秦立金, 徐 峰, 劉永勝, 王學(xué)敏, 李 全, 云興福**

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黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌多樣性及其對黃瓜枯萎病發(fā)生的影響*

秦立金1,2, 徐 峰3, 劉永勝4, 王學(xué)敏5, 李 全1, 云興福1**

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 呼和浩特 010018; 2. 赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 赤峰 024000; 3. 赤峰市敖漢旗農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心 赤峰 024000; 4. 陜西省渭南市潼關(guān)縣農(nóng)業(yè)局園藝站 渭南 714300; 5. 內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院 巴彥淖爾 015000)

本試驗以黃瓜與西芹間作種植模式為處理, 黃瓜單作和西芹單作種植模式為對照, 利用Illumina公司Miseq平臺對上述不同處理土壤進(jìn)行16S rDNA細(xì)菌群落多樣性高通量測序分析和田間接種黃瓜枯萎病菌, 探討黃瓜與西芹間作模式土壤細(xì)菌的多樣性及其對田間黃瓜枯萎病發(fā)生的影響。16S rDNA測序結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作土壤的細(xì)菌物種總數(shù)最多, 群落多樣性水平最高, 與對照相比顯著提高了土壤細(xì)菌observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)(<0.05); Beta多樣性聚類分析表明, 黃瓜與西芹間作土壤的環(huán)境群落物種與黃瓜單作和西芹單作有一定差異性。在門分類水平上, 共檢測到45個菌門, 其中變形菌門占明顯優(yōu)勢, 其次為酸桿菌門和放線菌門等; 黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌種類所占比例最高, 達(dá)98.63%。在屬水平上, 共檢測到428類菌屬, GP6、GP16、GP4、芽單胞菌屬、節(jié)細(xì)菌屬5屬的豐度值較大; 黃瓜與西芹間作土壤的節(jié)細(xì)菌屬分布比例最高,紅游動菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽球菌屬豐度值較大, 為黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌明顯優(yōu)勢菌屬。田間接種黃瓜枯萎病菌試驗結(jié)果表明, 采用上述3種不同種植模式土壤種植黃瓜, 在黃瓜苗期接種黃瓜枯萎病菌, 黃瓜與西芹間作處理的黃瓜枯萎病的田間發(fā)病率較西芹單作和黃瓜單作分別降低57.03%~63.54%和66.95%~72.15%。因此, 黃瓜與西芹間作增加了土壤細(xì)菌群落多樣性, 降低了黃瓜枯萎病的發(fā)病率, 對后茬黃瓜土傳病害防控具有一定科學(xué)指導(dǎo)意義。

黃瓜枯萎病; 黃瓜與西芹間作; 16S rDNA測序; 土壤細(xì)菌多樣性; 田間發(fā)病率; 菌群豐度

黃瓜枯萎病是由尖鐮孢菌黃瓜?；?f. sp.)侵染而引起的維管束壞死的一種真菌性土傳病害, 危害嚴(yán)重, 防治困難, 至今未找到一種有效的防治方法。已有研究表明, 植物土傳病害的發(fā)生與土壤微生物之間有一定的關(guān)系[1], 且有一些微生物能夠有效降低土傳病害的發(fā)生。蘇阿德等[2]證實芽孢桿菌(spp.)能降低番茄青枯病的發(fā)生; 高芬等[3]發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌()對黃瓜枯萎病菌(f.sp.)具有良好抑制作用; 假單胞菌(spp.)中許多細(xì)菌菌株可以有效地抑制多種真菌和細(xì)菌引起的根部病害[4]。很多相關(guān)研究均證實了土壤細(xì)菌種群多樣性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對土壤真菌的抑制作用有重要影響[5-6]。

利用間作套種能較好地控制多種土傳病害發(fā)生的報道在國內(nèi)外已有很多[7-9]。董艷等[10]利用小麥()與蠶豆()進(jìn)行間作, 發(fā)現(xiàn)蠶豆根際微生物數(shù)量顯著增加, 而蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)顯著降低。蘇世鳴[11]利用旱作水稻()與西瓜()進(jìn)行間作, 發(fā)現(xiàn)二者間作處理的總微生物數(shù)量顯著增加, 且間作處理的西瓜均生長正常, 而單作西瓜枯萎病發(fā)病率非常高, 達(dá)66.7%。

目前, 關(guān)于黃瓜枯萎病的防治與土壤微生物多樣性之間關(guān)系的報道較少, 特別是黃瓜()與西芹()間作對土壤微生物多樣性的研究尚少見報道。本課題組近幾年的大量研究結(jié)果表明, 西芹能有效防控黃瓜枯萎病的發(fā)生[12-14]。本研究在此基礎(chǔ)上, 選擇西芹為黃瓜間作作物, 田間種植并接種黃瓜枯萎病菌, 通過采集不同種植模式的土壤進(jìn)行16S rDNA高通量測序和田間調(diào)查枯萎病發(fā)病率, 揭示黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌群落的變化規(guī)律和預(yù)防枯萎病發(fā)生的防治效果, 進(jìn)一步探討黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌群落多樣性變化與黃瓜枯萎病田間發(fā)病之間的關(guān)系, 為通過間套混作等農(nóng)業(yè)措施改善設(shè)施土壤微生態(tài)環(huán)境以及土傳病害田間防控提供科學(xué)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料

試驗地位于內(nèi)蒙古呼和浩特市賽罕區(qū)(110°40′~ 112°10′E, 40°36′~40°57′N), 該區(qū)土壤為黏壤土, 年平均氣溫13.6 ℃, 年日照時數(shù)1 600 h, 無霜期113~134 d, 年平均降水量335.2~534.6 mm, 中溫帶大陸性季風(fēng)氣候。0~20 cm供試土壤基本化學(xué)性質(zhì)為: pH 6.61, 電導(dǎo)率93.65 μS×cm-1, 有機(jī)質(zhì)43.73 g×kg-1, 硝態(tài)氮7.42 mg×kg-1, 銨態(tài)氮1.77 mg×kg-1, 速效磷77.63 mg×kg-1,速效鉀259.62 mg×kg-1。因年年種植黃瓜, 造成土壤連作, 土傳病害發(fā)生嚴(yán)重, 尤其是枯萎病發(fā)生嚴(yán)重, 發(fā)病率達(dá)30%~40%。供試黃瓜品種為‘津春四號’, 由天津科潤黃瓜研究所提供。供試西芹品種為‘美國西芹’, 由壽光惠農(nóng)種業(yè)有限公司提供。供試菌種黃瓜枯萎病菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 土樣采集及處理方法

田間種植試驗于2017年2—9月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科研教學(xué)基地進(jìn)行。以黃瓜與西芹間作種植(JZ)為處理, 西芹單作(XD)和黃瓜單作(HD)種植為對照。黃瓜單作于3月24日播種育苗, 4月24日定植, 株行距35 cm×55 cm。西芹單作于2月14日播種育苗, 4月24日定植, 株行距30 cm×20 cm。黃瓜與西芹間作采用二者隔行種植, 1行黃瓜, 2行西芹, 4月24日定植, 種植密度同上。每處理3次重復(fù), 完全隨機(jī)排列, 小區(qū)面積18 m2, 常規(guī)管理。7月27日(黃瓜拉秧前), 使用土鉆采用“X”型5點取樣法, 采集植株附近0~15 cm耕層土壤, 將土樣充分混勻后, 一部分土壤裝塑封袋, 送實驗室于室內(nèi)陰涼處, 攤開晾干, 剔除植物殘體、石塊和其他雜物, 風(fēng)干后磨碎, 過2 mm篩孔放于-80 ℃冰箱保存, 用于16S rDNA細(xì)菌多樣性分析。另一部分土壤作為苗缽?fù)练N植黃瓜, 進(jìn)行黃瓜枯萎病菌接種試驗。

1.2.2 黃瓜枯萎病田間接種方法

用上述不同土壤種植黃瓜, 每處理裝25個苗缽, 4次重復(fù)。28 ℃光照培養(yǎng)箱恒溫催芽, 待黃瓜種子露白時, 將其播種于上述苗缽里, 每穴1粒。在黃瓜幼苗第1片真葉完全展開時, 采用灌根法接種黃瓜枯萎病菌Foc, Foc濃度為1.0×106個×mL-1, 接種菌量為5 mL×缽-1, 接種7 d后開始調(diào)查枯萎病發(fā)病情況, 每隔2 d調(diào)查1次, 共調(diào)查5次, 計算黃瓜枯萎病病情指數(shù)和抑制率。黃瓜枯萎病不同發(fā)病級數(shù)參照標(biāo)準(zhǔn)為: 0級, 無癥狀; 1級, 胚軸及子葉輕微萎蔫, 子葉失去光澤; 2級, 植株輕度萎蔫或子葉萎蔫; 3級, 植株明顯萎蔫或矮化; 4級, 植株嚴(yán)重萎蔫或倒伏枯死。

病情指數(shù)(%)=100×Σ(病情級值×該級病情株

數(shù))/(病情最高級值×總株數(shù) (1)

防治效果(%)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/

對照病情指數(shù)×100% (2)

1.3 16S rDNA試驗流程

將田間采集的上述土壤樣品送往上海聯(lián)川生物工程有限公司, 利用OMEGA的試劑盒提取土壤DNA。對提取到的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測, 查看基因組DNA的完整度與濃度。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量, 以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。16S rDNA測序使用高可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建庫, 文庫構(gòu)建步驟遵循Illumina測序儀文庫構(gòu)建方法。具體步驟為: 本次16S rDNA測序以V3和V4為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計, V3和V4大約共469 bp, 不同物種長度上會有略微差異。引物圍繞V3和V4周圍的保守區(qū)域設(shè)計, 16S rDNA融合319F引物(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和融合R引物(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’), 其中, F、R為Miseq測序平臺通用引物。使用Phusion酶擴(kuò)增相應(yīng)高可變區(qū), 使用DNA模板50 ng, 25mL的PCR體系, 擴(kuò)增35個循環(huán)。一輪擴(kuò)增反應(yīng)之后, 在正反向引物兩端分別加上不同的adapters和barcodes, 再進(jìn)行下一輪擴(kuò)增, 擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物純化之后進(jìn)行上機(jī)測序。PCR擴(kuò)增體系如下:TMHot Start Version12.5mL; Forward Primer(1) 2.5mL; Reverse Primer(1) 2.5mL; Template DNA 50 ng; ddH2O 25mL。PCR產(chǎn)物用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer做歸一化處理。構(gòu)建好的文庫上樣到cBot或簇生成系統(tǒng), 利用Illumina MiSeq測序儀進(jìn)行2 x 300 bp paired-end測序。對于MiSeq測序獲得的雙端數(shù)據(jù), 首先根據(jù)barcode信息進(jìn)行樣品區(qū)分, 然后根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行merge拼接成tag, 接著對拼接完成的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾, 隨后進(jìn)行Q20、Q30等質(zhì)控分析。對最終獲得clean數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Alpha多樣性指數(shù)及數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0方差分析Duncan多重比較和Excell軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤細(xì)菌OUT分布venn圖

宏基因組測序經(jīng)常用OTU, 即可操作分類單元(operational taxonomy unit)進(jìn)行物種分類及物種相對豐度的分析。本試驗采用CD-HIT將序列相似性大于97%的clean tags定為一個OTU, 選擇其中序列最長的reads做為該OTU的代表序列, 通過OTU分析樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。不同處理土樣細(xì)菌venn圖如圖1所示。測序結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作土樣的OUT總數(shù)最多, 為6 793種; 黃瓜單作次之, 為6 357種; 西芹單作最少, 為6 341種。其中, 3種不同處理土壤共有細(xì)菌種類可達(dá)3 748種, 不同細(xì)菌種類中, 黃瓜與西芹間作土壤最多, 達(dá)587種, 比黃瓜單作和西芹單作分別增加27.89%和38.12%, 說明黃瓜與西芹間作處理增加了土壤細(xì)菌的新種類。

圖1 不同處理土壤細(xì)菌OUT分布venn圖

XD、HD、JZ分別代表西芹單作、黃瓜單作和黃瓜與西芹間作。XD, HD, and JZ indicate celery monoculture, cucumber monoculture and cucumber-celery intercropping, respectively.

2.2 不同處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.2.1 Alpha多樣性指數(shù)

Alpha多樣性指數(shù)能夠反映細(xì)菌群落的豐富度和均勻度, 不同處理土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表1。結(jié)果表明, 不同處理土壤細(xì)菌物種不同, 黃瓜與西芹間作處理的土壤observed species指數(shù)和Chao1指數(shù)均達(dá)到最大值, 土壤細(xì)菌物種最豐富, 與西芹單作和黃瓜單作達(dá)顯著差異(0.05); 不同處理土壤細(xì)菌生物多樣性水平也存在顯著差異, 黃瓜與西芹間作處理的土壤細(xì)菌群落多樣性水平最高, Shannon指數(shù)最高, 高于西芹單作和黃瓜單作, 且與二者達(dá)顯著性差異(0.05)。Alpha多樣性水平的不同說明黃瓜與西芹間作處理改變了土壤細(xì)菌群落的組成和分布, 增加了間作處理土壤的細(xì)菌群落多樣性, 黃瓜單作次之, 西芹單作最低。不同處理間Simpson指數(shù)無顯著性差異。

2.2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性通常用于分析不同環(huán)境群落之間的物種差異性。本試驗Beta多樣性分析是基于各土樣的OTU組成分析結(jié)果, 采用weighted unifrac法計算土樣間距離(表2), 根據(jù)計算得到的樣品距離矩陣, 采用UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)方法對土樣進(jìn)行聚類, 做出聚類樹形(圖2)。表2表明, 黃瓜與西芹間作和西芹單作的距離系數(shù)最小, 為0.14; 黃瓜與西芹間作處理和黃瓜單作距離系數(shù)其次, 為0.16; 黃瓜單作和西芹單作距離系數(shù)最大, 為0.16。圖2表明, 黃瓜與西芹間作(JZ1與JZ2)聚為一類, 黃瓜單作(HD1, HD2, HD3)聚為一類, 西芹單作(XD1, XD2與XD3)聚為一類, 說明黃瓜與西芹間作處理后, 土壤環(huán)境群落的物種不同于黃瓜單作和西芹單作, 具有一定差異性。

表1 不同處理土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析

同列不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。Data with different lowercase letters in the same column are significantly different at 0.05 level.

表2 Weighted unifrac法計算的不同處理樣品土壤細(xì)菌群落間的距離

XD、HD、JZ分別代表西芹單作、黃瓜單作和黃瓜與西芹間作。1、2和3為各處理的重復(fù)。XD, HD, and JZ indicate celery monoculture, cucumber monoculture and cucumber-celery intercropping, respectively. 1, 2 and 3 show replicates of treatments.

圖2 不同處理樣品土壤細(xì)菌群落的聚類樹形圖

XD、HD、JZ分別代表西芹單作、黃瓜單作和黃瓜與西芹間作。1、2和3為各處理的重復(fù)。XD, HD, and JZ indicate celery monoculture, cucumber monoculture and cucumber-celery intercropping, respectively. 1, 2 and 3 show replicates of treatments.

2.3 不同處理土壤細(xì)菌在門水平的分布

2.3.1 細(xì)菌門水平群落組成

在門分類水平上, 不同處理土壤細(xì)菌群落組成見表3。表3表明, 16S rDNA共檢測出45個菌門, 其中變形菌門(Proteobacteria)是明顯優(yōu)勢類群, 其次為酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。上述5類菌門中, 黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌群豐度百分比之和最高, 為87.33%, 其次為黃瓜單作和西芹單作, 分別為86.44%和85.70%, 差異不明顯; 門分類水平菌群豐度百分比為前10種細(xì)菌中, 黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌群落組成所占比例最高, 達(dá)98.63%, 比黃瓜單作和西芹單作分別增加1.69%和1.22%。其中, 酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門所占比例增加最高, 黃瓜與西芹間作處理所占比例達(dá)53.70%, 明顯高于黃瓜單作和西芹單作, 比黃瓜單作和西芹單作分別增加9.75%和7.90%, 說明黃瓜與西芹間作豐富了土壤細(xì)菌群落, 增加了土壤細(xì)菌種類。而變形菌門與上述3種菌門所占比例不同, 黃瓜與西芹間作土壤所占比例最低, 為33.63%, 黃瓜單作所占比例最高, 為36.77%, 西芹單作次之, 為36.67%, 達(dá)差異顯著性(0.05)。

表3 不同處理土壤細(xì)菌在門水平上的群落組成

表中只列出門分類水平上菌群豐度百分比≥0.1%的菌門。同行不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。XD、HD、JZ分別代表西芹單作、黃瓜單作和黃瓜與西芹間作。Only phyla with ≥0.1% abundance percentages were listed. Data with different lowercase letters in the same line are significantly different at 0.05 level. XD, HD, and JZ indicate celery monoculture, cucumber monoculture and cucumber-celery intercropping, respectively.

2.3.2 土壤細(xì)菌門水平群落分布

物種分類熱圖(taxa heat map)顏色梯度變化及相似程度能夠反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。圖3表明, 不同豐度的物種經(jīng)過分塊聚集后不同土壤細(xì)菌群落組成既有一定相似性, 又表現(xiàn)出一定差異性。在門分類水平上, 黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌群落分布的比對期望值(expectation value)最大, 顏色最深, 說明物種豐富度高, 西芹單作和黃瓜單作次之。聚類分析表明, 黃瓜單作和西芹單作土壤細(xì)菌種類豐度一致, 群落結(jié)構(gòu)相似, 聚為一類, 黃瓜與西芹間作土壤與之不同。OP3、綠彎菌門、Cyanobacteria、WS3、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門、變形菌門、放線菌門、浮霉菌門(Planctomycetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、酸桿菌門、Latescibacteria、綠彎菌門在黃瓜與西芹間作土壤中表達(dá)量最高, 豐富度最高。其中, OP3與綠彎菌門、WS3和擬桿菌門分別聚為一類, 在不同土壤中表達(dá)量分別為黃瓜與西芹間作>黃瓜單作>西芹單作。芽單胞菌門與變形菌門聚為一類, 在不同土壤中表達(dá)量分別為黃瓜與西芹間作>西芹單作>黃瓜單作。浮霉菌門與硝化螺旋菌門、迷蹤菌門與酸桿菌門、Latescibacteria與綠彎菌門分別聚為一類, 在不同土壤中表達(dá)量為黃瓜與西芹間作>西芹單作>黃瓜單作。其中, 比較特殊的是藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobateria), 其在不同土壤中的表達(dá)量為黃瓜單作>黃瓜與西芹間作>西芹單作, 而Candidatus Saccharibacteria的表達(dá)量為西芹單作>黃瓜與西芹間作>黃瓜單作。Others與unclassified菌門在黃瓜與西芹間作土壤表達(dá)量最高, 說明間作處理土壤還有大量其他或未知菌門需要進(jìn)一步鑒定、分類和分析。

圖3 不同處理土壤細(xì)菌門水平的物種分類熱圖

XD、HD、JZ分別代表西芹單作、黃瓜單作和黃瓜與西芹間作。XD, HD, and JZ indicate celery monoculture, cucumber monoculture and cucumber-celery intercropping, respectively.

2.4 不同處理土壤細(xì)菌在屬水平上分布

2.4.1 土壤細(xì)菌屬水平群落組成

不同土壤細(xì)菌屬水平群落組成見圖4。在屬分類水平上, 16S rDNA共檢測出428類細(xì)菌, 其中, GP6、GP16、GP4、芽單胞菌屬()、節(jié)細(xì)菌屬()5屬的豐度值較大, 平均占檢測總菌屬的20.3%。不同土壤細(xì)菌屬水平分布結(jié)構(gòu)不同, 存在一定差異性。土壤細(xì)菌菌群豐度百分比≥0.1%的菌屬平均占34.9%, 其他(菌群豐度百分比<0.1%和未分類菌屬)菌屬占65.1%, 其中, 未分類菌屬平均占33.9%。黃瓜與西芹間作土壤的節(jié)細(xì)菌屬分布比例最高, 為1.73%, 高于黃瓜單作和西芹單作, 分別為1.67%和1.07%, 一般研究認(rèn)為, 節(jié)細(xì)菌屬是環(huán)境微生物中代謝煙堿的優(yōu)勢種群, 可以通過固氮作用產(chǎn)生多種植物激素以促進(jìn)作物水分和礦質(zhì)元素吸收。其余紅游動菌屬()、鞘氨醇單胞菌()和芽球菌屬()也占一定比例。

2.4.2 土壤細(xì)菌屬水平群落分布

不同土壤細(xì)菌物種屬水平分類熱圖如圖5所示。結(jié)果表明, 不同豐度的物種經(jīng)過分塊聚集后不同土壤細(xì)菌群落組成既有一定相似性, 又表現(xiàn)出了一定差異性。其中, 在屬分類水平上, 黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌群落分布顏色最深, 比對期望值最大, 物種豐度最高, 說明其細(xì)菌群落組成最豐富。聚類分析表明, 黃瓜單作和西芹單作土壤細(xì)菌種類豐度一致, 群落結(jié)構(gòu)相似, 聚為一類, 而黃瓜與西芹間作未與之聚為一類。GP16、GP6、GP4、鞘氨醇單胞菌屬、GP17在黃瓜與西芹間作土壤中表達(dá)量最高, 豐富度最高。其中, GP16與GP6聚為一類, 在不同土壤中表達(dá)量為黃瓜與西芹間作>黃瓜單作>西芹單作; 鞘氨醇單胞菌屬與GP17聚為一類, 在不同土壤中表達(dá)量為黃瓜與西芹間作>西芹單作>黃瓜單作。比較特殊的是紅游動菌屬和, 其表達(dá)量為西芹單作>黃瓜與西芹間作>黃瓜單作。

圖4 不同處理土壤細(xì)菌屬水平上的群落組成

XD、HD、JZ分別代表西芹單作、黃瓜單作和黃瓜與西芹間作。XD, HD, and JZ indicate celery monoculture, cucumber monoculture and cucumber-celery intercropping, respectively.

圖5 不同處理土壤細(xì)菌屬水平上的物種分類熱圖

2.5 黃瓜與西芹間作對黃瓜枯萎病田間發(fā)病的影響

不同土壤田間種植黃瓜, 在黃瓜第1片真葉完全展開時, 采用灌根法接種黃瓜枯萎病菌FOC, 接種7 d后不同土壤黃瓜枯萎病發(fā)病情況及防治效果如表4所示。結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作處理土壤黃瓜枯萎病病情指數(shù)明顯低于西芹單作和黃瓜單作, 且分別與黃瓜單作和西芹單作達(dá)顯著差異(<0.05)。接種黃瓜枯萎病菌后, 隨著接種日期的延后, 不同土壤的黃瓜枯萎病病情指數(shù)均呈現(xiàn)逐漸增加趨勢, 接種13 d后, 病情指數(shù)趨于穩(wěn)定變化趨勢較小。黃瓜與西芹間作對西芹單作對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)57.03~ 63.54%, 對黃瓜單作的防治效果達(dá)66.95%~72.15%。

表4 不同處理土壤對黃瓜枯萎病發(fā)病及防治效果的影響

同列不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。Data with different lowercase letters in the same column are significantly different at 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

3.1 黃瓜與西芹間作土壤微生物多樣性分析

微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)功能上起著重要作用, 研究微生物群落有助于更好地認(rèn)識土壤特性[15]。環(huán)境改變、根際化感物質(zhì)或分泌物質(zhì)量和數(shù)量改變都會引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化[16]。已有研究表明, 利用小麥與黃瓜進(jìn)行間作, 改變了黃瓜土壤微生物的區(qū)系組成, 土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量明顯增加[17]; 黃瓜與毛苕子()間作, 黃瓜根際微生物多樣性水平明顯增加, 土壤生態(tài)環(huán)境得到明顯改善[18]。有研究表明, 西芹根系能夠分泌酸類、酯類、酚類、醇類及含氮化合物等物質(zhì), 這些物質(zhì)與植物間化感作用密切相關(guān)[19]。本試驗利用宏基因組學(xué)16S rDNA高通量測序技術(shù)對黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析, 測序結(jié)果能夠較高程度地分析不同土壤的細(xì)菌群落多樣性, 結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作增加了土壤細(xì)菌種群種類和數(shù)量, 豐富了黃瓜與西芹間作土壤Alpha多樣性, 提高了黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌生物多樣性水平。Beta多樣性聚類分析表明, 黃瓜與西芹間作土壤環(huán)境群落的物種與黃瓜單作和西芹單作不同, 具有一定差異性。

16S rDNA測序結(jié)果表明, 在門水平上共檢測出45個菌門, 其中變形菌門占明顯優(yōu)勢, 其次為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門。同時, 不同土壤樣品中未分類菌門(unclassified bacteria)仍占有一定比例, 說明各樣品土壤中仍存在大量未知和稀有細(xì)菌。通過對不同土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析, 雖然黃瓜與西芹間作處理與黃瓜單作和西芹單作細(xì)菌整體分布結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定, 但分布存在一定差異。不同土壤變形菌門(33.63%~36.77%)是最豐富的細(xì)菌類群, 這一結(jié)果與國內(nèi)外關(guān)于農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性的很多研究一致[20]。其次為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門。放線菌門細(xì)菌偏好堿性環(huán)境, 且土壤中較高的碳氮比及低分子有機(jī)質(zhì)含量能更好地促進(jìn)作物生長。綠彎菌門細(xì)菌可通過光合作用產(chǎn)生能量, 并且對于土壤環(huán)境的污染具有一定降解功能。本試驗研究結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作土壤的放線菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門所占比例高于黃瓜單作和西芹單作; 門水平物種分類熱圖結(jié)果進(jìn)一步表明, 黃瓜與西芹間作土壤的細(xì)菌物種最豐富, 黃瓜單作和西芹單作細(xì)菌種類豐度一致, 群落結(jié)構(gòu)相似, 聚為一類, 而黃瓜與西芹間作與黃瓜單作和西芹單作不同。

16S rDNA測序結(jié)果表明, 在屬水平上共檢測出428個菌屬, 其中, GP6、GP16和GP4 3種酸桿菌、芽單胞菌屬、節(jié)細(xì)菌屬5類菌屬豐度值較大, 平均占檢測菌屬20.3%, 其次, 紅游動菌屬、鞘氨醇單胞菌和芽球菌屬也占一定比例。未分類(unclassified)菌屬所占比例較高, 達(dá)33.9%, 說明各樣品土壤中仍存在大量未知和稀有細(xì)菌需要進(jìn)一步鑒定和分析,探索其功能和作用。本試驗結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作土壤的節(jié)細(xì)菌屬分布比例最高, 其可以通過固氮作用產(chǎn)生多種植物激素, 對促進(jìn)黃瓜和西芹吸收水分和礦質(zhì)元素具有一定作用; 鞘氨醇單胞菌是降解土壤有毒物質(zhì)最有效的微生物之一, 且可以促進(jìn)作物根際營養(yǎng)吸收、抵抗多種病原菌, 有研究認(rèn)為, 鞘氨醇單胞菌屬某些菌株還具有固氮和脫氫特性, 在維持植物土壤氮平衡方面起著重要作用[21]。本研究中黃瓜與西芹間作土壤的鞘氨醇單胞菌為較具優(yōu)勢的一類種群, 分布比例達(dá)1.1%; 芽球菌屬在黃瓜與西芹間作土壤中也占有一定比例, 有研究表明, 芽球菌屬能夠抵御不良的環(huán)境條件、防治土壤病害的發(fā)生[22]。

3.2 黃瓜與西芹間作土壤微生物多樣性與黃瓜枯萎病發(fā)生的關(guān)系

國內(nèi)外研究表明, 土壤微生物多樣性與土傳病害的發(fā)生具有很強(qiáng)相關(guān)性[23]。一方面, 土傳病害的發(fā)生會降低土壤微生物多樣性, 相比于健康土壤, 患有馬鈴薯青枯病土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化且多樣性明顯減少[24]。另一方面, 土壤微生物中群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的變化也會影響土傳病害的發(fā)生, 土壤微生物多樣性與群落結(jié)構(gòu)對土壤抑病能力非常關(guān)鍵, 微生物多樣性高的土壤病原菌數(shù)量少且外源病原菌難以入侵生存[25]。已有研究表明, 黃瓜枯萎病的發(fā)生及發(fā)病程度的輕重, 是病原菌和土壤中各種微生物相互作用的結(jié)果[26]。土壤微生物多樣性與植物土傳病害抑制水平密切相關(guān), 根際微生物在抑制土傳病害和促進(jìn)植物生長過程中具有重要的作用[27]。本試驗中, 在黃瓜與西芹間作土壤上種植黃瓜, 田間接種黃瓜枯萎病菌后, 其枯萎病發(fā)病率明顯降低, 可能與土壤放線菌門、節(jié)細(xì)菌屬、鞘氨醇單胞菌比例增加有關(guān), 這些菌門和菌屬細(xì)菌種類的增加促進(jìn)了黃瓜植株的生長, 增強(qiáng)了黃瓜植株抵抗病原菌的能力, 從而降低了黃瓜枯萎病菌的田間發(fā)病率。

本研究以傳統(tǒng)栽培模式為背景, 將黃瓜作為種植主體, 選擇具有化感作用的西芹為間作植物, 對黃瓜與西芹間作模式下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成、變化和田間黃瓜枯萎病發(fā)生進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 黃瓜與西芹間作豐富了土壤細(xì)菌生物多樣性水平, 改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu), 增加了一些有益菌的數(shù)量, 提高了田間黃瓜植株對黃瓜枯萎病菌的抵抗能力, 從而降低了黃瓜枯萎病菌的田間發(fā)病率, 對今后通過間套作等農(nóng)業(yè)措施修復(fù)土壤和防控土傳病害具有指導(dǎo)意義。

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Analysis of soil bacterial diversity under cucumber-celery intercropping and its influence on cucumberwilt*

QIN Lijin1,2, XU Feng3, LIU Yongsheng4, WANG Xuemin5, LI Quan1, YUN Xingfu1**

(1. College of Agriculture, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Life Science, Chifeng University, Chifeng 024000, China; 3. Agricultural Technical Service Center of Aohan Banner, Chifeng 024000, China; 4. Horticultural Station of Tongguan County Agricultural Bureau in Weinan City, Shaanxi Province, Weinan 714300, China; 5. Research Institute of Agriculture and Animal Husbandry in Bayannur City, Inner Mongolia, Bayannur 015000, China)

Cucumber wilt is a soil disease that is highly prevalent in the production and cultivation of cucumber. The disease is highly difficulttoprevent and cure. A number of studies have shown that intercropping was one of the most effective methods of reducing the occurrence of plant soil diseases. Also celery has been proven to have high allelopathy. To explore the application of allelopathic effects of celery on cucumber fusarium wilt control, we conducted cucumber and celery intercropping experiment. In the experiment, three planting patterns were set, which were cucumber-celery intercropping, celery monocropping and cucumber monocropping. The cucumber-celery intercropping pattern was regarded as treatment group and monocropping patterns of celery and cucumber regarded as the control group. The Miseq platform of Illumina Company was used to analyze 16S rDNA bacterial community diversity through high-throughput sequencing to discuss the influence of cucumber-celery intercropping on cucumber soil bacterial diversity. Cucumber was planted in soil from different planting patterns and inoculated withf.sp.(Foc) in the pot experiment to investigate the control effect of cucumber-celery intercropping on cucumber fusarium wilt. The 16S rDNA sequencing results showed that total bacterial species amount and community diversity were highest in soil under cucumber-celery intercropping, which significantly enhanced observed bacteria species index, Shannon index and Chao1 index (< 0.05). Beta diversity clustering analysis showed there existed a difference in environmental community species between soil from cucumber-celery intercropping and mono-cropped cucumber or celery. Moreover, 15 bacterial phyla were detected. Proteobacteria, which was followed by Acidobacteria and Actinobacteria, had a distinct advantage (35.7%-38.0%). Then the proportion of bacterial species derived from cucumber-celery intercropped soil was highest (98.63%). About 428 bacterial genera were detected with 5 dominant bacterial genera, which were GP6, GP16, GP4,and.,,andwere dominant bacteria genera in cucumber-celery inter-cropped soil. The 4 genera demonstrated that cucumber and celery intercropping enriched the diversity of bacterial communities compared with monocropped celery or cucumber. The results of fusarium wilt inoculation experiment of cucumber suggested that the control efficiency of cucumber-celery intercropping to cucumber fusarium wilt reached 57.03%-63.54% and 66.95%-72.15% relative to monocroped celery and cucumber, respectively. Therefore cucumber-celery intercropping increased the diversity of bacterial communities, and reduced incidence rate of cucumber fusarium wilt. This was of scientific interest for the prevention and control of soil borne diseases.

Cucumber fusarium wilt; Cucumber-celery intercropping; 16S rDNA sequencing; Soil bacterial diversity; Field incidence;Bacteria abundance

, E-mail: yxf5807@163.com

Jan. 19, 2018;

Mar. 22, 2018

S476

A

1671-3990(2018)08-1180-10

云興福, 研究方向為高寒地區(qū)蔬菜栽培與生理。E-mail: yxf5807@163.com 秦立金, 研究方向為設(shè)施蔬菜土傳病害生物防治與土壤修復(fù)。E-mail: 1597355169@qq.com

2018-01-19

2018-03-22

* This study was founded by the National Natural Science Foundation of China (31160100) and the Inner Mongolia Autonomous Region Application Technology Research and Development Project (201602050).

10.13930/j.cnki.cjea.180097

* 國家自然科學(xué)基金項目(31160100)和內(nèi)蒙古自治區(qū)應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目(201602050)資助

秦立金, 徐峰, 劉永勝, 王學(xué)敏, 李全, 云興福. 黃瓜與西芹間作土壤細(xì)菌多樣性及其對黃瓜枯萎病發(fā)生的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2018, 26(8): 1180-1189

QIN L J, XU F, LIU Y S, WANG X M, LI Q, YUN X F. Analysis of soil bacterial diversity under cucumber-celery intercropping and its influence on cucumberwilt[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(8): 1180-1189