， *， ， ， ， ， ，

(1.青海大學， 青海 西寧810016； 2.中國科學院地理科學與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡觀測與摸擬重點實驗室, 北京100101； 3.中國科學院西北高原生物研究所,青海省寒區(qū)恢復生態(tài)學重點實驗室, 青海 西寧810008)

纖維素類物質(zhì)是自然界中分布廣、數(shù)量大、來源豐富的可再生性物質(zhì)，纖維素酶和半纖維素酶是降解纖維素類物質(zhì)酶系中的主要組份，其在醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領域應用廣泛[1]。自然界中真菌分布廣泛、且種類繁多，盡管真菌數(shù)量不及細菌，甚至比放線菌還少，但其在生態(tài)系統(tǒng)碳素循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[2]，另外，真菌產(chǎn)生的纖維素酶多是胞外酶，且纖維素酶各組分齊全，分解能力較強[3]。因此，真菌在降解纖維素類物質(zhì)方面具有更廣闊的應用前景[4]。

高寒草地土壤纖維素分解真菌是草地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，查明其數(shù)量及其組成情況無疑是十分必要的。素有“世界屋脊”之稱的青藏高原由于地理位置特殊、具有豐富的降解纖維素類物質(zhì)的微生物物種和基因資源，是分離和篩選纖維素分解真菌的寶庫和良好介質(zhì)[5]。課題組在前期從高寒草地土壤中分離和篩選了大量的具有纖維素分解真菌菌株，為了進一步確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位和產(chǎn)纖維素酶的特性，本文以初步篩選出具有優(yōu)良性狀的菌株(編號為H)為研究對象，進行了rDNA-ITS分子鑒定、培養(yǎng)特性及粗酶液酶學性質(zhì)的研究，旨在為進一步開發(fā)和利用奠定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

由本課題組從東祁連山高寒草地土壤中分離獲得，具有分解纖維素物質(zhì)的功能，菌株編號為H。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)[6]，用于供試菌株菌株的轉接和活化。

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(potato sugar agar, PS)[6]，用于供試菌株菌絲的培養(yǎng)。

察氏培養(yǎng)基[6]，用于供試菌株在不同溫度條件下生長速度的測定。

供試碳、氮源培養(yǎng)基：在察氏培養(yǎng)基中，分別按培養(yǎng)基總體積1%的糊精、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖等5種碳源，配置不同碳源培養(yǎng)基；另外，分別按培養(yǎng)基總體積0.25%的蛋白胨、尿素、硫酸銨、磷酸胺、硝酸鈉等5種氮源，配置不同氮源培養(yǎng)基，pH調(diào)至6～7，每組做3個重復。用于供試菌株在不同碳氮源條件下生長速度的測定。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基[7]：NaNO32.5 g，KH2PO41 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，MgSO40.3 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，秸稈(粉)0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH(用稀鹽酸調(diào)制6.0～7.0)。用于測定供試菌株產(chǎn)木聚糖酶的酶活力。

1.3 研究方法

1.3.1菌株活化 將保存的供試菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)7～8 d后，連續(xù)轉接2～3次，純化、復壯。

1.3.2菌株鑒定 經(jīng)活化、純化的菌株挑取少量菌絲接種于PS 液體培養(yǎng)基中，于25℃，150 r min-1搖床振蕩培養(yǎng)，過濾后收集菌絲體，采用試劑盒法提取基因組DNA。以基因組DNA 為模板，利用1對rDNA-ITS 通用引物(ITS-1、ITS-4)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后，送樣測定DNA序列。將測序獲得的ITS序列通過與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫序列進行Blast分析，采用CLUSTAL軟件進行多重序列比對[8]，并用MEGA 4.0 軟件采用Neighbor-Joining 法和UPGMA 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[9-10]。ITS-1：5′-GTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 反應程序：預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 1 min，復性50 ℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35 個循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min。基因組DNA提取試劑盒(SK1375)、引物合成、序列測定均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.3生物學特性 參照Li 等[11]的方法，在PDA平板上將培養(yǎng)7～10 d的供試菌株用直徑6 mm的打孔器切取菌餅，分別轉接于不同測定內(nèi)容的培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)(除溫度處理實驗)，3 次重復，用十字交叉法測定菌落直徑，以第7 d測定的菌落直徑作為評定菌株生長速率的依據(jù)。溫度對真菌生長的影響：分別于15℃，20℃，25℃，30℃，35℃和40℃等6種溫度培養(yǎng)。碳、氮源對真菌生長的影響：分別轉接于含1%的不同碳源和0.25%的不同氮源培養(yǎng)基上，培養(yǎng)。實驗結束后測定供試菌株的菌落直徑。

1.3.4供試菌株產(chǎn)酶特性的研究

1.3.4.1 繪制標準曲線

參照鄭佐頭等[12]和陸文清等[13]的方法，以吸光值(OD540)作橫坐標，分別以對應的標準葡萄糖溶液和木糖溶液含糖的毫克數(shù)為縱坐標，列出直線回歸方程，制作標準曲線(圖1,圖2)。

圖1 以葡萄糖為底物的標準曲線Fig.1 The standard curve using glcose as substract

圖2 以木糖為底物的標準曲線Fig.2 The standard curve using xylcose as substract

1.3.4.2 粗酶液的制備

將活化的菌株分別接種于以0.5 g油菜秸稈粉為底物，盛有50 mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基150 mL的錐形瓶中，以不接菌為對照，每個處理重復3次。在25 ℃，150 r·min-1條件下，置于搖床震蕩培養(yǎng)，試驗周期為7 d。實驗結束后，經(jīng)尼龍絲網(wǎng)過濾的發(fā)酵液，用滅菌的1 000 μL移液器槍頭，吸取2 mL上清液，于4℃，10 000 r·min-1，離心10 min，取上清液制備粗酶液。

1.3.4.3 酶活力測定

酶活力測定方法參照文獻[14]，稍有改進。吸取液體搖瓶發(fā)酵粗酶液0.2 mL，以1 mL含0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)和樺木木聚糖為反應底物的檸檬酸緩沖液(pH=5.5，終濃度為0.1 mol·L-1)組成反應體系，在37℃恒溫水浴鍋中反應30 min，采用DNS法 (3,5-二硝基水楊酸)測定最終反應產(chǎn)物在540 nm波長下的吸光值[15]，空白對照用等體積熱變性的粗酶液代替新鮮的粗酶液。酶活力的計算方法按照國際理論應用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標準方法，分別以每mL粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖為一個國際單位，計IU·mL-1[16]。

計算公式如下：X= m /(M×t)×1 000×n

式中：X 為酶活力單位，

m 為葡萄糖的含量，

M 為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，

T 為酶反應時間，

1000 為轉化因子，1 mmol=1 000 μmol，

n 為稀釋倍數(shù)。

1.3.4.4 粗酶液最適溫度、pH值的測定

按照上述酶活力測定的方法，分別在4℃,10℃,15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃,70℃下測羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活力，以溫度(T)為橫坐標，相對羧甲基纖維素酶和木聚糖酶活力為縱坐標作圖(以酶活最高者為100%)。以酶活力最大時的反應溫度為酶催化活性最適溫度。按同樣的方法，分別在pH 2.0, pH 3.0, pH 3.5, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9.0, pH 9.5, pH 10.0條件下羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活力，以pH為橫坐標，相對羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活力為縱坐標作圖(以酶活最高者為100%)。以酶活力最大時的pH值為酶催化活性最適pH。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 錄入并作圖，采用DPS 6.55進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 供試菌株H的菌落形態(tài)及分子鑒定

供試菌株H在PDA 培養(yǎng)基上為白色，菌落圓形，25℃培養(yǎng)培養(yǎng)7 d后菌落直徑達65.7 mm，菌絲疏松，表面為絨毛狀。菌落反面為淡黃色(圖3)。子囊果球形，表面附屬絲呈菌絲狀，淺褐色；子囊近圓形或橢圓形，子囊孢子紡錘形或橢圓形，褐色(圖4)。

測序結果在GenBank 中進行BLAST同源性比較，采用Neighbor-Joining 法和UPGMA 法分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，結果如下：菌株H與登錄號為AB470856的菌株的親緣關系最近，支持率高達100%。與菌株H最相似的菌株為：Thielaviahyalocarpa。

圖3 供試菌株H的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of of Strain H

圖4 供試菌株H的菌體形態(tài)Fig.4 Ascus morphology of Strain H

圖5 菌株H系統(tǒng)發(fā)育樹的構建Fig.5 Construction of phylogenetic tree of strain H注：A、B分別為基于Neighbor-Joining法和UPGMA法的系統(tǒng)發(fā)育樹Note：A, B is phylogenetic tree based on Neighbor-Joining method and the UPGMA method respectively

2.2 溫度對菌株生長的影響

供試菌株在15～35℃溫度范圍內(nèi)能夠生長。由圖6可以看出，溫度對生長速度的影響較為明顯，從15～25℃范圍內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高而逐漸增大，從25～30℃范圍內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高而變小，在20℃的生長速度高于30℃條件下的生長速度。從供試菌株生長速度隨溫度變化的曲線來看， 菌株H的最適生長溫度為25℃。

圖6 溫度對菌株生長的影響Fig.6 Effects of temperature on the mycelial growth rate

2.3 不同碳、氮源對菌株生長的影響

由表1可以看出，供試菌株不僅能利用單糖，低聚糖等速效碳源，而且還能利用淀粉等長效碳源，對參試5種碳源的利用能力各不相同。供試菌株在糊精、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉等5種供試碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑大小不盡相同，菌株在不同碳源的培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出不同的生長速度。供試菌株H對5種碳源的利用表現(xiàn)為：葡糖糖>糊精、麥芽糖和淀粉>蔗糖。供試菌株在蛋白質(zhì)、尿素、硫酸胺、磷酸胺、硝酸鈉等5種供試氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑大小不盡相同，每一種菌株在不同氮源培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出不同的生長速度。H對5種氮源的利用表現(xiàn)為：蛋白質(zhì)>硝酸鈉>尿素>硫酸胺>磷酸胺；

2.4 酶學性質(zhì)

2.4.1羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活力 酶活力結果表明，菌株H既能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶又能產(chǎn)木聚糖酶，酶活力測定結果見表2。

表1 不同碳、氮源對菌落生長速度的影響Table 1 Effects of N-source on the mycelial growth rate

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=3)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Mean±SD for 3 replicated tests. Different samll letters in same column indicate significant differences at the 0.05 level

表2 酶活力測定結果Table 2 The experimental results of enzyme activity

2.4.2產(chǎn)羧甲基纖維素酶的酶學性質(zhì) 圖7 可以看出，在15～65℃范圍內(nèi)，能夠監(jiān)測到菌株H分泌的羧甲基纖維素酶的酶活力，并且在50℃時達到最大值，且在不同溫度下下放置12 h，30℃左右保持的酶活力最大。由圖8可以看出，在pH 2.0～10范圍內(nèi)，能夠監(jiān)測到菌株H分泌的羧甲基纖維素酶的酶活力，在pH=5.5時達到最大值，且在不同pH下放置12 h后，pH=5.5時酶活力保持較高的活性。

圖7 菌株H產(chǎn)CMCase的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig.7 The optimum temperature and thermal stability of CMCase of strain H

2.4.3產(chǎn)木聚糖酶的酶學性質(zhì) 由圖9可以看出，菌株H誘導分泌的木聚糖酶(Xylanase)在55℃時酶的催化活性達到最大值，在不同溫度下下放置12 h，0～45℃之間保持較高的酶活力。由圖10可以看出，菌株H在不同pH下的保持的酶活力大小不同，pH值為5.0時酶的催化活性較高，在不同pH下放置12 h，pH=5.0的范圍內(nèi)能夠檢測到木聚糖酶的酶活力。

圖8 菌株H產(chǎn)CMCase的最適pH值和對pH值的穩(wěn)定性Fig.8 The optimum pH value and stability of CMCase of strain H

圖9 菌株H產(chǎn)Xylanase的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig.9 The optimum temperature and thermal stability of Xylanase of strain H

圖10 菌株H產(chǎn)Xylanase的最適pH值和對pH值的穩(wěn)定性Fig.10 The optimum pH value and stability of Xylanase of strain H

3 討論與結論

經(jīng)ITS-rDNA分子鑒定，供試菌株初步確定為Thielaviahyalocarpa，供試菌株的最適生長溫度為25℃；對不同的碳、氮源利用能力不同，在供試的5種碳源和氮源中，葡萄糖和蛋白胨分別為最適碳源和氮源。菌株H對5種碳源的利用表現(xiàn)為：葡糖糖>糊精、麥芽糖和淀粉>蔗糖菌株，菌株H對5種氮源的利用表現(xiàn)為：蛋白質(zhì)>硝酸鈉>尿素>硫酸胺>磷酸胺；菌株H產(chǎn)的纖維素酶在pH 5.5，50℃下有較高的催化活性，產(chǎn)的木聚糖酶在pH為5，55℃溫度下有較高的催化活性。

已有研究表明具有纖維素降解能力的真菌主要有以下一些菌：曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、葡萄狀穗霉(Stachybotrys) 、毛殼霉(Chaetomium)、木霉(Trichoderma)、葡萄孢霉(Botrytis)、白腐菌(Whiterotfungi)和褐腐菌(Brownrotfungi)等。楊濤等[17]從云南高黎貢山共分離到15個屬35株真菌，其中曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、葡萄狀穗霉(Stachybotrys) 、毛殼霉屬(Chaetomium)的真菌共計20株，占總分離菌株數(shù)的57.1%，它們是高黎貢山土壤中降解纖維素真菌的優(yōu)勢菌群。謝占玲等[18]從青海高原林區(qū)分離篩選31株降解纖維素的真菌，篩選出一株分離自互助北山森林的高產(chǎn)纖維素酶的真菌NO 0143菌株，根據(jù)其形態(tài)學及培養(yǎng)特征鑒定為康氏木霉(TrichodermakoningiiQudem)。由此可見，土壤環(huán)境中具有纖維素分解能力的真菌的種類較為豐富。

目前進行商業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的幾乎都是中高溫型纖維素酶，其最適作用溫度多為45～65 ℃[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，菌株H誘導分泌的羧甲基纖維素酶(CMCase)在pH=5.5、50 ℃時酶活性最高，分泌的木聚糖酶(Xylanase)在pH=5.0、溫度為55℃酶活性最高，酶的最適作用溫度和pH值和大部分真菌類似。但菌株H分泌的羧甲基纖維素酶和木聚糖酶分別在15～40℃、0～45℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，與中高溫型纖維素酶相比，在低溫環(huán)境下可以高效反應，對減少工藝流程、降低生產(chǎn)成本以及節(jié)能等方面應用具有相當大的優(yōu)勢。因此，菌株H分泌的羧甲基纖維素酶和木聚糖酶在低溫環(huán)境的反應條件下具有廣闊的應用前景。

梭孢殼屬(Thielavia)真菌隸屬于毛殼菌科 (Chaetomiaceae)、核菌綱 (Pyrenomycetes)，糞殼菌目(Sordariales)[21]。陳慶濤[22]對中國毛殼菌科進行了研究，報道了Chaetomium和Thielavia。目前對梭孢殼屬(Thielavia)真菌報道較多的是一種病原菌，可引起向日葵黑莖病[23]，是杜仲和寧夏枸杞內(nèi)生真菌的組成部分[24-25]。本研究供試菌株H來源于高寒草地土壤中，其ITS序列與數(shù)據(jù)庫中已知菌株的序列相似性高達100%，經(jīng)rDNA-ITS基因序列的分子鑒定，為梭孢殼屬(Thielavia)真菌。菌株H既能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶又能產(chǎn)木聚糖酶，并且菌株H產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶和木聚糖酶有一定的穩(wěn)定性，在不同溫度和pH值下，放置12小時后，仍能檢測到酶活力，說明菌株H分泌的纖維素酶和木聚糖酶具有一定的穩(wěn)定性。這一結果表明高寒草地土壤中存在多酶系真菌資源，對豐富高寒草地土壤纖維素分解真菌的物種多樣性具有重要的意義。

土壤微生物作為地下生態(tài)學的研究對象之一，是維持生態(tài)系統(tǒng)平衡，揭示全球氣候變化與生態(tài)系統(tǒng)CO2響應與反饋機制的關鍵過程之一[26-27]。微生物一方面直接分解和利用有機物質(zhì)，降解所接觸到的所有植物殘體，利用植物殘體分解產(chǎn)生的低分子量化合物，如核酸、脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成的微生物生物量，另一方面以代謝產(chǎn)物或者殘留物(胞外酶，胞外多聚物，細胞壁大分子等)的形式貢獻于土壤有機質(zhì)，微生物自身的碳分配過程對有機質(zhì)形成具有重要貢獻[28]。除此之外，土壤中水分狀態(tài)、黏土礦物吸附等外界因素會影響微生物群落的碳分配過程和速率[29]。在高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中，相比于其它微生物生理功能類群，木質(zhì)纖維素分解功能群在參與碳素循環(huán)的過程中占重要位置，其數(shù)量占絕對優(yōu)勢[30]。因此，深入認識高寒草地土壤產(chǎn)纖維素酶真菌資源，對豐富高寒草地土壤碳循環(huán)理論，為調(diào)控退化高寒草地生態(tài)系統(tǒng)的恢復和治理提供科學依據(jù)。