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(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

0 引言

蠶蛹?xì)ぞ厶菫棣?型甲殼素脫乙酰衍生物，結(jié)晶度較低，因此溶解性強(qiáng)于蝦蟹殼聚糖，蠶蛹?xì)ぞ厶窃谙∷崛芤喝芙夂?，所形成聚合物具有較大透氣性和透濕性[1-5]。蠶蛹?xì)ぞ厶侨芙庑噪m強(qiáng)于蝦蟹殼聚糖，但因其殼聚糖分子結(jié)構(gòu)上的功能基團(tuán)以及分子內(nèi)、分子間的氫鍵使它的結(jié)構(gòu)緊密，且僅能溶解在酸性溶液中，水溶性較差，這制約了蠶蛹?xì)ぞ厶堑膽?yīng)用，因此有必要對蠶蛹?xì)ぞ厶沁M(jìn)行改性，以達(dá)到利用其生物活性和生理活性的目的。

殼聚糖分子中存在著羥基和氨基的特征結(jié)構(gòu)，這有利于對它進(jìn)行物理和化學(xué)改性，引入化學(xué)基團(tuán)以改善殼聚糖的物理和化學(xué)性質(zhì)。季銨鹽是銨離子中的四個氫原子都被烴基取代而生成的化合物，季銨鹽可以通過胺與鹵代烴反應(yīng)制取，它易溶于水且有較強(qiáng)的抗菌性能，因其特有的性能被廣泛用于各種化合物改性中[6-10]。目前季銨鹽類消毒劑被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、生物制劑以及農(nóng)業(yè)中。利用季銨鹽對殼聚糖進(jìn)行改性，若兩者結(jié)合既能保留季銨鹽的水溶性好的特點(diǎn)，又能增強(qiáng)兩者都具有的抗菌性能，這樣的化合物將具有更好的應(yīng)用前景。本研究對蠶蛹來源的殼聚糖進(jìn)行季銨鹽化改性，并對得到的殼聚糖衍生物進(jìn)行性能檢測，以初步探討蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶蛹?xì)ぞ厶?脫乙酰度70.02%，實(shí)驗(yàn)室自制)，LB培養(yǎng)基、瓊脂粉，2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)、鉻酸鉀、硝酸銀、無水乙醇、丙酮、異丙酮及其它藥品均為市購分析純，金黃色葡萄糖球菌、大腸桿菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的合成

制備蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽[11]，稱取蠶蛹?xì)ぞ厶?0g，加入有500mL異丙醇三口燒瓶中，在溫度(85± 5)℃條件下水浴加熱，并進(jìn)行50r/min攪拌。將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)配置成n(EPTAC)∶n(-NH2)=8∶1的水溶液，用流滴管加入三口燒瓶中，反應(yīng)8h后固液分離。將所得到的固體用無水乙醇洗滌3次，再用3倍體積丙酮沉淀分離，沉淀物再用丙酮洗滌3次。真空抽濾得到固相產(chǎn)品，置于(45±1)℃的烘箱中烘干，得到的黃色固體產(chǎn)品即為蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽。

1.2.2 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的取代度測定

稱取一定量蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽置于盛有一定量1%醋酸溶液中，以加快蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的溶解。攪拌至蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽完全溶解后，以鉻酸鉀溶液作為顯色指示劑，加入0.01 moL/L的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)滴定液進(jìn)行滴定，測定殼聚糖衍生物樣品中Cl-的含量，將滴定終點(diǎn)的AgNO3體積帶入公式(1)計(jì)算蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽取代度。

(1)

其中：c為AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(moL/L)；v為AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；w為蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的重量(g)；DD為蠶蛹?xì)ぞ厶堑拿撘阴６?%)；314為單元?dú)ぞ厶羌句@鹽的分子量；162為單元?dú)ぞ厶堑姆肿恿俊?/p>

1.2.3 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的結(jié)構(gòu)表征

采用BRUKER公司的VECTOR22型傅立葉變換紅外光譜儀，用KBr壓片法進(jìn)行測定。將蠶蛹?xì)ぞ厶?、蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽分別與KBr混合壓片，以KBr為參比，然后用紅外光譜儀分析，掃描次數(shù)15次，測定范圍500～4000cm-1。

1.2.4 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的抑菌性能

采用涂布平板法制備試驗(yàn)平板，平板中涂布的菌液濃度分別為3×103、3×105和3×107CFU/mL。采用K-B紙片法進(jìn)行抗菌性能檢測，將濾紙用打孔器制成6mm的圓片，121℃高壓滅菌后烘干，浸泡于1%、0.5%、0.25%的蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽溶液中12 h，置于試驗(yàn)平板中，于37℃培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的取代度

取代度反應(yīng)蠶蛹?xì)ぞ厶前被槐蝗〈陌俜謹(jǐn)?shù)，用以衡量取代的難易程度。根據(jù)將滴定終點(diǎn)的AgNO3體積帶入公式(1)，計(jì)算蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽取代度為33.61%。

2.2 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的結(jié)構(gòu)表征

蠶蛹?xì)ぞ厶羌捌浼句@鹽的紅外光譜分析見圖1。

注：a為蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽；b為蠶蛹?xì)ぞ厶菆D1 蠶蛹?xì)ぞ厶羌捌浼句@鹽的紅外光譜圖

如圖1所示，在蠶蛹?xì)ぞ厶堑募t外光譜在1653.87cm-1處存在N-H 的彎曲振動峰，而在蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的紅外圖譜中1653.87cm-1處的N-H的彎曲振動峰已經(jīng)消失；同時(shí)在1653.87cm-1和1479.66cm-1處出現(xiàn)了兩個新的強(qiáng)吸收峰，這是季銨基團(tuán)中-CH3的吸收峰；除此之外，二者的紅外圖譜波形相對來說沒有明顯差別。以上紅外光譜數(shù)據(jù)表明蠶蛹?xì)ぞ厶欠肿又械?NH2上的氫原子已經(jīng)成功地被EPTAC取代，制備得到了蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽。

2.3 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽的抑菌性能

將蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽溶液進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，測試抑菌圈直徑，效果如表1所示。

表1 蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽抑菌圈直徑(cm)

注：-表示因平板中菌體生長過于分散，不能分辨抑菌效果，故未能測量抑菌圈直徑。

由表1中結(jié)果可知，蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且隨著試驗(yàn)平板中菌體濃度的增加，抑菌圈直徑有下降的趨勢。在菌體濃度均為3×107CFU/mL的情況下，蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽在金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑較大腸桿菌的大；在菌體濃度均為3×105CFU/mL的情況下，1%蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽在3×105CFU/mL濃度的大腸桿菌中的抑菌圈直徑更大，而0.5%和0.25%蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽則在對金黃色葡萄球菌的抑菌中表現(xiàn)得效果更好。在金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)中，由于3×103CFU/mL濃度的金黃色葡萄球菌在平板中生長得過于分散，無法分辨蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽各試驗(yàn)組的抑菌圈大??；在3×107CFU/mL和在3×105CFU/mL兩個濃度的抑菌試驗(yàn)中，則仍表現(xiàn)出隨菌體濃度增加，抑菌圈直徑下降的結(jié)果。這是因?yàn)楫?dāng)抑菌劑含量一定時(shí)，抑菌圈的大小跟菌體濃度有很大關(guān)系，如果菌體濃度過大，會拮抗抑菌劑的作用，導(dǎo)致抑菌圈偏小。

3 結(jié)論

利用2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)對自制蠶蛹?xì)ぞ厶沁M(jìn)行季銨鹽化改性，得到了取代度為33.61%的蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽。蠶蛹?xì)ぞ厶羌句@鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較對大腸桿菌的強(qiáng)。