孟凱聞， 孟 賡， 林德貴， 張 迪， 金藝鵬

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 北京 海淀 100193)

貓杯狀病毒(FelineCalicivirus，F(xiàn)CV)屬于杯狀病毒科(Calicivirudae)皰疹病毒屬(Vesivirus)，為二十面體對稱的球形無囊膜病毒，直徑35～39 nm，病毒衣殼由排列成二聚體的180個蛋白質(zhì)分子組成，形成90個殼粒，衣殼在生物組成上只含有一種蛋白(VP1)。FCV基因組為全長7 683 bp的單股正鏈線性RNA(ssRNA)。

FCV是一種在貓科動物中廣泛傳播的常見病原，病貓或健康帶毒貓是本病的常見傳染源，病毒隨宿主分泌物和排泄物排出造成污染，易感貓通過與病貓或病貓分泌物、排泄物及被病毒污染的籠具接觸而感染發(fā)病。貓可通過鼻、口或結(jié)膜途徑感染FCV，感染后主要在口腔和呼吸道組織中復(fù)制，部分病毒株由于組織嗜性和致病性方面的差異也可由內(nèi)臟組織、糞便和尿液中分離得到[1]。

FCV的感染通常以貓的上呼吸道和口腔病變?yōu)橹?，舌上頻繁出現(xiàn)水皰和潰瘍是典型的感染特征，此外還可導(dǎo)致四肢潰瘍、跛行、流產(chǎn)、肺炎和貓慢性齦口炎，而高毒力FCV毒株甚至可導(dǎo)致死亡。

1 杯狀病毒家族

FCV屬于杯狀病毒科皰疹病毒屬。杯狀病毒科分為5個屬：兔病毒屬(Lagovirus)、紐伯病毒屬(Nebovirus)、諾如病毒屬(Norovirus)、沙波病毒屬(Sapovirus)和皰疹病毒屬，其中僅有諾如病毒屬和沙波病毒屬可感染人，合稱人類杯狀病毒，而紐伯病毒屬為新設(shè)立的病毒屬[2]。杯狀病毒家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系如圖1。

圖1 基于衣殼蛋白氨基酸序列以鄰接法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

SSLVV：虎頭海獅杯狀病毒(NC_011050)；VESV：豬小皰疹病毒(NC_002551)；WCV：海象杯狀病毒(NC_004541)；RVV：兔皰疹病毒(NC_008580)；FCV：貓杯狀病毒(NC_001481)；CaCV：犬杯病毒(NC_004542)；SMSV：圣米格爾海獅病毒(NC_025676)；MCV：水貂杯狀病毒(NC_019712)；FBCV：鼬獾皰疹病毒(NC_027122)；GoCV：鵝杯狀病毒(NC_024078)；Bat_SV：蝙蝠沙波病毒(NC_017936)；PES：豬腸道沙波病毒(NC_000940)；SV-Dresden：沙波病毒德國分離株(NC_006269)；SV-Nagoya：沙波病毒日本分離株(NC_027026)；SMV10：沙波病毒泰國分離株(NC_010624)；SCV12：沙波病毒日本分離株C12(NC_006554)；EBHSV：歐洲野兔綜合征病毒(NC_002615)；RaCV：兔杯狀病毒(NC_011704)；BoCV：牛杯狀病毒(NC_030793)；NAV1：紐伯病毒-1(NC_007916)；CITV：杯狀病毒-TCG(NC_006875)；CsNV-NB：紐伯病毒-NB(NC_004064)；ASCV：大西洋鮭魚杯狀病毒(NC_024031)；SVSV：豬杯狀病毒(NC_012699)；NoV_GV：諾如病毒-GV(NC_008311)；NoV_GI：諾如病毒-GI(NC_001959)；SimianNoV：靈長動物諾如病毒(NC_031324)；RHDV：兔出血癥病毒(NC_001543)。系統(tǒng)進(jìn)化樹利用MEGA7繪制[3]

2 分子生物學(xué)特性

FCV基因組全長7 683 bp，為單股正鏈線性RNA(ssRNA)。FCV基因組3′端具polyA結(jié)構(gòu)，5′端以共價鍵與病毒連接蛋白(VPg)相連。共包含3個開放閱讀框(ORF)：ORF1(20～5 311 nt)、ORF2(5 314～7 320 nt)、ORF3(7 317～7 634 nt)，其中ORF2的終止密碼子與ORF3的起始密碼子具有4個重疊的核苷酸：ATGA(7 317～7 320 nt)。FCV的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白分別由不同的ORF編碼(圖2)。

圖2 基因組閱讀框及其所編碼產(chǎn)物的對應(yīng)關(guān)系

ORF1編碼多聚蛋白，該蛋白經(jīng)2C肽鏈內(nèi)切酶C24(3C樣半胱氨酸蛋白酶)的自催化加工作用，被切割形成非結(jié)構(gòu)蛋白p5.6、p32、p39(核苷水解酶NTPase)、p30、p13(VPg)以及p76(蛋白酶聚合酶Pro-Pol)。其中經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Pro-Pol的N末端具有抑制宿主基因表達(dá)的作用[4]，而其本身又可被C24切割形成用于切割衣殼蛋白前體的成熟蛋白酶和RNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵蛋白RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。編碼C24的基因序列位于ORF1中編碼RdRp的序列上游，與小RNA病毒中的3C樣蛋白酶具有同源性，除了對自身的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割外，C24亦可通過切割降解宿主細(xì)胞的細(xì)胞RNA結(jié)合蛋白抑制細(xì)胞中應(yīng)激顆粒(SGs)的組裝[5]。切割形成的非結(jié)構(gòu)蛋白中僅VPg存在于成熟的病毒顆粒，為翻譯起始所需。在成熟病毒顆粒中，VPg利用第1段α螺旋上的24位酪氨酸(Y24)與FCV基因組的5′端GDP共價連結(jié)，與起始密碼子(AUG)直接相互作用，并由此處附近通過ORF1編碼蛋白質(zhì)[6-7]。NTPase用于切割核苷酸，此外還具有抑制細(xì)胞I型干擾素信號通路的作用[8]。ORF1合成的另外3種蛋白質(zhì)：p5.6、p30、p32，此3種蛋白質(zhì)具體功能仍無定論。2010年，根據(jù)Bailey等人的研究結(jié)果，表明FCV的p32、NTPase和p30蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的重組有關(guān)，說明它們可能在FCV的復(fù)制過程中起作用[9]。

在感染杯狀病毒的細(xì)胞中有2種RNA：病毒基因組RNA(約7.6 kb)和亞基因組RNA(約2.4 kb)。后者3′端、5′端結(jié)構(gòu)與病毒基因組相同，包含ORF2和ORF3閱讀框，在經(jīng)FCV感染的細(xì)胞內(nèi)可以檢測到。

ORF 2編碼前體衣殼蛋白(75 kDa)，隨后被ORF1編碼的蛋白酶切割為成熟衣殼蛋白VP1(62 kDa)和前導(dǎo)衣殼蛋白LC(14 kDa)。2010年Ossiboff R J 等人利用X射線衍射法，對貓杯狀病毒衣殼蛋白(PDB:3M8L)進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析，分辨率為3.4 A°，如中插彩版圖3所示，F(xiàn)CV的衣殼蛋白共含有180個VP1蛋白，構(gòu)成的90個拱形二聚體殼粒又組成32個中央凹陷的杯狀體排列在T=3的二十面對稱體上；VP1分為3個結(jié)構(gòu)域，NTA、S和P，P結(jié)構(gòu)域又被分成2個亞結(jié)構(gòu)域P1和P2，P2結(jié)構(gòu)域位于衣殼外殼和病毒顆粒的最外表面上，是大多數(shù)中和表位所在的區(qū)域[10]。

ORF3編碼次要衣殼蛋白VP2(12 kDa)，每個成熟病毒顆粒中含有1或2個，VP2可影響FCV的復(fù)制、成熟、蛋白合成及病毒顆粒的形成過程，自然的病毒顆粒需VP1、VP2共同組裝[11]。但人們對VP2的合成及作用機(jī)制尚不清楚。

3 致病機(jī)制

FCV的細(xì)胞受體是貓接合黏附分子-A(fJAM-A)，該分子是廣泛分布于貓組織中的免疫球蛋白(Ig)超家族成員之一。2008年，Bhella等人利用冷凍電子顯微鏡和三維圖象重建技術(shù)，分析出了FCV與其受體結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)圖，分析顯示,fJAM-A 的免疫球蛋白樣胞外域D1與FCV VP1的P2域外表面相結(jié)合，誘導(dǎo)FCV衣殼發(fā)生構(gòu)象變化，據(jù)此推測FCV-fJAM-1相互作用可引發(fā)病毒的脫殼[12]。2018年，新的研究進(jìn)一步調(diào)查了細(xì)胞受體與病毒間的相互作用，鑒定出了VP1蛋白上在病毒與受體結(jié)合的過程中發(fā)揮重要作用的保守殘基[13]。

一般情況下，病毒侵入細(xì)胞后進(jìn)行生物合成，過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)經(jīng)宿主細(xì)胞內(nèi)線粒體上的接頭蛋白傳遞信號，最終可活化干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子3(IRF-3)，激活I(lǐng)型干擾素信號通路，產(chǎn)生抗病毒作用。但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV中的非結(jié)構(gòu)蛋白NTPase具有抑制IRF-3活化的作用，使得I型干擾素信號通路被阻斷，宿主細(xì)胞無法產(chǎn)生干擾素發(fā)揮抗病毒作用[8]。

另一方面，發(fā)生病毒感染時，細(xì)胞會將mRNA存儲于應(yīng)激顆粒(SGs)使翻譯受阻以抑制蛋白質(zhì)合成，這一機(jī)制限制了能量和營養(yǎng)物質(zhì)的利用利于細(xì)胞存活，同時可阻止病毒的增殖。SGs的組裝是通過具有聚集傾向的細(xì)胞RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動的，此類蛋白如G3BP1，與mRNA及某些細(xì)胞蛋白相互結(jié)合后形成致密的顆粒聚合體，即SGs。而FCV感染后，病毒3C樣蛋白酶于E405切割位點(diǎn)處使G3BP1裂解，導(dǎo)致SGs無法裝配[5]。

近年，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV的致細(xì)胞病變作用(CPE)和在宿主細(xì)胞中的擴(kuò)散有賴于LC蛋白與細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)的相互作用，而與CPE活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基為LC序列中保守的3個半胱氨酸殘基，研究中觀察到LC蛋白的過度表達(dá)可導(dǎo)致單層貓腎細(xì)胞死亡[14]。

4 臨床癥狀與病理變化

貓口炎是貓的常見口腔疾病，易反復(fù)發(fā)作且難以根治，諸多報(bào)道顯示，貓口炎與FCV感染密切相關(guān)，但FCV在慢性口腔炎癥中的具體作用尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室研究闡明。經(jīng)研究表明，F(xiàn)CV不是慢性口炎的唯一致病作用，并推測該病可能并非由FCV單獨(dú)直接致病，而與宿主的免疫應(yīng)答具有更高的相關(guān)性[15]。

主要表現(xiàn)為口腔黏膜紅腫、增生，嚴(yán)重時出現(xiàn)潰爛，患貓常有流涎、口臭癥狀，且伴有采食困難、咀嚼障礙。病理檢查顯示，輕度炎癥(1級)時感染區(qū)域內(nèi)上皮細(xì)胞輕度增生、角化不全，固有層和黏膜下層炎性細(xì)胞增多；中度炎癥(2級)時上皮細(xì)胞在變性/潰瘍區(qū)域內(nèi)不同程度變性，固有層和黏膜下層炎性細(xì)胞繼續(xù)增多且聚集在一起形成帶狀；嚴(yán)重感染(3級)時，感染區(qū)域內(nèi)上皮細(xì)胞變性、水腫，形成潰瘍，滲出物內(nèi)含有多量巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，固有層和黏膜下層中大量炎性細(xì)胞浸潤、出血[16]。

5 診斷、治療與預(yù)防

FCV的診斷方法包括：通過臨床癥狀判斷、病毒的分離培養(yǎng)、RT-PCR和血清學(xué)測定。其中臨床常用的檢測方法為RT-PCR，咽拭子是首選采樣方法。近期，又有學(xué)者提出結(jié)合應(yīng)用新一代測序技術(shù)(NGT)與目標(biāo)基因捕獲技術(shù)(TGC)，有可能解決在多病原復(fù)雜樣品中檢測低拷貝數(shù)目標(biāo)病原體的問題[17]。而目前市場上可應(yīng)用于臨床的商業(yè)化FCV快速檢測卡仍是空白。

貓口炎的治療包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療，對于紅腫發(fā)炎病例和潰瘍較輕的病例采用非手術(shù)治療的方法較好，而對于潰瘍嚴(yán)重和流涎不能進(jìn)食病例采用手術(shù)治療方法較好[18]。手術(shù)治療以全口拔牙和切除增生組織為主；非手術(shù)治療則包括給予抗生素、皮質(zhì)類固醇、非甾體抗炎藥(NSAIDs)，由于NSAIDs的療效不佳，長效皮質(zhì)醇常作為藥物首選。但長期使用長效皮質(zhì)類固醇，具有誘發(fā)貓的II型糖尿病(DM)的風(fēng)險(xiǎn)，因此長期使用皮質(zhì)類固醇藥物在治療慢性貓口炎中仍存在爭議的[19]。

最近提出的針對FCV及其所引起的臨床癥狀的藥物有如下幾種：泛昔洛韋，作為核苷酸類似物，可在細(xì)胞或病毒聚合酶參與的DNA或RNA鏈起始和延伸階段與生理核苷酸競爭，臨床有治愈全身性FCV感染的案例[20]；2015年，Kim Y等人新合成了靶向作用于FCV復(fù)制所必需的3C樣蛋白的肽基化合物，這些成分在染病的小鼠模型和細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了廣泛的抗病毒活性和安全性[21]；此外，還有免疫調(diào)節(jié)化合物重組貓干擾素-ω(rFeIFN-ω)，臨床有兩例攜帶FCV的慢性齦口炎綜合征患病貓?jiān)诳诜蓴_素60 d后痊愈[19]。

目前，貓口炎尚無特效療法，應(yīng)以預(yù)防為主，注意飼養(yǎng)管理和口腔衛(wèi)生。FCV的預(yù)防主要通過接種疫苗，F(xiàn)CV疫苗以減毒活疫苗和滅活疫苗為主。近期有研究表明，鼻內(nèi)接種實(shí)驗(yàn)室滅活的無佐劑FCV全病毒顆?？蓪ν床《井a(chǎn)生免疫，同時抑制異源病毒增殖[22]；另有研究指出，初次皮下接種疫苗21 d后，進(jìn)行1次經(jīng)口服(舌下)的加強(qiáng)免疫，可增強(qiáng)FCV疫苗的療效[23]，但該方法不易于制成目前市場更流行的聯(lián)苗。傳統(tǒng)疫苗在病毒防制過程中起到重要作用，但只能減少臨床發(fā)病率和病毒的排出，無法防止感染，隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，也不斷有學(xué)者嘗試新型疫苗的研究。

6 展望

貓口炎作為貓的常見病，嚴(yán)重影響貓科動物生活質(zhì)量，甚至有致死風(fēng)險(xiǎn)，然而尚無特效療法，目前以預(yù)防為主。針對這一問題，應(yīng)從FCV與貓口炎的高度關(guān)聯(lián)性入手，通過對FCV結(jié)構(gòu)特性及感染機(jī)制的研究，改進(jìn)其現(xiàn)有的檢測方法，制作快速、靈敏的臨床檢測試劑盒；以病毒衣殼的組裝機(jī)制和與受體分子的相互作用為研究切入點(diǎn)，研發(fā)更有針對性的抗病毒藥物；同時研制新型疫苗，解決免疫失敗問題，更好的防控FCV相關(guān)疾病。