張文昶 李遠(yuǎn)冠 黃 深 何 川

(北京航天中心醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100049)

心肌梗死發(fā)病率、致殘率和致死率均較高，心肌細(xì)胞缺血缺氧是心肌梗死過程中引起細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)凋亡或死亡的主要原因，并可導(dǎo)致心功能不全〔1，2〕。細(xì)胞凋亡所引起的心肌細(xì)胞丟失在心肌梗死引起的心力衰竭中具有重要作用〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，生長因子、皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、黃體生成素等多種因子均能誘導(dǎo)補(bǔ)體應(yīng)答基因(RGC)32的表達(dá)，在腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖分化、炎癥反應(yīng)等過程中有關(guān)鍵作用，從而影響人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔4，5〕。作為TGF-β1信號通路下游基因，過表達(dá)RGC32的人近端腎小管上皮細(xì)胞無TGF-β1刺激即可發(fā)生上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而敲除RGC32的細(xì)胞中有TGF-β1刺激也不能發(fā)生EMT〔6〕，此外，有研究發(fā)現(xiàn)在纖維結(jié)締組織形成過程中出現(xiàn)RGC32的表達(dá)上調(diào)〔7〕。但RGC32對心肌梗死心肌細(xì)胞的影響及機(jī)制尚未清楚。本研究旨在探討RGC32基因?qū)π募」Ｋ佬募〖?xì)胞凋亡及免疫機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 12周齡C57BL/6雄性小鼠，25～30 g，用于心肌梗死模型的制備；SPF級出生1～3 d的SD大鼠乳鼠用于原代心肌細(xì)胞的獲得，實(shí)驗(yàn)動物均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，均得到動物委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Piece；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、Notch1、Hes1抗體均購自美國abcam公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3RGC32基因在心肌梗死心肌組織的表達(dá) 參照石洪濤等〔8〕的方法建模，小鼠經(jīng)水合氯醛(3.3%)麻醉固定后，開胸結(jié)扎小鼠冠狀動脈前降支，建立心肌梗死模型，心電圖ST段檢測發(fā)現(xiàn)有明顯提高，且心尖部變白為模型建立成功。取心肌組織，提取組織中的總蛋白，BCA法對蛋白進(jìn)行定量，取30 μg蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后加入一抗，RGC32及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)均按照1∶1 000稀釋，4℃過夜孵育后洗膜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，洗膜，增強(qiáng)型ECL顯影。

1.4心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染及缺血缺氧模型的制備 無菌條件下剔出大鼠的心臟，除去大血管、心房等一些結(jié)締組織，加入已經(jīng)配置好的胰酶對心肌細(xì)胞進(jìn)行消化。消化完全后收集組織消化懸液，離心，棄掉上清，含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照密度5×104/cm2接種細(xì)胞于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，細(xì)胞處于生長對數(shù)期后按照ABI公司的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染RGC32的siRNA于心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后，將培養(yǎng)液換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)罐內(nèi)，并在缺氧罐中放Genbox厭氧產(chǎn)氣包，制造成缺血缺氧模型，最后放置培養(yǎng)罐于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺血缺氧處理48 h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染不具有干擾作用的siRNA并進(jìn)行缺血缺氧處理)、缺血缺氧組、缺血缺氧+RGC32-siRNA組(轉(zhuǎn)染干擾RGC32表達(dá)的siRNA并進(jìn)行缺血缺氧處理)。

1.5TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞凋亡參照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的操作說明。

1.6各組白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)檢測 通過RT-PCR檢測各組細(xì)胞中炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)。通過Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，20 μl反應(yīng)體系，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，所有引物由上海生工合成。采用2-△△Ct比較法根據(jù)Ct均值對RGC32的mRNA相對含量進(jìn)行定量。

1.7各組細(xì)胞RGC32、Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)檢測 各組細(xì)胞中RGC32、Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白的表達(dá)參照1.3方法。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1心肌梗死小鼠心肌組織RGC32的表達(dá) RGC32在心肌梗死心肌組織中的表達(dá)(0.668±0.053)顯著高于正常心肌組織(0.112±0.015，t=17.484，P=0.000)。

2.2RGC32在心肌細(xì)胞表達(dá) 陰性對照組(0.689±0.075)與缺血缺氧組RGC32(0.712±0.079)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.466，P=0.654)，缺血缺氧組顯著高于正常對照組(0.105±0.012)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=12.301，5.411；P=0.000，0.001)。

2.3RGC32對心肌細(xì)胞凋亡的影響 陰性對照組(27.16%±1.88%)和缺血缺氧組心肌細(xì)胞凋亡率(28.39%±2.03%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.975，P=0.358)，缺血缺氧組顯著高于正常對照組(2.48%±0.56%)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(15.65%±1.26%；t=20.530，10.095，均P=0.000)。

2.4RGC32對心肌細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)的影響 陰性對照組和缺血缺氧組IL-6和TNF-α表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.673，0.695，P=0.520，0.507)，缺血缺氧組均顯著高于正常對照組(t=9.213，24.031，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=4.726，7.992，P=0.002，0.000)。見表1。

表1 RGC32對心肌細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

與缺血缺氧組比較：1)P<0.05；下表同

2.5RGC32對心肌細(xì)胞Caspase3、Bax、Notch1、Hes1表達(dá)的影響 陰性對照組和缺血缺氧組Caspase3、Bax、Notch1、Hes1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.312，0.579，0.406，0.380，P=0.763，0.579，0.695，0.714)，缺血缺氧組Caspase3和Bax表達(dá)均顯著高于正常對照組(t=9.505，8.356，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=4.683，3.321，P=0.002，0.011)，Notch1和Hes1表達(dá)顯著低于正常對照組(t=12.158，9.787，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=8.288，4.961，P=0.000，0.001)。見表2。

表2 RGC32對心肌細(xì)胞Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

目前，心肌梗死已成為我國疾病引起死亡的原因之一，心肌細(xì)胞缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌梗死后心力衰竭、心功能不全的一個(gè)關(guān)鍵因素〔9〕。RGC32在細(xì)胞的增殖、分化、再生及炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用，在多種疾病中也備受關(guān)注〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)，在充血性心力衰竭患者進(jìn)行左心室輔助支持裝置植入，心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑過程中RGC32表達(dá)升高，在小鼠心肌肥厚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸舶l(fā)現(xiàn)RGC32的表達(dá)升高〔11，12〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血缺氧可引起心肌細(xì)胞凋亡，而抑制RGC32表達(dá)可減輕這一效應(yīng)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，一方面可維持機(jī)體的正常生長發(fā)育，也參與多種疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡過程中Caspase家族和Bcl-2家族起到關(guān)鍵作用，Caspase3是Caspase家族的關(guān)鍵酶，處在其級聯(lián)反應(yīng)下游，活化的Caspase3可使凋亡進(jìn)入不可逆階段〔13，14〕。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死中Caspase3被激活〔15〕。Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，活化的Bax可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡〔16〕。本研究結(jié)果提示RGC32可通過下調(diào)Caspase3和Bax表達(dá)降低心肌梗死心肌細(xì)胞的凋亡。

心肌梗死后心功能不良及心室重構(gòu)的一個(gè)關(guān)鍵因素是炎癥損傷，心肌缺血缺氧而導(dǎo)致的無菌性炎癥反應(yīng)，可引起免疫細(xì)胞的聚集與活化，釋放IL-6、TNF-α等一些炎癥因子〔17，18〕。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和TNF-α表達(dá)水平與慢性心力衰竭進(jìn)展有密切關(guān)系，可導(dǎo)致左心室擴(kuò)大和壁變薄、心室收縮功能減退〔19〕。Notch1信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其家族成員對細(xì)胞的發(fā)育、凋亡、分化等過程有重要作用〔20〕。研究發(fā)現(xiàn)，激活Notch1信號通路可保護(hù)心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷，可加快心肌梗死后心功能的恢復(fù)〔21〕。Hes1基因是Notch1信號通路下游重要的效應(yīng)分子，是其是否激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)RGC32可提高由缺血缺氧引起Notch1和Hes1表達(dá)的降低。

綜上，RGC32基因在心肌梗死心肌組織表達(dá)升高，抑制心肌細(xì)胞RGC32基因表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡、提高免疫及激活Notch1信號通路，其中對心肌細(xì)胞凋亡的影響是下調(diào)Caspase3和Bax表達(dá)，提示RGC32可能是心肌梗死新的治療靶點(diǎn)。