李 遜，魏慧梅，王 琴，余 蓉，鄭永祥

(四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

多糖是生物體內(nèi)一類重要的大分子物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，特別在抗腫瘤、抗病毒、抗感染和抗氧化等方面具有良好的活性[1]。糖肽是多糖類物質(zhì)的糖基和蛋白或多肽鏈的氨基共價(jià)鍵相連而形成的化合物。多糖類物質(zhì)的生理作用與其結(jié)構(gòu)中某些官能團(tuán)或糖苷鍵的構(gòu)型有關(guān)[2]，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)引入某些基團(tuán)，如多糖硫酸酯化、乙?；蚣谆冉Y(jié)構(gòu)修飾均能夠顯著增加或增強(qiáng)多糖的生物活性[3]。多糖的修飾研究為新藥研發(fā)提供了新思路，并為研究多糖類物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系提供理論依據(jù)。

十二指腸糖肽由多種蛋白酶水解，豬的十二指腸黏蛋白后再提取制得，再經(jīng)硫酸酯化反應(yīng)得到硫酸糖肽，硫酸糖肽被證實(shí)具有刺激碳酸氫鹽分泌、減少胃黏膜腐蝕、促進(jìn)黏膜生長(zhǎng)因子生成以及影響細(xì)胞循環(huán)、調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的藥理作用[4-5]，因此，可作為抑制胃蛋白酶活性和胃黏膜潰瘍的強(qiáng)保護(hù)劑，從而治療胃、十二指腸潰瘍和胃炎。張革[6]以氯磺酸為磺化劑，糖肽溶于吡啶進(jìn)行硫酸酯化，產(chǎn)物的硫含量達(dá)14.8%，該方法采用的溶劑吡啶溶解度高但毒性強(qiáng)，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)對(duì)環(huán)境不友好，并存在一定安全問(wèn)題。多糖修飾常用的溶劑有二甲基亞砜、苯類、吡啶、甲酰胺和二甲基甲酰胺等。其中，甲酰胺具有低毒、環(huán)保和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，越發(fā)受到多糖修飾研究的青睞，常用的酯化劑有氯磺酸、三氧化硫、發(fā)煙硫酸和氨基磺酸等[7]。

本研究中，筆者旨在確立一種環(huán)保、經(jīng)濟(jì)且條件易控制的十二指腸糖肽硫酸酯化方法。選用甲酰胺為溶劑，對(duì)比氯磺酸和氨基磺酸2種酯化劑的酯化效率，對(duì)氨基磺酸法進(jìn)行了工藝優(yōu)化，用瓊脂糖電泳和紅外光譜分析對(duì)產(chǎn)物加以鑒定，以期為促進(jìn)腸糖肽的修飾研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十二指腸糖肽(CR)，Sigma公司；氨基磺酸、氯磺酸(AR)，成都市科龍化工試劑廠；甲酰胺(AR)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖(BR)，BIOWEST公司；肝素鈉(BR)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；巴比妥鈉、甲苯胺藍(lán)、溴酚藍(lán)、十六烷基三甲基溴化銨(BR)，BIOSHARP公司。

1.2 主要儀器

FA2004型電子天平，HANGPING公司；GD65-1型鼓風(fēng)干燥箱，北京市朝陽(yáng)區(qū)來(lái)廣營(yíng)醫(yī)療器械；8302型恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHB-3型循環(huán)水真空泵，鄭州杜甫儀器廠；81-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器廠；VECTOR 22型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，Bruker公司；PYCP-31C型電泳槽、DYY-Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 酯化劑篩選

1)溶解：將十二指腸糖肽在60 ℃水浴中溶解于甲酰胺，用磁力攪拌器攪拌至糖肽完全融化，成均一液體。

2)磺化反應(yīng)：在冰鹽浴中，用分液漏斗將氯磺酸緩慢滴入甲酰胺中成混酸溶液，溫度控制在20～30 ℃。在冰鹽浴中將混酸溶液用分液漏斗緩慢滴入溶液，控制溫度在40 ℃以下，或加入稱量好的氨基磺酸固體。氯磺酸法需向燒瓶中充入氬氣(Ar)保護(hù)，在60 ℃水浴中反應(yīng)6 h。

3)終止反應(yīng)：向反應(yīng)體系中加入NaOH調(diào)pH至7，混勻的同時(shí)加入4倍體積的乙醇，4 ℃條件下靜置。

4)分級(jí)醇沉：將靜置后的混合液用G-3漏斗過(guò)濾，收集沉淀置于50 ℃干燥箱。用10倍蒸餾水溶解，調(diào)pH至7，再加4倍體積乙醇，4 ℃沉淀6 h以上，離心分離沉淀。重復(fù)3次。

5)氧化除氨：將干燥后的沉淀加約10倍水溶解，再加總體積5%的H2O2，氧化3 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的NaCl固體，用NaOH調(diào)pH至10，加少量Na2CO3，維持pH 10。在60 ℃水浴條件下攪拌除NH3。用濕潤(rùn)試紙檢測(cè)除氨效果。

6)沉淀：待濾紙不變色，加入乙醇，使最終體積分?jǐn)?shù)為70%。4 ℃靜置3 h后抽濾，收集沉淀，加入9倍質(zhì)量的水和0.7倍質(zhì)量的NaCl固體，調(diào)pH至6～7。加入乙醇，使得終體積分?jǐn)?shù)為75%。

7)洗滌干燥：抽濾，收集沉淀，加3倍乙醇攪拌0.5 h，浸泡3 h后抽濾，收集沉淀，50 ℃烘干。

圖1 酯化反應(yīng)流程Fig.1 The esterification reaction process

1.4 磺化產(chǎn)物硫含量計(jì)算

S=m(BaSO4)/m(硫酸糖肽)×0.137 3×100%

(1)

式中：m(BaSO4)為BaSO4的質(zhì)量；m(硫酸糖肽)為硫酸糖肽的質(zhì)量；0.137 3為硫磺的原子量與BaSO4的分子量之百分比。

1.5 氨基磺酸-甲酰胺法工藝單因素分析

采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響氨基磺酸-甲酰胺法硫酸酯化工藝的幾項(xiàng)因素進(jìn)行研究，以產(chǎn)物硫含量為衡量指標(biāo)，考察糖肽和磺化劑之質(zhì)量比(1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8和1∶ 10)、糖肽和甲酰胺的料液比(1∶ 5、1∶ 7、 1∶ 9、 1∶ 11和1∶ 13 g/L)、酯化時(shí)間(4、5、6、7和8 h)和酯化溫度(50、60、70、80 和 90 ℃)對(duì)工藝的影響。

1.6 四因素四水平正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響氨基磺酸法酯化效果的4個(gè)因素確定了合理范圍，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素四水平的正交試驗(yàn)，以分析多重影響因素作用下的最佳工藝條件。

1.7 硫酸酯化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

電極緩沖液：0.05 mol/L 巴比妥鈉-鹽酸緩沖液，pH 8.0；染色液：0.01%甲苯丙胺藍(lán)溶液；指示劑：0.1%溴酚藍(lán)溶液；0.1%十六烷基三甲基溴化銨溶液(CTAB)；肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)液、樣品溶液均為10 mg/mL。

以巴比妥鈉-鹽酸緩沖液為溶劑，配制質(zhì)量比1.0%的瓊脂糖凝膠，加熱制膠[8]。各取8 μL樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和溴酚藍(lán)指示劑在負(fù)極上樣。在10 V/cm電壓下開(kāi)始電泳，電泳結(jié)束后將凝膠在CTAB溶液中固定2 h，取出用濾紙吸干凝膠表面的水分，最后將凝膠置于染色液染色10 min，用蒸餾水脫色過(guò)夜。脫色后利用軟件Visioncapt計(jì)算各樣品遷移率。

1.8 紅外光譜對(duì)比分析

稱取十二指腸糖肽原料和氨基磺酸法硫酸酯化產(chǎn)物各2 mg，分別與150 mg干燥的KBr混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻然后壓片，在500～4 000 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描紅外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 酯化劑篩選結(jié)果

以甲酰胺為溶劑，在反應(yīng)溫度60 ℃、酯化時(shí)間6 h及糖肽與甲酰胺的料液比分別為1∶ 7、1∶ 8和1∶ 9 g/L條件下，進(jìn)行了3組平行實(shí)驗(yàn)，分別以氯磺酸和氨基磺酸為磺化劑的磺化效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 氯磺酸法與氨基磺酸法對(duì)硫酸酯化產(chǎn)物 硫含量的影響Fig.2 Effects of chlorosulfonic acid and sulfamic acid on sulfur content of sulfate esterification product

由圖2可知：在60 ℃、反應(yīng)6 h條件下，氯磺酸法酯化產(chǎn)物的S含量高于20%，氨基磺酸法產(chǎn)物的S含量最高為14.72%，均高于文獻(xiàn)報(bào)道中的同類糖肽其他酯化方法[6,9]，可見(jiàn)甲酰胺作為溶劑較吡啶等能夠提高多糖類物質(zhì)硫酸酯化效率，且環(huán)保低毒。

雖然在該工藝條件下氨基磺酸法磺化率略低，但相比于氯磺酸合成硫酸酯化糖肽，前者反應(yīng)過(guò)程更加溫和，無(wú)需緩慢滴加酸液，磺化產(chǎn)物外觀性狀更好(顏色淺且粉末質(zhì)地均勻)，隨著甲酰胺溶劑增加和其他反應(yīng)條件的優(yōu)化，磺化率有望進(jìn)一步提高。

綜上，考慮到環(huán)保、經(jīng)濟(jì)等因素，認(rèn)為氨基磺酸-甲酰胺法更具研究潛力，繼而進(jìn)行了工藝的優(yōu)化。

2.2 氨基磺酸法單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 氨基磺酸用量對(duì)酯化效果的影響

磺化劑用量是硫酸酯化反應(yīng)產(chǎn)物酯化率的重要因素之一，一般而言，磺化劑與底物質(zhì)量比越高，產(chǎn)物磺化反應(yīng)越充分，但過(guò)量磺化劑導(dǎo)致體系酸性過(guò)強(qiáng)，糖肽原料分解，造成產(chǎn)物S含量降低。在糖肽和甲酰胺的料液比1∶ 10(g/L)、反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h的條件下，考察糖肽和磺化劑質(zhì)量之比(1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8和1∶ 10)對(duì)酯化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：磺化產(chǎn)物中的S含量隨磺化劑用量增大而升高，在糖肽和磺化劑之質(zhì)量比為1∶ 6時(shí)最高，為14.13%。故糖肽和磺化劑之質(zhì)量比最適比例為1∶ 8左右。

圖3 氨基磺酸用量對(duì)酯化效果的影響Fig.3 Effect of mass ratio of glycopeptide to sulfamateon sulfation rates

2.2.2 甲酰胺用量對(duì)酯化效果的影響

甲酰胺用量決定了糖肽分子在溶劑中的溶解程度，甲酰胺體積越大，底物溶解越充分。在糖肽和氨基磺酸質(zhì)量比為1∶ 8、反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h的條件下，考察糖肽和甲酰胺的料液比(1∶ 5、1∶ 7、1∶ 9、1∶ 11和1∶ 13 g/L)對(duì)酯化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：當(dāng)糖肽和甲酰胺的料液比小于1∶ 11時(shí)，磺化產(chǎn)物中的S含量隨甲酰胺用量增加而升高顯著，而當(dāng)糖肽和甲酰胺的料液比增加至1∶ 11后，磺化產(chǎn)物中的S含量增加不明顯；糖肽和甲酰胺的料液比低于1∶ 7時(shí)，這時(shí)糖肽無(wú)法完全溶解，固-液相反應(yīng)導(dǎo)致糖肽和磺化劑分子間不能充分接觸，故磺化產(chǎn)物中的S含量低，考慮到工藝中對(duì)溶劑后處理和成本因素，故糖肽和甲酰胺料液比的最適比例為1∶ 10。

圖4 甲酰胺用量對(duì)酯化效果的影響Fig.4 Effect of mass ratio of glycopeptide mass to formamide volume on sulfation rates

2.2.3 酯化時(shí)間對(duì)酯化效果的影響

反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，酯化反應(yīng)程度越充分，過(guò)度延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間則導(dǎo)致硫酸酯化產(chǎn)物降解和副反應(yīng)的發(fā)生。在糖肽和氨基磺酸質(zhì)量之比1∶ 8、糖肽和甲酰胺的料液比1∶ 10(g/L)、反應(yīng)溫度70 ℃的條件下，考察酯化時(shí)間(4、5、6、7和8 h)對(duì)酯化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知：酯化時(shí)間對(duì)酯化產(chǎn)物中的S含量影響較大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間低于5 h時(shí)，由于反應(yīng)不充分，所以產(chǎn)物中的S含量較低；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物中的S含量隨之增加，在7 h左右達(dá)到最高，磺化產(chǎn)物中的S含量達(dá)14.14%；當(dāng)酯化時(shí)間超過(guò)7 h后，產(chǎn)物中的S含量降低至14.01%，這可能是因?yàn)榛腔a(chǎn)物發(fā)生降解或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致副反應(yīng)發(fā)生。因此，最適酯化反應(yīng)時(shí)間為6 h左右。

圖5 酯化時(shí)間對(duì)酯化效果的影響Fig.5 Effect of reaction time on sulfation rates

圖6 酯化反應(yīng)溫度對(duì)酯化效果的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on sulfationrates

2.2.4 酯化溫度對(duì)酯化效果的影響

反應(yīng)溫度也是影響酯化反應(yīng)的重要因素，高溫有助于反應(yīng)更充分，但溫度過(guò)高會(huì)造成底物和產(chǎn)物的分解。在糖肽和氨基磺酸質(zhì)量比為1∶ 8、糖肽和甲酰胺的料液比為1∶ 10(g/L)、反應(yīng)時(shí)間6 h的條件下，考察酯化溫度(50、60、70、80 和 90 ℃)對(duì)酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知:酯化產(chǎn)物中的S含量隨著反應(yīng)溫度增加而增加，從8.31%提升至14.22%，但在酯化溫度達(dá)到70 ℃后，增加不明顯?？紤]到高溫不易控制耗能大、避免糖肽糖肽發(fā)生降解，故選定最適酯化溫度為80 ℃。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件范圍是糖肽和磺化劑的質(zhì)量比為1∶ 8、糖肽和甲酰胺的料液比為1∶ 10 g/L、酯化時(shí)間7 h、酯化溫度80 ℃，以此設(shè)計(jì)了四因素四水平正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，相關(guān)分析見(jiàn)表2。

表1 L16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 直觀分析表

由表1和表2可知：氨基磺酸-甲酰胺法工藝效果的影響因素從強(qiáng)到弱為氨基磺酸量>酯化時(shí)間>酯化溫度>甲酰胺量，最佳工藝條件為A3B4C1D3，即溫度80 ℃、時(shí)間7 h、糖肽和甲酰胺的料液比1∶ 7、糖肽和氨基磺酸質(zhì)量比1∶ 5。在此優(yōu)勢(shì)條件綜合影響下，氨基磺酸-甲酰胺法磺化產(chǎn)物的S含量可提升至20%以上，與氯磺酸磺化效果相當(dāng)。

2.4 瓊脂糖電泳鑒定

對(duì)酯化產(chǎn)物利用瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖7。以整個(gè)泳道長(zhǎng)度為基準(zhǔn)1，肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(lane 4)作為對(duì)照。由圖7可知，雖然瓊脂糖凝膠濃度、上樣量等因素均會(huì)對(duì)電泳結(jié)果影響，但相對(duì)遷移率穩(wěn)定，可作為參考指標(biāo)考察酯化產(chǎn)物的分子量。

1為腸糖肽原料；2為氯磺酸法酯化產(chǎn)物；3為氨基磺酸法酯化產(chǎn)物；4為肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(1.2×104)圖7 瓊脂糖電泳鑒定糖肽原料和硫酸酯化產(chǎn)物Fig.7 Determination of duodenum glycopeptide and sulfate esterification product by agarose electrophoresis

利用凝膠成像分析軟件Visoncapt計(jì)算不同樣品遷移率，得到腸糖肽原料(lane1)、氯磺酸法酯化產(chǎn)物(lane 2)、氨基磺酸法酯化產(chǎn)物(lane 3)、肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率(lane 4)分別為0.553、0.477、0.478和0.566，根據(jù)遷移率比換算糖肽原料和酯化產(chǎn)物的分子量分別約為1.011×105和1.173×105。酯化產(chǎn)物的遷移率低于腸糖肽原料，可見(jiàn)其分子量增大約6.0×103，證明糖肽分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，糖肽分子醇羥基上的—H發(fā)生磺化反應(yīng)后替換為—SO3H基團(tuán)。

2.5 糖肽及其硫酸酯化產(chǎn)物紅外光譜分析

對(duì)糖肽及其硫酸酯化產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 糖肽及其磺化產(chǎn)物紅外光譜分析Fig.8 Infrared spectra analysis of glycopeptide and its esterification product

3 結(jié)論

致謝:感謝四川德博爾制藥有限公司給予本項(xiàng)研究協(xié)助。