刁俊玲，劉靈儷，杜 鵑，李佳渝，李繼斌，肖曉秋

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院, 重慶 400016)

糖尿病已經(jīng)成為影響全球主要的健康問題之一，因肥胖引起代謝性紊亂而誘發(fā)胰島素抵抗是現(xiàn)代人發(fā)生2型糖尿病的主要原因[1]。脂質(zhì)代謝異常和紊亂、炎癥因子的上調(diào)、氧化應(yīng)激增多等容易導(dǎo)致糖尿病相關(guān)心血管類和腎病疾病的發(fā)生[2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)作為糖尿病最危險(xiǎn)的主要并發(fā)癥之一，與潛在的病理生理機(jī)制和糖尿病本身不同的治療效果有關(guān)，其腎損傷與腎臟纖維化的程度相關(guān)，而細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積容易引起腎臟的纖維化[3]，DN影響了30%～40%的II型糖尿病患者[4]。

噻唑烷二酮類(thiazolidinediones, TZDs)藥物主要用于增加2型糖尿病患者的胰島素敏感性。臨床實(shí)踐指南建議指出，TZDs可以用于腎功能受損的糖尿病患者血糖水平的改善[5]。羅格列酮為TZDs的一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)完全激動劑，增加胰島素敏感性的同時(shí)，伴隨著腎臟對Na+的重吸收而引起水腫的發(fā)生[6]。PPARγ受體在腎臟中主要存在于腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)細(xì)胞中，而PPARγ受體的活化在腎臟纖維化中顯示出抗纖維化作用[7]。

近年來，臨床發(fā)現(xiàn)羅格列酮用于糖尿病患者后出現(xiàn)了骨折、心衰、體重增加、水鈉潴留等副作用[8]。因此，研究者以PPARγ為靶點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)激動能力較弱的 PPARγ激動劑既發(fā)揮胰島素增敏作用，又能減少副反應(yīng)的發(fā)生[9]。本課題組前期合成了TZDs類衍生物——CMHX008(結(jié)構(gòu)式見Fig 1)，發(fā)現(xiàn)CMHX008激動PPARγ活性弱于羅格列酮，但能夠有效降低血糖，增強(qiáng)脂聯(lián)素的表達(dá)水平，以及促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉淀能力弱于羅格列酮[10]，而CMHX008對糖尿病相關(guān)的腎損傷的影響尚不清楚。本研究以長期高脂飲食喂養(yǎng)誘發(fā)的糖尿病小鼠腎功能損傷為模型，以傳統(tǒng)胰島素增敏藥物羅格列酮作為陽性對照，探討CMHX008是否能夠改善DN小鼠的腎臟功能，減弱腎臟纖維化的發(fā)生。

Fig 1 The chemical structure of TZDs rosiglitazone and CMHX008

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級♂8周齡C57BL/6小鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(渝)2017-0023。

1.2試劑低脂飲食(含10 kcal%脂肪)和高脂飲食(含60 kcal%脂肪)，購自惠特比科技發(fā)展(北京)有限公司；羅格列酮(重慶太極集團(tuán))；CMHX008(專利號: 201210202455.2)由本校藥學(xué)院合成，純度99%；TRIzol(Invitrogen公司，貨號15996026)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，貨號RR037A)； SYBER Green(Roche公司，貨號06924204001)；Masson染液(D026)和天狼星紅染色液 (DC0041)，購自南京建成科技有限公司；PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3儀器1-15PK型低溫離心機(jī)(Sigma公司)；ND-2000型分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)；VERITI型梯度PCR儀(Applied Biosystems公司)；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；DM40008型生物顯微鏡(Leica公司)。

2 方法

2.1動物模型的建立與分組8周齡SPF級C57BL/6♂小鼠隨機(jī)分為兩組，分別飼以高脂飲食(H)和低脂飲食(L)，喂養(yǎng)12周后，將高脂飲食誘發(fā)的肥胖小鼠隨機(jī)分為3組，分別給予溶媒0.8%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(HV組)、羅格列酮(HR組)、CMHX008(HC組)；低脂飲食飼養(yǎng)的小鼠給予0.8% CMC-Na作空白對照(LV組)。即共計(jì)4組: 低脂空白組(LV)、高脂空白組(HV)、羅格列酮組(HR)、CMHX008組(HC)，每組6只，給藥方式為灌胃給藥(10 mg·kg-1·d-1)[9-10]，每日光照時(shí)間和黑暗時(shí)間均為12 h，室內(nèi)溫度為24℃左右，自由飲水，每周稱取小鼠體質(zhì)量，給藥16周后，收集小鼠尿液及血液，離心取上清液，保存待用。

2.2常規(guī)光鏡檢查腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水包埋，切成4 μm厚的切片備用。將石蠟切片60℃烤箱烘烤4 h后，依次放入二甲苯(2次,每次30 min)、梯度乙醇(100%、95%、85%、75%，各5 min)中，經(jīng)蒸餾水沖洗后，用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE) 在鏡下觀察組織形態(tài)變化，Masson及天狼星紅染色觀察腎臟腎小管間質(zhì)及腎小球區(qū)域纖維化存積情況。

2.3生化檢測處死前收集小鼠24 h尿液，離心后，取上清液于-80℃保存。小鼠乙醚麻醉后，眼眶取血，將血液離心后，取上清液于-80℃保存。將尿液和血液樣本送檢于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，全自動生化檢測儀檢測小鼠尿液中的Na+、K+、尿蛋白(urine protein，Upro)、尿肌酐(urine creatinine, UCr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，以及血清中的血肌酐(serum creatinine，Scr)、BUN、膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)的濃度，并進(jìn)行分析。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR取小鼠腎臟組織，剪碎后，加入TRIzol裂解液進(jìn)行勻漿裂解，提取總RNA，用分光光度計(jì)檢測RNA濃度。采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系于梯度PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并獲得模板cDNA，加入180 μL DEPC水，補(bǔ)齊至200 μL。取2.5 μL cDNA，加入5 μL SYBER、1.5 μL DEPC水、上下游引物各0.5 μL，補(bǔ)齊至10 μL，于RT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增目的基因上、下游引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence for real-time RT-PCR

3 結(jié)果

3.1CMHX008對糖尿病小鼠腎臟的損傷有明顯的改善作用前期研究表明[10],高脂飲食喂養(yǎng)后，小鼠顯示出2型糖尿病的糖耐量受損和胰島素抵抗這兩個(gè)主要特征,CMHX008給藥后的小鼠體質(zhì)量較高脂組明顯降低。通過各組間腎臟組織重量的比較發(fā)現(xiàn)，HV組腎重明顯高于LV組(P<0.05), HR組腎重明顯高于HV組(P<0.01)，HC組腎重與HV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 2A)。而腎重比結(jié)果顯示，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于我們所觀察的DN處于早期階段，腎重比結(jié)果不明顯(Fig 2B)。腎臟對Na+的重吸收為水鈉潴留的主要特征[9]，全自動生化分析檢測結(jié)果顯示(Tab 2)，與LV組比較，HV組小鼠尿液Na+濃度明顯降低(P<0.05)；與HV組比較，HR組Na+濃度無明顯改善，HC組Na+濃度明顯增加(P<0.01)。

Fig 2 Comparison of the kidney mass(A) and ratio of

*P<0.05vsLV group;##P<0.01vsHV group

腎損傷通常是無癥狀的，表現(xiàn)為蛋白尿、血尿或者腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate, GFR)的減少[2]。Tab 2、3結(jié)果表明，與LV組比較，HV組小鼠Upro濃度、Upro/Cr比值、Scr濃度明顯上升(P<0.05，P<0.01)，表明長期高脂飲食喂養(yǎng)會影響小鼠腎臟對Upro、Scr的排泄，造成腎臟的損傷。通過16周的長期給藥，與HV組比較，HR組、HC組Upro濃度減少約40%、50%；HR、HC組Upro/Cr比值均減少約50%(Tab 2)。分析小鼠血清各指標(biāo)結(jié)果顯示(Tab 3)，與HV組比較，HR組Scr濃度明顯增加(P<0.01)，而BUN的濃度較HV組差異無顯著性；HC組BUN、Scr濃度明顯降低，表明CMHX008較羅格列酮能更加有效降低血清中BUN、Scr水平。結(jié)果表明，羅格列酮和CMHX008對高脂誘發(fā)的2型糖尿病小鼠腎功能受損有改善作用，CMHX008較羅格列酮改善更為明顯。

3.2羅格列酮和CMHX008能夠減少高脂飲食誘發(fā)的2型糖尿病小鼠腎臟膠原纖維的沉積本研究通過28周高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠后，腎臟組織HE染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型HV組腎臟組織管腔增大,腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，HR和HC給藥組腎小管顯示出明顯的改善。天狼星紅染色和Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)，HV組腎小球及腎小管間質(zhì)的膠原纖維較LV組明顯增多，與HV組比較，HR組、HC組腎間質(zhì)纖維化面積明顯減少，HC組膠原纖維較HR組也有所減少(Fig 3)。結(jié)果表明，羅格列酮、CMHX008能夠明顯改善腎損傷，減緩糖尿病小鼠腎臟的纖維化進(jìn)程。

3.3羅格列酮和CMHX008對腎臟纖維化的改善作用可能與腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的減弱有關(guān)檢測腎臟組織中相關(guān)分子mRNA相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)(Fig 4)，與LV組比較，HV組間基質(zhì)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、I型膠原(Collagen I)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，上皮標(biāo)志蛋白E-鈣蛋白(E-cad )mRNA表達(dá)明顯下調(diào)；與HV組比較，HR組α-SMA、Collagen Ⅰ、FN mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，E-cad mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，HC組α-SMA、Collagen I、FN mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，E-cad mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，其中HC組Collagen I表達(dá)下調(diào)比HR組更為明顯(P=0.05)。結(jié)果表明，與高脂空白組比較，羅格列酮和CMHX008給藥后小鼠腎臟中間基質(zhì)成分α-SMA、Collagen I、FN mRNA表達(dá)下調(diào)，而上皮組織中E-cadmRNA表達(dá)上調(diào)，提示纖維化的改善可能是由于腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的減弱所導(dǎo)致的。

Tab 2 The analysis of related indices detection in urine of C57BL/6 n=4～5)

*P<0.05,**P<0.01vsLV group;#P<0.05,##P<0.01vsHV group

Tab 3 The analysis of related indices detection in serum of C57BL/6

*P<0.05,**P<0.01vsLV group;#P<0.05,##P<0.01vsHV group

Fig 3 HE, Sirius red and Masson’s trichrome staining of kidney tissues(×400)

Fig 4 mRNA levels of tubule EMT n=3～5 )

*P<0.05,**P<0.01vsLV group;#P<0.05,##P<0.01vsHV group

4 討論

據(jù)報(bào)道，使用羅格列酮后常見的不良反應(yīng)有體重增加、水腫、骨量丟失、心衰等[8]。目前已有研究證明，肥胖糖尿病患者體重減輕后，蛋白尿明顯減少，對腎功能的改善是有益的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，CMHX008給藥后，小鼠體質(zhì)量明顯低于高脂飲食小鼠[10]。Wang等[12]通過系統(tǒng)分析DN患者服用TZDs的安全性，發(fā)現(xiàn)TZDs會增加糖尿病患者水腫的風(fēng)險(xiǎn)。而Na+重吸收的增加是導(dǎo)致水腫的主要原因[6]。本研究中，尿液Na+濃度檢測結(jié)果顯示，CMHX008能夠明顯降低2型糖尿病小鼠腎小管對Na+的重吸收，而羅格列酮處理后的肥胖小鼠尿液中Na+濃度無明顯改善。

DN是一種緩慢進(jìn)程性的疾病，長期肥胖不僅影響2型糖尿病的發(fā)展，對腎臟也有明顯的影響[13]。DN以蛋白尿增加和腎功能減退為主要特征[14]。因此，本研究采用高脂飲食長達(dá)28周喂養(yǎng)，模擬人的脂質(zhì)代謝紊亂引起糖耐量受損和胰島素抵抗為主要特征的2型糖尿病模型，通過HE染色發(fā)現(xiàn)，高脂空白組腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，尿蛋白、血肌酐和膽固醇明顯升高，有明顯的腎損傷。指南指出，TZDs類是活化PPARγ受體的降糖藥物，主要由肝臟代謝，伴有腎損傷的糖尿病患者服用TZDs不需要調(diào)整劑量，可能對腎臟有一定的保護(hù)作用[15]。本研究從組織形態(tài)學(xué)方面的觀察發(fā)現(xiàn)，羅格列酮和CMHX008對高脂誘發(fā)的糖尿病小鼠腎小管損傷有明顯的改善作用。生化檢測結(jié)果顯示，羅格列酮和CMHX008給藥后腎功能有一定的改善，并且CMHX008對高脂誘發(fā)的糖尿病腎損傷有更好的改善作用。

Zhao等[7]通過特異性敲除腎近端小管上皮的PPARγ受體的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，敲除PPARγ會加劇EMT的發(fā)生，激動PPARγ則可改善腎臟的纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過天狼星紅、Masson染色觀察了糖尿病小鼠模型給藥后腎小球和腎間質(zhì)纖維化的存積情況，證明了羅格列酮和CMHX008都能有效改善糖尿病小鼠腎臟的纖維化存積,其中CMHX008改善效果更為明顯。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腎小管間質(zhì)纖維化主要是由病理損傷的腎小管上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能夠向間質(zhì)區(qū)浸潤遷移，分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，促進(jìn)纖維形成，上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化涉及到上皮蛋白(E-cad、緊密連接蛋白ZO-1、細(xì)胞角蛋白)的消失，波形蛋白(Vimentin)、α-SMA、間基質(zhì)成分I型膠原和纖維連接蛋白等新的間充質(zhì)標(biāo)志物的增加[3]。 因此，我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測了EMT相關(guān)的分子mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，DN小鼠模型在給予羅格列酮和CMHX008后，間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Collagen Ⅰ、FN mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，小管上皮E-cad mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)。提示羅格列酮和CMHX008可能是通過減少EMT的發(fā)生，進(jìn)而改善糖尿病相關(guān)腎臟的纖維化。

本研究證明了PPARγ完全激動劑羅格列酮和部分激動劑CMHX008能明顯減少對Na+的重吸收，減弱2型糖尿病腎病小鼠腎臟的纖維化存積，對高脂誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟功能損傷有明顯的改善作用。伴有腎臟疾病、肥胖等高危因素的糖尿病患者使用羅格列酮可能引起不適，而CMHX008在增加胰島素敏感性、維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)以及不增加體重的同時(shí)，對腎臟有明顯的保護(hù)作用。因此，CMHX008作為一個(gè)潛在的新藥在未來的糖尿病患者的治療中具有非常重要的意義。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此衷心地感謝實(shí)驗(yàn)室的所有老師和同學(xué)們的幫助!)