徐堯

1 前言

隨著晚婚晚育政策的推行以及“二胎政策”的放開，生殖健康越來越成為人們關(guān)注的焦點。衰老的卵子會帶來包括流產(chǎn)在內(nèi)的一系列問題，通過對衰老卵子影響因素的研究，我們可以更好地對卵子質(zhì)量進(jìn)行調(diào)控，提高生殖健康能力。

為進(jìn)一步探索與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的年齡的相關(guān)因素，我們在實驗室比較了年輕C57BL/6雌鼠（5周）與45周雌鼠的MII卵母細(xì)胞的mRNA的各個基因表達(dá)量。通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，接近5%的母源物質(zhì)受到了年齡增長的影響。有趣的是，有很多與表觀修飾相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本受到了年齡增長的嚴(yán)重影響，例如DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙?；傅?。

我們的研究是通過比較不同年齡雌鼠的受精胚胎的發(fā)育能力發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的生殖能力出現(xiàn)明顯下降，并出現(xiàn)流產(chǎn)、妊娠率低等現(xiàn)象。該研究通過在體內(nèi)和體外模擬方式明確了乙?；呤锹涯讣?xì)胞衰老造成動物流產(chǎn)、妊娠率低的一個重要原因，并且乙?；纳吒淖兞吮姸嗷虻谋磉_(dá)，從而為人們提高對卵母細(xì)胞衰老認(rèn)識、進(jìn)行胚胎質(zhì)量控制提供重要的證據(jù)。

2 方法

2.1 CD-1雌鼠受精卵的獲取

我們選取了 8～10周齡的CD-1雌鼠獲取受精卵和實驗用卵母細(xì)胞。

2.2體外TSA處理

通過對實驗受體分別做添加去乙?；敢种苿㏕SA，和不加TSA處理，放入胚胎培養(yǎng)箱觀察發(fā)育。囊胚后移植至假孕體內(nèi)觀察體內(nèi)發(fā)育。

2.3 假孕雌鼠的制備

挑選健康8周齡左右性成熟雌性CD-1品系雌鼠，與同品系輸精管結(jié)扎公鼠合籠交配。之后通過檢栓，挑選出假孕雌鼠。

2.4 雌鼠胚胎移植

對雌鼠進(jìn)行全身麻醉后，將要移植的囊胚注入假孕鼠輸卵管膨大部中。

2.5 免疫熒光染色

將要染色的胚胎，按流程進(jìn)行清洗、染色。

2.2.6 PCR檢測

按配方進(jìn)行PCR鑒定。

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 衰老雌鼠生殖能力下降

3.1.1衰老雌鼠受精卵質(zhì)量差

我們選取6周和14個月大的CD-1雌鼠作為研究對象。通過超數(shù)排卵的手段對兩種雌性雌鼠進(jìn)行激素調(diào)節(jié)，隨后在注射完HCG后，將超數(shù)排卵的雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠，利用輸卵管沖洗的辦法取出受精卵。通過在高倍光鏡下檢測，我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的受精卵胞質(zhì)發(fā)黑，并呈顆?；Ｔ摻Y(jié)果說明受精卵的質(zhì)量隨著雌鼠年齡的增長而變差。

3.1.2衰老雌鼠早期胚胎發(fā)育效率低下

我們分別取年輕雌鼠（8周）和衰老雌鼠（14月）的受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察。我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的胚胎發(fā)育率隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多，逐漸下降（圖3-1）。囊胚率約為年輕雌鼠的一半。該結(jié)果表明隨著雌鼠年齡的增長，雌鼠早期胚胎發(fā)育能力下降。

3.1.3衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低并出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)畸形的特點

為了更好地排除衰老個體對胚胎發(fā)育的影響，我們所選取的假孕均為同一周齡，即均為8周雌鼠。我們分別向假孕雌鼠體內(nèi)移植衰老雌鼠胚胎51枚，年輕雌鼠胚胎16枚。在雌鼠孕期19.5dpc的時候，檢測胎兒出生。我們發(fā)現(xiàn)移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有兩個胎兒出生，而移植了年輕雌鼠胚胎的假孕有10只胎兒出生，衰老雌鼠胚胎嚴(yán)重降低了胎兒的出生率及妊娠率。

3.2 高組蛋白乙?；绞撬ダ洗剖笈咛ド钞惓５囊粋€主要原因

3.2.1衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平升高

影響衰老雌鼠胚胎發(fā)育能力低下的因素有很多。我們將研究的重點關(guān)注在基因組的表觀修飾上來。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化和組蛋白乙?；取Ｍㄟ^賴氨酸乙?；拿庖邿晒馊旧?，我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的乙酰化染色的熒光強度極高（圖3-2）。初步證明了衰老雌鼠的乙?；潭仍龈?。

3.2.2增加年輕雌鼠乙?；潭全@得與衰老雌鼠一樣生理表型

我們嘗試在體外培養(yǎng)環(huán)境下，增加年輕雌鼠胚胎的乙?；潭冗M(jìn)行體外模擬實驗。TSA是一種去乙?；敢种苿?，通過向胚胎培養(yǎng)液中添加該試劑，可以顯著提升胚胎的乙?；潭?。隨后，我們通過向同為8周雌鼠的胚胎培養(yǎng)液中添加TSA來增加年輕雌鼠胚胎的乙?；潭?。

通過對到期雌鼠出生個數(shù)的比較，我們發(fā)現(xiàn)TSA處理后的年輕胚胎的雌鼠到期效率和年老雌鼠一致（圖3-3）。實驗結(jié)果說明，乙?；潭壬吆竽贻p雌鼠胚胎獲得了和年老雌鼠胚胎一致的生理表型。

3.2.3 TSA處理的年輕雌鼠胚胎具有和年老雌鼠類似的乙?；潭?/p>

為了確定是否TSA處理后年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠類似，我們通過免疫熒光的手段對胚胎進(jìn)行染色。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TSA處理后的雌鼠胚胎，具有了和年老雌鼠相類似的乙?；潭?。結(jié)果說明，乙?；潭雀淖兪撬ダ洗剖笈咛ベ|(zhì)量變差的一個重要原因。

3.3 乙?；潭雀淖儗?dǎo)致了一些關(guān)鍵性基因表達(dá)量改變

為了探究乙?；潭雀淖?yōu)槭裁磿斐蓜游锪鳟a(chǎn)等現(xiàn)象，我們利用qpcr技術(shù)對年輕、年老、TSA處理的胚胎受精卵進(jìn)行了基因表達(dá)量的鑒定，通過鑒定，我們發(fā)現(xiàn)包括Peg10在內(nèi)的多個對胚胎發(fā)育到期的重要基因的表達(dá)量相對于野生型較高，并存在顯著差異（圖3-4）。因此，乙?；潭雀淖兒苡锌赡苁窃鰪娏硕鄠€關(guān)鍵性基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致基因表達(dá)紊亂，造成了胎兒發(fā)育雌鼠問題與障礙。

4 結(jié)論

1.衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平增高；

2.通過體外模擬發(fā)現(xiàn)乙?；缴呤窃斐伤ダ洗剖笈咛グl(fā)育能力下降的一個主要原因；

3.乙?；潭仍龈撸淖兓虮磉_(dá)水平使得基因表達(dá)紊亂。

5 創(chuàng)新點

1.明確了乙酰化程度升高是雌鼠胚胎質(zhì)量變差的一個主要原因；

2.證明了雌鼠流產(chǎn)問題很可能是乙?；潭雀淖兒笤斐苫虮磉_(dá)量改變；

3.為人類胚胎質(zhì)控提供一個新的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

責(zé)編/萬海濱