賈俊婷,趙品蒼,劉祝江,袁光孝,楊偉光,3,劉書(shū),陳雙燕,李曉霞*,劉公社*

(1.中國(guó)科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

生殖過(guò)程是高等植物生活史中一個(gè)重要階段。開(kāi)花植物生殖的承載者花器官的發(fā)育一直是植物學(xué)家研究的重點(diǎn)之一。20世紀(jì)90年代，通過(guò)對(duì)雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、金魚(yú)草(Antirrhinummajus)和矮牽牛(Petunia)遺傳突變體的研究，建立了花器官發(fā)育的ABCDE模型[1-5]，ABCDE模型中大部分基因?qū)儆贛ADS-box基因。研究發(fā)現(xiàn)在高等植物中，MADS-box基因家族在序列及功能上比較保守，在花器官形成，種子和果實(shí)發(fā)育，以及開(kāi)花時(shí)間的控制等方面都起著重要的作用[6-8]。而E類(lèi)(SEP-like)基因作為其中一類(lèi)花同源異型基因，其功能不僅體現(xiàn)在花器官?zèng)Q定，參與四輪花器官的形成，而且還參與花分生組織的決定性[9]。在禾本科植物水稻(Oryzasativa)基因組中發(fā)現(xiàn)5個(gè)SEP-like基因：OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34[10]。

其中OsMADS7和OsMADS8在水稻漿片，雄蕊和雌蕊中表達(dá)，在內(nèi)外桴中不表達(dá)；在內(nèi)三輪花器官的發(fā)育和花的決定性上起了重要作用[11]。OsMADS34基因突變后植株材料表現(xiàn)出花序變小，分枝結(jié)構(gòu)紊亂，種子敗育等表型[12]。近年來(lái)關(guān)于MADS-box基因的研究在禾本科其他植物中陸續(xù)報(bào)道。如小麥(Triticumaestivum)中已經(jīng)克隆到42個(gè)MADS-box基因，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)小麥E類(lèi)基因TaSEP在內(nèi)稃、漿片、雄蕊和雌蕊中都有表達(dá)[13-15]。其中一個(gè)SEP-like基因TaMADS1過(guò)表達(dá)的擬南芥植株出現(xiàn)提前開(kāi)花和花器官發(fā)育異常等現(xiàn)象[16]。二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)基因組中發(fā)現(xiàn)6個(gè)SEP-like基因：BdMADS1,BdMADS7,BdMADS11,BdMADS26,BdMADS28 和BdMADS32，其中BdMADS7在二穗短柄草外稃、內(nèi)稃、雄蕊及雌蕊中表達(dá)，同時(shí)對(duì)GL6和FUL1的可變拼接和表達(dá)模式也進(jìn)行了分析[17-19]。張妙青等[20]對(duì)垂穗披堿草(Elymusnutans)中的WM8基因也進(jìn)行了克隆及分析。

羊草(Leymuschinensis)，隸屬禾本科小麥族賴(lài)草屬，是多年生根莖型植物，是歐亞大陸草原區(qū)東部草甸草原及干旱草原的重要建種群[21-23]。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，抗逆性強(qiáng)，適口性好，在發(fā)展人工草地、改良退化草原方面占重要地位。在自然生境下，羊草有性生殖能力較弱，抽穗率較低，嚴(yán)重制約了其實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用[24]。近年來(lái)，對(duì)羊草的有性生殖研究主要集中在解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳多樣性等特點(diǎn)及氣候營(yíng)養(yǎng)和草場(chǎng)利用對(duì)有性生殖的影響等方面[25-26]。目前，關(guān)于羊草的有性生殖基因研究較少，MADS-box基因研究尚未見(jiàn)報(bào)道[27]。羊草花的發(fā)育和種子的發(fā)育密切相關(guān)，解析羊草花發(fā)育相關(guān)基因的生物學(xué)功能，對(duì)于揭示花發(fā)育的分子機(jī)制具有理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究從羊草中克隆了一個(gè)MADS-box基因LcMADS12，對(duì)其轉(zhuǎn)錄激活活性和原核表達(dá)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。此外，羊草作為禾本科作物小麥的野生近緣種，研究羊草中MADS-box基因，能為理解小麥、大麥(Hordeumvulgare)等作物及牧草的開(kāi)花生物學(xué)理論提供重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羊草實(shí)驗(yàn)材料種植于中國(guó)科學(xué)院植物研究所(北京)試驗(yàn)地，在自然條件下生長(zhǎng)。于2015年5月將成熟花序液氮速凍后，-80 ℃保存，供克隆羊草MADS-box基因使用。同時(shí)收集根、莖、葉、外稃、內(nèi)稃、穎片、雄蕊及雌蕊，用于組織特異性表達(dá)分析。

Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), DNaseI (Takara, Japan)，RNA提取試劑盒(百泰克)，PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑(TaKaRa)，SYBR?PremixExTaqTM(TaKaRa)，大腸桿菌Escherichiacoli菌株Trans5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)置于Trangen公司；基因克隆載體pMD-19 T simple購(gòu)于Takara公司，原核表達(dá)載體PET30a為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取與cDNA的合成 采用RNA提取試劑盒(百泰克)分別提取成熟花序羊草根、莖、葉、外稃、內(nèi)稃、穎片、雄蕊及雌蕊中的總RNA，并利用DNaseI(Takara, Japan)消化基因組DNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢驗(yàn)RNA完整性，并使用Biodropsis BD-2000進(jìn)行RNA濃度和純度測(cè)定。利用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time 編號(hào)：RR037Q)進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)體系為10 μL： 5×PrimeScript?Buffer (2 μL)，PrimeScript?RT Enzyme Mix I (0.5 μL)，OligodT Primer (50 μmol·L-1)(0.5 μL)，Random 6 mers (100 μmol·L-1) (0.5 μL)，Total RNA (500 ng)，RNase Free dd H2O (up to 10 μL)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s，合成后的cDNA存貯于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2羊草LcMADS12基因的克隆 通過(guò)檢索本實(shí)驗(yàn)室羊草成熟柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[27]，獲得一個(gè)全長(zhǎng)CDS的contig28995序列。通過(guò)將該序列在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列為E類(lèi)MADS-box家族基因，命名為L(zhǎng)cMADS12，根據(jù)其保守序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，擴(kuò)增LcMADS12基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)片段,并測(cè)序。具體反應(yīng)以羊草花序的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)后; 72 ℃再延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.3生物信息學(xué)分析 使用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；利用ProtParam(http://web.expasy.org/compute_pi)在線(xiàn)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析；采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.4基因表達(dá)分析 根據(jù)LcMADS12基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物,根據(jù)羊草Actin基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(表1),通過(guò)定量PCR(qRT-PCR)分析羊草LcMADS12在花期不同組織(根、莖、葉、外稃、內(nèi)稃、穎片、雄蕊及雌蕊)中的表達(dá)。定量PCR體系和條件按照TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 s； 45個(gè)循環(huán)(95 ℃，5 s；68 ℃，30 s)。技術(shù)重復(fù)3次。定量PCR完成后，采用2-ΔΔCt方法，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析[28]。

1.2.5轉(zhuǎn)錄激活功能分析 按照基因序列，在上游和下游引物分別加入EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)(表 1)，將LcMADS12連入pBridge載體的BD下游，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α中，陽(yáng)性單克隆經(jīng)雙酶切及測(cè)序正確后，熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)AH109 (Saccharomyces cerevisiae)中。以空pBridge載體為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)入pBridge-LcWRKY5為陽(yáng)性對(duì)照，并在缺少色氨酸和組氨酸的雙缺陷培養(yǎng)基上篩選，同時(shí)進(jìn)行Whatman濾紙顯色來(lái)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況。

1.2.6LcMADS12原核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá) 根據(jù)LcMADS12基因測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)基因編碼區(qū)兩端的特異引物，引入酶切位點(diǎn)EcoRI和SalI。將LcMADS12連入原核表達(dá)載體PET30a，酶切鑒定及測(cè)序鑒定連接成功后，將含PET30a-LcMADS12的重組質(zhì)粒利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLyS菌株。過(guò)夜，約12～16 h。將過(guò)夜培養(yǎng)的陽(yáng)性新鮮菌液按LB液體培養(yǎng)基(Kan兩份)，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，至OD600=0.4～0.6，取1 mL菌液作為未誘導(dǎo)的陰性對(duì)照組。其余菌液分別進(jìn)行溫度(16、25、37 ℃)，誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside)濃度(0.1、0.5、1.0 mmol·L-1)和誘導(dǎo)時(shí)間(0～6 h)處理，每隔1 h取一次樣，每次取1 mL菌液為“誘導(dǎo)后”的實(shí)驗(yàn)組。12000 r·min-1室溫離心5 min，棄上清。加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min裂解細(xì)胞。12000 r·min-1離心2 min，取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，再用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,脫色液脫色后拍照、分析。SDS-PAGE電泳膠的配比為12%的分離膠，5%的濃縮膠。

2 結(jié)果與分析

圖1 羊草LcMADS12基因克隆電泳圖Fig.1 The PCR amplification analysis of LcMADS12

2.1 羊草LcMADS12基因的克隆與生物信息學(xué)分析

以羊草小穗總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA產(chǎn)物為模板，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行羊草LcMADS12基因核心片段的PCR擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小相符的條帶(圖1)，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，片段長(zhǎng)度774 bp，ORF長(zhǎng)度為741 bp，編碼246個(gè)氨基酸，分子量為28.5 kDa，等電點(diǎn)為8.74。在N端含有典型的MADS-box結(jié)構(gòu)域。對(duì)LcMADS12基因編碼蛋白序列進(jìn)行NCBI比對(duì)分析，結(jié)果表明其編碼的蛋白與其他植物的MADS-box基因蛋白序列有很高的相似度，與小麥TaAGL16蛋白同源性為99%，與多年生黑麥草的LpMADS5蛋白序列同源性為97%，與二穗短柄草的BdMADS7-like蛋白同源性為94%，與水稻OsMADS7蛋白同源性為86%。進(jìn)一步進(jìn)行多重序列比對(duì)分析表明,羊草LcMADS12蛋白與其他植物來(lái)源的MADS-box蛋白具有較高的相似性(圖2)。以多年生黑麥草，水稻(粳稻)，玉米(Zeamays)，小麥，大麥，擬南芥(A.thaliana)，羊草等物種的MADS-box基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明，在進(jìn)化上LcMADS12與單子葉植物小麥TaAGL16親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物擬南芥親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖3)。利用TMHMM 2.0 Server對(duì)該蛋白跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白無(wú)跨膜區(qū)域；使用SignalP 4.1軟件對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明該蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖4)。

2.2 羊草LcMADS12基因在不同組織的定量表達(dá)分析

采用Real-time PCR技術(shù)，對(duì)盛花期羊草根、莖、葉及花器官結(jié)構(gòu)的外稃、內(nèi)稃、穎片、雄蕊及雌蕊中LcMADS12基因的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，LcMADS12在花器官中的相對(duì)表達(dá)量最高，而在根、莖、葉中檢測(cè)不到表達(dá)，說(shuō)明LcMADS12是羊草花器官特異基因。在生殖器官部位，除穎片外，在外稃、內(nèi)稃、雄蕊及雌蕊中均能檢測(cè)到LcMADS12的表達(dá)，且在雄蕊和雌蕊中的表達(dá)量較高，分別為外稃中表達(dá)量的37.7和33.4倍多，差異極顯著(P<0.01)；在內(nèi)稃中的表達(dá)量中等，為外稃中表達(dá)量的9倍；在外稃的表達(dá)量較低(圖5)。

圖2 LcMADS12蛋白和其他物種相似蛋白的氨基酸序列間的同源性比對(duì)Fig.2 Multiple alignment analysis of LcMADS12 conserved domain with its homologous in other plants

圖3 LcMADS12蛋白和其他物種相似蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of LcMADS12 proteins and other MADS-box proteins Lp: 多年生黑麥草L. perenne; Os: 水稻(粳稻) O. sativa (japonica group); Zm: 玉米Z. mays; Ta: 小麥T. aestivum； Hv: 大麥H. vulgare； At: 擬南芥Arabidopsis thaliana； Bd: 二穗短柄草B. distachyon.

圖4 LcMADS12生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of LcMADS12 A: LcMADS12保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè); B: LcMADS12基因信號(hào)肽預(yù)測(cè); C: LcMADS12跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。A: Conservative protein domain prediction of LcMADS12; B: Signal peptide prediction of LcMADS12 gene; C: Transmembrane region prediction of LcMADS12.

2.3 羊草LcMADS12蛋白的轉(zhuǎn)錄激活特性分析

將重組載體pBridge-LcMADS12轉(zhuǎn)入到酵母菌株AH109中，同時(shí)將酵母表達(dá)載體pBridge轉(zhuǎn)入酵母AH109作為空載體陰性對(duì)照，將LcWRKY5基因轉(zhuǎn)入酵母AH109作為陽(yáng)性對(duì)照。將3種含有融合載體的酵母菌在不含組氨酸和色氨酸的雙缺陷培養(yǎng)基(SD/-His-Trp)上進(jìn)行培養(yǎng)篩選后，用β-半乳糖苷酶活性濾紙進(jìn)行顯藍(lán)分析。結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)pBridge空載體的對(duì)照酵母菌株在SD/-His-Trp培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)pBridge-LcMADS12基因的酵母菌株和轉(zhuǎn)入pBridge-LcWRKY5作為陽(yáng)性對(duì)照的酵母菌株能夠在SD/-His-Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(圖6A)。β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)顯示正對(duì)照(pBridge-LcWRKY5)與實(shí)驗(yàn)組(pBridge-LcMADS12)的酵母菌對(duì)應(yīng)的濾紙呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，而負(fù)對(duì)照組(pBridge-BD)則不顯示藍(lán)色(圖6B)。上述結(jié)果說(shuō)明，羊草LcMADS12蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.4 LcMADS12原核表達(dá)分析

圖5 羊草LcMADS12基因的組織表達(dá)分析Fig.5 The relative expression pattern analysis of LcMADS12 in different tissues of L. chinensis 不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。Values with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

重組表達(dá)質(zhì)粒PET30a-LcMADS12在大腸桿菌中，經(jīng)過(guò)IPTG(isopropyl β-D-thiogalactoside)誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了高效蛋白表達(dá)，提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。為建立最佳的原核表達(dá)條件，重組表達(dá)質(zhì)粒PET30a-LcMADS12在大腸桿菌中，采用不同的溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間來(lái)確定目標(biāo)蛋白高效表達(dá)體系。提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果表明，在16 ℃，0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)3 h后，目標(biāo)蛋白表達(dá)量明顯增加。圖7中黑色箭頭標(biāo)出PET30a-LcMADS12融合表達(dá)的特異條帶，該條帶大小約為36 KDa,與LcMADS12蛋白分子量28.5 KDa加上載體上His標(biāo)簽的理論值相符。此外，在37 ℃和25 ℃條件下誘導(dǎo)，上清中該處沒(méi)有出現(xiàn)條帶，這說(shuō)明PET30a-LcMADS12融合蛋白在此誘導(dǎo)條件下是以包涵體形式存在或者沒(méi)有表達(dá)。

3 討論

花器官的發(fā)育作為被子植物生殖生長(zhǎng)的重要過(guò)程，一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)。小穗是禾本科花序特有的結(jié)構(gòu)單元，以水稻小花為例，一枚小花由六個(gè)雄蕊、心皮、外稃、內(nèi)稃和兩個(gè)漿片構(gòu)成，小花的外部包裹著一對(duì)護(hù)穎和一對(duì)退化的穎片，共同組成水稻花序的基本單元——小穗。而羊草的花構(gòu)造更接近于小麥，每一朵花都是由內(nèi)稃、外稃、兩個(gè)漿片、3個(gè)雄蕊和一枚雌蕊構(gòu)成，一小穗由4～9朵小花構(gòu)成，小穗基部有兩個(gè)穎片。研究發(fā)現(xiàn)E(SEP-like)類(lèi)基因不僅決定各輪次花器官的發(fā)育，在成花決定性上也起著重要作用，且在雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻中，SEP-like基因這兩方面的功能是保守的[29-30]。本研究中的羊草LcMADS12具有典型的MADS-box蛋白超家族的MADS-MEF2-like 結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，且氨基酸序列比對(duì)分析表明，該基因?qū)儆赟EP-like亞家族。前期研究表明，SEP亞家族發(fā)生過(guò)多次基因重復(fù)事件，產(chǎn)生了一系列 SEP-like進(jìn)化系[31]。本研究對(duì)LcMADS12基因蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，LcMADS12與小麥的TaAGL16/TaAGL30，大麥的HvMADS9相似性較高，而與擬南芥的AtSEP相似性較低，前三者(羊草、小麥、大麥)均屬于小麥族植物，親緣關(guān)系較近，與APGⅢ分類(lèi)系統(tǒng)一致。

圖6 酵母單雜交系統(tǒng)驗(yàn)證LcMADS12的轉(zhuǎn)錄激活功能Fig.6 Transcriptional activation activity of LcMADS12+：正對(duì)照 Positive control; -：負(fù)對(duì)照 Negative control.

圖7 PET30a-LcMADS12重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis analysis of the recombinant PET30a-LcMADS12 M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1：未誘導(dǎo)的陰性對(duì)照； 2-7：16 ℃，0.5 mmol·L-1 IPTG分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6 h條件下含重組質(zhì)粒PET30a-LcMADS12的大腸桿菌BL21總蛋白。M: Protein molecular weight marker; 1: Negative control before induced by IPTG; 2-7: Total proteins of E. coli BL21 containing the recombinant plasmid PET30a-LcMADS12 induced by 0.5 mmol·L-1 IPTG for 1, 2, 3, 4, 5 and 6 h, respectively.

研究發(fā)現(xiàn)，禾谷類(lèi)植物，如大麥、高粱(Sorghumbicolour)、水稻的SEP-like類(lèi)基因在花序中大量表達(dá)，在根、莖和葉中表達(dá)水平很低或不表達(dá)[32]。小麥TaSEP1/TaSEP2基因在內(nèi)、外稃片中表達(dá)量較高，在雄蕊和雌蕊中表達(dá)量次之，在漿片和穎片中表達(dá)較弱[14]，說(shuō)明這兩個(gè)基因可能具有控制花器官發(fā)育的功能。小麥TaAGL16/TaAGL30在營(yíng)養(yǎng)器官中不表達(dá)，在小穗中高表達(dá)，同LcMADS12基因表達(dá)相似；同時(shí)TaAGL16/TaAGL30在小麥發(fā)育種子中有表達(dá)[13]。玉米相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ZMM8和ZMM14兩基因在頂花的分生組織中都有表達(dá),當(dāng)ZMM14 的旁系同源基因IFA1突變后，突變體表現(xiàn)為小穗中出現(xiàn)額外的小穗和小花，且雌蕊器官數(shù)目增多[33-34]。本研究中羊草LcMADS12蛋白序列與水稻OsMADS7、OsMADS8蛋白序列的同源性分別為86%和80%，而水稻OsMADS7和OsMADS8主要在漿片、雄蕊、雌蕊中表達(dá),在內(nèi)外稃中不表達(dá)[11]。羊草LcMADS12在根、莖、葉中不表達(dá)，在雄蕊、雌蕊、內(nèi)稃中表達(dá)量較高，與OsMADS7、OsMADS8有相似之處[11-10, 32]，推測(cè)LcMADS12基因在進(jìn)化上與TaAGL16/TaAGL30及OsMADS7基因具有一定的保守性。

此外，本研究將羊草LcMADS12基因與原核表達(dá)載體pET-30a重組，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LcMADS12能夠與His標(biāo)簽蛋白形成融合蛋白，且通過(guò)本研究確定了融合蛋白的高效表達(dá)體系。重組蛋白的獲得對(duì)后續(xù)純化目的蛋白及在體外驗(yàn)證LcMADS12與其他MADS-box蛋白的相互作用奠定了基礎(chǔ)。