羅云，方朝暉

1.杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 311106；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

糖尿病患病率及患病人數(shù)急劇上升，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后第3大對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害的非傳染性疾病。糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，主要累及心、腦、下肢等外周大血管，是糖尿病致死致殘的主要原因。既往研究證實(shí)益氣養(yǎng)陰活血方丹蛭降糖膠囊(DJC)可以降低血糖，調(diào)控血脂，改善胰島素抵抗，調(diào)控炎癥因子，防治糖尿病血管并發(fā)癥[1～6]。本研究探討DJC對(duì)糖尿病動(dòng)脈硬化模型大鼠p22phox、p47phox mRNA表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(210.45±4.26)g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(皖)：2011-002]。動(dòng)物飼養(yǎng)在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，室內(nèi)溫度控制在18～22℃，濕度40%～70%，分籠喂養(yǎng)，給予充足的飼料及飲用水。

1.2 藥物和試劑 DJC(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號(hào)：20131126)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；0.1 mmol/L檸檬緩沖液(北京夏斯生物技術(shù)有限公司)；檸檬酸/檸檬酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；引物(invitrogen公司)；Na2-EDTA·2H2O(華綠淵生物公司)；dNTP(Promega 公司)；兩步法qRT-PCR試劑盒(Thermo公司)；SOD、GSH-px、ET、一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.3 儀器 血糖儀、試紙(美國強(qiáng)生公司)；普通PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀(Tanon EPS 300型)；全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；三洋-80℃低溫冰柜(日本SANYO公司)；溫度梯度基因擴(kuò)散儀(德國MIONETRA)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司)；微量移液器、排槍(德國Eppendorf)；切片機(jī)(德國LEICA公司)；全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)。

1.4 造模及分組 SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只與造模組50只?？瞻讓?duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)。造模組按70萬IU/kg的總劑量灌胃維生素D3，分3天給完，同時(shí)高脂飼料喂養(yǎng)，誘發(fā)快速動(dòng)脈硬化的大鼠模型[7]。4周以后，采用35 mg/kg STZ腹腔注射，誘發(fā)糖尿病合并動(dòng)脈硬化大鼠模型。注藥72 h以后，所有大鼠禁食不禁水12 h測(cè)量血糖，同時(shí)，隨機(jī)選取空白組大鼠1只和模型組大鼠2只并處死，取胸主動(dòng)脈2～3 cm，用于觀察主動(dòng)脈粥樣硬化病變及其程度，將出現(xiàn)主動(dòng)脈硬化病變及血糖≥16.7 mmol/L確定為造模成功[8]。模型大鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止。最終造模成功的大鼠總共有39只，將這些大鼠按照隨機(jī)化原則分為4組，分別為模型組，丹蛭降糖膠囊(DJC)低、中、高劑量組，大鼠數(shù)量分別為9、10、10、10只。

1.5 給藥方法 按單位體質(zhì)量劑量來算，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍[8]。將等效劑量定為DJC中劑量，DJC中劑量的1/2、2倍分別為DJC低劑量和高劑量，計(jì)算出DJC低、中、高劑量分別為0.235、0.470、0.940 g/(kg·d)?？瞻讓?duì)照組和模型組予生理鹽水5 mL/(kg·d)灌胃，灌胃時(shí)間均為12周。

1.6 胸主動(dòng)脈病理組織學(xué)檢測(cè) 分離胸主動(dòng)脈，取2～3 cm，置于10%中性福爾馬林緩沖液。酒精脫水，中性樹膠封片，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度。

1.7 空腹血糖（FBG）測(cè)定 藥物治療前后，用美國強(qiáng)生血糖儀測(cè)定大鼠尾靜脈血糖。

1.8 胸主動(dòng)脈p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)檢測(cè) 取大鼠胸主動(dòng)脈，提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，qRNA擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參。p22phox引物上游：5'-TTGTTGCAGGA GTGCTCATC-3'， 下 游 ： 5'-TGGGCCATTTCTGTGTGTAA-3'，產(chǎn)物片段 282 bp；p47phox引物上游：5'-CCCAGCGACA GATTAGAAGC-3'， 下 游 ： 5'-TGACTGCCTCCTCTCATCCT-3'，產(chǎn)物片段475 bp；GAPDH引物上游：5'-CAAGGTCATCCATG ACAACTTTG-3'，下游：5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，產(chǎn)物片段496 bp。采用自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以(±s)表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)通過對(duì)數(shù)變換使其接近正態(tài)分布；多個(gè)均數(shù)間比較采用方差分析，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 造模過程中，總共有9只大鼠沒有達(dá)到高血糖標(biāo)準(zhǔn)；模型組死亡1只，發(fā)現(xiàn)腹部有撕咬傷口，考慮打斗致死；DJC低劑量組死亡1只，發(fā)現(xiàn)尾部破潰糜爛，考慮繼發(fā)感染致死；DJC高劑量組死亡1只，未發(fā)現(xiàn)特殊異常，死因無法判斷。最后結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組、模型組、DJC低劑量組、DJC中劑量組、DJC高劑量組的數(shù)量分別為：9、8、9、10、9只。

2.2 糖尿病動(dòng)脈硬化大鼠模型的評(píng)價(jià) 見圖1，圖2。HE染色切片顯示，空白對(duì)照組(A)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，無局部缺損；內(nèi)皮細(xì)胞完整；中膜層平滑肌細(xì)胞排列整齊，無增生現(xiàn)象。造模組(B)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜有明顯損傷，連續(xù)性被破壞；內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，細(xì)胞體積和細(xì)胞間的連接間隙增大；中膜平滑肌排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞受損明顯，說明造模成功。

圖1 空白對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈組織H E染色切片結(jié)果(×400)

圖2 造模組大鼠胸主動(dòng)脈組織H E染色切片結(jié)果 (×400)

2.3 各組大鼠治療前后FBG水平比較 見表1。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠治療前后FBG水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與治療前比較，DJC中、高劑量組大鼠FBG降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，治療后DJC中、高劑量組大鼠FBG水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與DJC低劑量組比較，治療后DJC中、高劑量組大鼠FBG水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠治療前后FBG水平比較(±s) mmol/L

表1 各組大鼠治療前后FBG水平比較(±s) mmol/L

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與DJC低劑量組比較，③P＜0.05；與治療前比較，④P＜0.01

組 別空白對(duì)照組模型組D J C低劑量組D J C中劑量組D J C高劑量組n 989109治療前4.89±0.7821.01± 3.12①21.00±3.0420.82±3.1120.76±3.24治療后4.49±0.5220.23± 2.45①19.71±2.8114.57± 3.34②③④14.73± 3.00②③④

2.4 各組大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)比較 見表2，圖3。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，DJC低、中、高劑量組大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與DJC低劑量組比較，DJC中、高劑量組大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 各組大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與DJC低劑量組比較，③P＜0.01

組 別空白對(duì)照組模型組D J C低劑量組D J C中劑量組D J C高劑量組n 989109 p22phox mRNA 0.50±0.021.09± 0.04①0.84± 0.01②0.70± 0.03②③0.65± 0.02②③p47phox mRNA 0.49±0.021.09±0.02①0.89±0.04②0.71± 0.02②③0.67± 0.04②③

圖3 各組大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討論

血管內(nèi)皮功能損傷是糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病基礎(chǔ)，也是2型糖尿病(T2DM)大血管病變一個(gè)重要的初始步驟[9]。糖尿病患者長期的高糖狀態(tài)及持續(xù)的血糖波動(dòng)，導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)減少，氧化應(yīng)激引起血管內(nèi)皮炎癥，損傷血管內(nèi)皮功能[10]。有研究結(jié)果顯示，高糖狀態(tài)通過上調(diào)促血管生成素2(Ang-2)表達(dá)，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力[11]。血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)、NO是反映內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)，NO是血管舒張因子，ET-1可收縮各種血管，兩種因子的相互協(xié)調(diào)維護(hù)正常的血管張力，若此種平衡被打破，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，促成或加重血管病變[12]。

氧化應(yīng)激是機(jī)體在受到內(nèi)外環(huán)境有害因素刺激后，體內(nèi)的活性氧簇被誘發(fā)生成，起初機(jī)體自身調(diào)節(jié)機(jī)制可以將其清除，但隨著生成的日益增多，過剩的那部分便會(huì)對(duì)機(jī)體造成巨大的損害。血管組織中的氧化應(yīng)激可以造成血管內(nèi)皮功能損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷[13]。高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要因素是氧化應(yīng)激。在高糖環(huán)境下，活性氧(ROS)形成增多，通過激活多元醇、蛋白激酶C(PKC)、JNK、PI3K/AKT等信號(hào)通路誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞造成內(nèi)皮功能障礙[14]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)是反映機(jī)體抗氧化能力的常用指標(biāo)，糖尿病合并血管并發(fā)癥患者SOD和GSH-px水平會(huì)出現(xiàn)不同程度的降低[15]。NADPH氧化酶是一種過氧化物酶，是體內(nèi)ROS的重要來源之一。p22phox、p47phox是NADPH的兩個(gè)重要亞基，p22phox、p47phox mRNA的表達(dá)水平與體內(nèi)氧化應(yīng)激的強(qiáng)弱有密切的關(guān)系。

方朝暉教授針對(duì)T2DM大血管病變做了諸多的理論文獻(xiàn)研究，在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，并結(jié)合多年的臨床實(shí)踐積累，認(rèn)為2型糖尿病大血管病中醫(yī)病機(jī)多為“氣虛陰虧血瘀”，治療當(dāng)以益氣養(yǎng)陰活血為大法，據(jù)此創(chuàng)制出丹蛭降糖膠囊。丹蛭降糖膠囊以牡丹皮、水蛭行氣活血，化瘀通絡(luò)；太子參補(bǔ)益脾腎之氣；生地黃滋養(yǎng)脾腎之陰，菟絲子補(bǔ)腎固精；澤瀉清熱瀉痰濁。全方陰陽互濟(jì)，補(bǔ)通兼施，寒溫并調(diào)，補(bǔ)不礙邪，攻不傷正，共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功。

本研究結(jié)果顯示，丹蛭降糖膠囊干預(yù)12周后，能夠降低糖尿病大鼠血糖，降低胸主動(dòng)脈p22phox mRNA和p47phox mRNA的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激，提示丹蛭降糖膠囊在防治糖尿病大血管并發(fā)癥上具有廣大前景，值得臨床推廣應(yīng)用。