鮮紅葡萄酒顏色的改變。

本文以錦葵啶-3，5-O-雙葡萄糖苷（分子式如圖1所示）單體為原料，對(duì)其進(jìn)行酶促?；磻?yīng)。研究對(duì)比分析酶促?；幚砬昂蠡ㄉ盏臒岱€(wěn)定性及呈色特征，探究外源?；鶎?duì)花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果可為花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化提供借鑒，為刺葡萄花色苷色素的擴(kuò)大應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖1 錦葵啶-3，5-O-雙葡萄糖苷分子式Fig.1 The molecular structure of malvidin-3，5-diglucose

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

刺葡萄：采于湖南省中方縣刺葡萄果園，自來(lái)水淋洗、晾干表面水分后手工剝皮，-24℃冷凍貯藏備用。

1.1.2 試劑

鹽酸、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、甲醇（分析純）、三氟醋酸[trifluoric acetic acid，TFA，（色譜純）]、聚酰胺樹(shù)脂（100目～200目）、分子篩4A型（鈉-A型分子篩）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹(shù)脂HP-20：日本三菱公司；2-甲基四氫呋喃[2-Methyltetrahydrofuran，2-MeTHF，（色譜純）]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸乙烯酯：梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；南極假絲酵母脂肪酶B（candila antarctica，CAL-B 5萬(wàn)U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

AEY-220電子分析天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；SX-4-10型箱式電阻爐：天津市泰斯特儀器有限公司；TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)：日本島津；THZ-92A氣浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；PHSJ-3F pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；層析柱（φ1.6×30 cm，B224/29）：上海達(dá)豐玻璃儀器廠；SMY-2000測(cè)色色差計(jì)：北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司；KQ5200B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 刺葡萄花色苷單體的制備

以刺葡萄皮為原料，以料液比1∶6（g/mL）加入80%乙醇（含0.03%鹽酸）提取，避光浸提24 h，抽濾。濾液于0.1 MPa真空度下40℃條件下濃縮回收乙醇，取色素濃縮液分別經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醚，無(wú)水乙酸乙酯萃取2次，脫除有機(jī)溶劑，真空蒸發(fā)得到花色苷粗提液。

錦葵花色苷的純化：HP-20樹(shù)脂預(yù)處理后濕法裝柱，花色苷粗提液進(jìn)樣至吸附飽和（流出液吸光度值為上樣液的1/10時(shí)。）首先用2BV蒸餾水沖洗，再用酸化乙醇（體積分?jǐn)?shù)80%、含0.05%鹽酸，8BV）洗脫，收集洗脫液于40℃真空濃縮，脫除乙醇。

錦葵花色苷的單體分離：Sephadex LH-20凝膠經(jīng)預(yù)處理后濕法裝柱，脫除乙醇后的洗脫液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)柱上樣，然后用酸化甲醇（體積分?jǐn)?shù)50%、含0.1%的TFA）洗脫，分別收集得到3種色素，真空凍干，結(jié)構(gòu)鑒定后，選取其一錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷（malvidin-3，5-O-diglucoside）為試驗(yàn)單體，純度為99.54%。

1.2.2 酶促?；ㄉ諛悠分苽?/p>

1.2.2.1 有機(jī)溶劑分子篩預(yù)處理

在350℃條件下活化4A分子篩8 h。冷卻后置于干燥器中，添加有機(jī)溶劑2-MeTHF過(guò)夜脫水12 h，取液體部分備用。

1.2.2.2 脂肪酶活性的測(cè)定

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23535-2009《脂肪酶制劑》測(cè)定CAL-B435的活性。測(cè)得CAL-B435的酶活為0.25 U/mg。

1.2.2.3 酶促酰化花色苷制備

準(zhǔn)確稱取錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷單體13.10 mg，吸取肉桂酸乙烯酯36 μL，4 mL脫水后2-MeTHF、0.3 g分子篩，加入10 mL帶塞小瓶中，超聲波助溶。將帶篩小瓶置于45℃恒溫振蕩器中，加入80 U脂肪酶（CAL-B）啟動(dòng)反應(yīng)。避光振蕩反應(yīng)2.5 h后中止反應(yīng)。將濾液抽濾后置于0.1 MPa真空度下懸蒸1 h，回收2-MeTHF以及殘留的肉桂酸乙烯酯，備用。

1.2.3 酶促酰化對(duì)錦葵啶葡萄苷熱穩(wěn)定性影響

稱取已制備的酶促錦葵啶花色苷粉末1.25 mg，用pH3.0磷酸鹽緩沖液溶解，稀釋搖勻，定容至25 mL。20℃條件下避光靜置1 h。于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定初始吸光度值A(chǔ)0，然后將樣品分別置于3個(gè)不同溫度（60、80、100℃）的恒溫水浴鍋中，每隔1小時(shí)取樣，用自來(lái)水迅速冷卻至室溫后，在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)t。以未?；腻\葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷單體進(jìn)行對(duì)照。

1.2.4 花色苷保存率值計(jì)算

式中：A0為熱處理前溶液的吸光度；At為熱處理t h后溶液的吸光度。

1.2.5 色差值的測(cè)定

色澤以亮度L*值、紅綠a*值、黃藍(lán)b*值表示。取熱處理后的酶促?；ㄉ杖芤?mL，用測(cè)色色差計(jì)測(cè)定其色澤。記錄L*、a*、b*數(shù)值。以未酰化的花色苷樣品為對(duì)照。

1.2.6 刺葡萄花色苷的測(cè)定

參照鄧潔紅[2]的方法，采用pH示差法測(cè)定花色苷含量。

1.2.7 酶促花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

花色苷的降解動(dòng)力學(xué)反應(yīng)基本上符合零級(jí)或一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[10]?；ㄉ杖芤旱奈舛扰c濃度成正比例關(guān)系，，得到花色苷含量的變化與處理時(shí)間的關(guān)系為：

1.2.7.1 花色苷半衰期

花色苷半衰期公式如下：

式中：t為熱處理時(shí)間，h；A0為熱處理前溶液的吸光度；At為熱處理t h后溶液的吸光度；k為反應(yīng)速率常數(shù)；Ct為花色苷初始濃度；C0為花色苷最終濃度。

1.2.7.2 活化能Ea

Arrhenius證明熱降解反應(yīng)速率常數(shù)與反應(yīng)溫度T之間存在聯(lián)系?；罨蹺a計(jì)算公式如下：

建立得到花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)模型：

式中：K0為頻率常數(shù)，對(duì)于指定的反應(yīng)，A與反應(yīng)物的濃度和溫度無(wú)關(guān)；R為氣體常數(shù)，8.314×10-3kJ/（mol·K）；Ea為活化能，kJ/mol；T 為絕對(duì)溫度，K；k 為反應(yīng)速率常數(shù)。

1.2.7.3 溫度系數(shù)Q10

溫度系數(shù)Q10，表示溫度每升高10℃，反應(yīng)速率變化的量比，見(jiàn)公式：

式中：Q10為溫度系數(shù)；k1、k2為分別為當(dāng)溫度為T1、T2時(shí)的反應(yīng)速率；T1、T2為熱處理前、后的溫度，℃。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)設(shè)置2次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析（差異顯著性水平設(shè)置為 p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷溶液熱穩(wěn)定性的影響

酶促?；幚韺?duì)錦葵啶葡萄糖苷保存率的影響如圖2所示。

圖2 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of enzymatic acylation on the thermal stability of malvidin glucoside

由圖2可見(jiàn)，無(wú)論是酰化還是未?；臉悠罚ㄉ毡４媛孰S著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，但酶促酰化樣品下降較為遲緩。經(jīng)過(guò)CAL-B酶促酰化后的錦葵啶葡萄糖苷溶液，在加熱條件為60、80、100℃的處理過(guò)程中，花色苷保存率顯著高于酶處理前（p＜0.05）。100℃熱處理5 h，其花色苷保留率為37%，而未酰化樣品僅為20%，這表明在加熱條件下，酶促?；瑰\葵花色苷單體的熱穩(wěn)定顯著提高，提高了花色苷單體的熱穩(wěn)定性。

表1 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table1 Effects of enzymatic acylation on the thermal degradation kinetics parameters of malvidin glucoside

2.2 酶促?；瘜?duì)刺葡萄花色苷單體熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1 酶促?；\葵啶葡萄糖苷單體熱降解動(dòng)力學(xué)特征及熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

分別用錦葵啶刺葡萄花色苷單體以及酶促?；\葵啶刺葡萄花色苷單體樣品，以-ln（Ct/C0）為縱坐標(biāo)，熱處理時(shí)間t為橫坐標(biāo)作圖線性回歸得到相關(guān)系數(shù)R2，兩者一級(jí)反應(yīng)模型下的相關(guān)系數(shù)均R2＞0.97，錦葵啶葡萄糖苷及其酶促酰化產(chǎn)物熱降解規(guī)律線性關(guān)系良好，符合熱降解動(dòng)力學(xué)特征。酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響見(jiàn)表1。

由表1可知，酶促?；幚礤\葵啶刺葡萄花色苷單體前后兩者一級(jí)降解常數(shù)k數(shù)值均隨著溫度的升高均增大；半衰期t1/2隨著熱處理溫度升高急劇下降，符合花色苷一般熱降解規(guī)律。其次，酶促?；軠p少溫度對(duì)花色苷自聚合穩(wěn)定作用的干擾，提高分子內(nèi)輔色效應(yīng)和提高溶液體系的耐熱性。在不同加熱溫度條件下，經(jīng)酶促?；幚淼腻\葵啶刺葡萄花色苷單體k值均小于未經(jīng)處理的花色苷單體；同樣，經(jīng)酶促處理的花色苷單體溶液半衰期時(shí)間也均大于未經(jīng)處理的。當(dāng)處理溫度為60℃時(shí)尤為明顯，經(jīng)過(guò)酶促處理花色苷單體半衰期為8.10 h遠(yuǎn)大于未經(jīng)酶促處理花色苷單體溶液的4.43 h。

3個(gè)溫度（60，80，100℃）熱處理下酶促?；\葵啶葡萄糖苷半衰期比未?；臉悠贩謩e延長(zhǎng)3.67、1.3、0.3 h。最后，在發(fā)生自聚合的花色苷溶液中，Ea（酶促酰化錦葵啶葡萄苷單體溶液）＞Ea（錦葵啶葡萄苷單體溶液），Ea值分別為 70.167 7、68.658 7 kJ/mol。

Q10值反映了樣品熱反應(yīng)速率常數(shù)k值對(duì)溫度升高的敏感程度。當(dāng)加熱溫度從60℃提高至80℃、80℃提高至100℃時(shí)，花色苷的降解速度總體加快。酶促酰化后錦葵啶葡萄糖苷的Q10值相比未?；瘶悠飞源螅f(shuō)明酶促?；幚砟芴岣呋ㄉ赵谔囟訜釡囟认碌臒岱€(wěn)定性，但對(duì)鈍化其對(duì)加熱溫度變化的敏感性沒(méi)有明顯作用。

2.2.2 錦葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)方程的建立

根據(jù)表1的參數(shù)建立酶促前后錦葵啶葡萄糖苷自聚合熱降解動(dòng)力學(xué)方程，即錦葵啶葡萄糖苷及酶促?；a(chǎn)物熱降解動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型見(jiàn)表2。

表2 錦葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)方程式Table2 Thermal degradation kinetic equations of malvidin glucoside

2.3 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷加熱條件下色差的影響

多數(shù)研究只對(duì)分子修飾后的花色苷的最大吸光度值進(jìn)行檢測(cè)。要全面了解花色苷的熱穩(wěn)定特性，對(duì)其呈色變化進(jìn)行分析非常必要。研究選取80℃熱處理的樣品，進(jìn)行色差指標(biāo)的檢測(cè)，對(duì)比分析酶促酰化對(duì)錦葵啶葡萄糖苷呈色的影響。

2.3.1 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷加熱條件下亮度L*的影響

80℃熱處理5 h內(nèi)，錦葵啶葡萄糖苷樣品的亮度L*值如圖3所示。

圖3 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷樣品亮度L*的影響Fig.3 Effects of enzymatic acylation on L*of malvidin glucoside samples

由圖3可知，在熱處理?xiàng)l件下，酶促酰化前后的錦葵啶葡萄糖苷L*變化略有不同，但基本呈現(xiàn)相同規(guī)律。即隨著熱處理時(shí)間延長(zhǎng)，亮度增加，花色苷顏色變淡。這與熱處理花色苷單體變化的規(guī)律結(jié)果相同，花色苷含量與L*值呈負(fù)相關(guān)性。其中，酶促?；岣呋ㄉ諉误w穩(wěn)定性，錦葵啶刺葡萄花色苷單體亮度L*變化率（29.3%）遠(yuǎn)大于酶促?；幚淼幕ㄉ諉误w（22.3%）。

2.3.2 酶促酰化對(duì)錦葵啶葡萄糖苷酶熱處理?xiàng)l件下紅綠色調(diào)a*的影響

80℃熱處理5 h內(nèi)，錦葵啶葡萄糖苷樣品的紅-綠色調(diào)a*值如圖4所示。

圖4 酶促?；幚韺?duì)錦葵啶葡萄糖苷樣品a*的影響Fig.4 Effects of enzymatic acylation on a*of malvidin glucoside samples

由圖4可知，隨著熱處理時(shí)間延長(zhǎng)，錦葵啶花色苷a*變化規(guī)律與L*相反，即隨著熱處理時(shí)間延長(zhǎng)，a*值降低，花色苷紅色色調(diào)變淡。但經(jīng)酶促?；胪庠歹；鶊F(tuán)后，?；\葵啶花色苷a*值增加到19.02（未?；\葵啶花色苷a*值為17.21），與糖苷化與?；茉鰪?qiáng)花色苷紅色色調(diào)研究結(jié)論相符[11]。并且，經(jīng)酶促?；蟮腻\葵啶葡萄糖苷熱穩(wěn)定性更好。雖然a*值均隨著時(shí)間增長(zhǎng)而減少，與未經(jīng)酶促酰化的錦葵啶葡萄糖苷相比，變化幅度較小，下降速率更慢。

2.3.3 酶促?；瘜?duì)錦葵啶葡萄糖苷熱處理?xiàng)l件下黃藍(lán)色調(diào)b*的影響

80℃熱處理5 h內(nèi)，錦葵啶葡萄糖苷樣品的黃-藍(lán)色調(diào)b*值如圖5所示。

圖5 酶促?；幚韺?duì)錦葵啶葡萄糖苷樣品b*的影響Fig.5 Effect of enzymatic acylation on b*of malvidin glucoside samples

由圖5可知，隨著熱處理時(shí)間延長(zhǎng)，錦葵啶葡萄糖苷以及經(jīng)過(guò)酶促酰化葡萄糖苷溶液b*值變化均呈上升趨勢(shì)，藍(lán)色色調(diào)減弱，黃色色調(diào)增加，總體變化量酶促?；笤嚇诱w變化量b*（3.22）小于?；霸嚇幼兓縝*（4.80）；其次，經(jīng)酶促?；箦\葵啶葡萄糖苷b*值由（-2.57）變化到（-1.89），藍(lán)色色調(diào)增加。

3 討論

?；昂箦\葵啶葡萄糖苷熱降解反應(yīng)仍符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，與文獻(xiàn)報(bào)道的黑莓汁、桑葚等中的花色苷熱降解規(guī)律相一致[12-13]。無(wú)論是?；€是未?；幕ㄉ眨S著加熱溫度升高，花色苷溶液的穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)，降解速率加快。有研究解釋說(shuō)明花色苷發(fā)生熱降解失色，是由于花色苷母核結(jié)構(gòu)受溫度影響，水解變成甲醇假堿形式，花色苷結(jié)構(gòu)平衡被打破轉(zhuǎn)化成無(wú)色查爾酮結(jié)構(gòu)[14-15]。研究表明，花色苷含量與a*值呈正相關(guān)性，與L*值呈負(fù)相關(guān)性，所以加熱條件下花色苷樣品的呈色指標(biāo)發(fā)生相應(yīng)變化，本文研究與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論相符[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，酶促?；岣吡隋\葵啶葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性，可能是引入的外源?；鶊F(tuán)能降低花色苷分子的極性，而且由自身立體構(gòu)型產(chǎn)生阻礙作用，降低花色苷對(duì)親核攻擊的敏感度。

4 結(jié)論

錦葵啶葡萄糖苷以及酶促?；a(chǎn)物在熱處理?xiàng)l件下，降解規(guī)律均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，但酶促?；磻?yīng)提高了錦葵啶葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性。在中等溫度條件下，?；\葵啶葡萄糖苷自聚合效應(yīng)使其耐熱性提高，但長(zhǎng)時(shí)間處于高溫條件下，花色苷仍易分解。但酶促酰化處理延長(zhǎng)花色苷的半衰期，且?；瘶悠坊罨蹺a（70.167 7 kJ/mol）大于未酰化樣品Ea（68.658 7 kJ/mol）；但高溫處理?xiàng)l件下，酶促?；档突ㄉ諏?duì)溫度變化敏感度較未?；\葵啶葡萄糖苷不明顯。熱處理后錦葵啶葡萄糖苷受熱分解，花色苷含量降低，亮度L*值升高，a*值降低，b*值上升，經(jīng)酶促?；幚砗蟮幕ㄉ諉误w總體色差變化幅度較小。