吳 松，袁貝嘉，閆慧珺，方國東，張 俊，王玉軍*，周東美*

（1.中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；2.中國科學院大學，北京100049；3.南京外國語學校，南京 210008）

生物炭、活性炭、石墨等炭材料含有無定型的碳結構、微晶石墨結構、三維孔道結構、高比表面積和無機組分，在土壤肥力提升、污染物吸附去除和固碳減排等領域具有廣泛的應用前景[1]。近年來大量文獻報道了炭材料對環(huán)境中污染物的吸附去除作用[2]。此外，炭材料介導環(huán)境中有機污染物化學轉(zhuǎn)化的研究也有諸多報道[3-5]。但是關于炭材料對環(huán)境中Fe、As、C、N等元素的生物地球化學轉(zhuǎn)化過程影響的研究卻很少被報道。近年來，Klüpfel等[6]首次通過電化學方法測定了生物炭的得失電子能力，并推斷生物炭在元素的生物地球轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用。隨后生物炭以及生物炭的浸出液先后被報道能夠作為電子中介體，加速微生物還原胞外鐵礦[7-8]。此外，近期Saquing等[9]發(fā)現(xiàn)在厭氧環(huán)境中，生物炭既可以作為微生物代謝有機物的電子受體，又可以作為微生物還原硝酸鹽的電子供體。盡管這幾篇文獻陸續(xù)報道了生物炭在元素生物地球化學轉(zhuǎn)化過程中的電子穿梭體特性，但是關于炭材料在介導氧化還原反應過程中對重金屬污染物環(huán)境行為影響的研究報道較少。元素在生物地球化學轉(zhuǎn)化過程中通常會伴隨著巨大的環(huán)境效應。例如：在重金屬污染區(qū)域，鐵礦的還原溶解會導致鐵礦中重金屬的再釋放，造成潛在的環(huán)境風險。

隨著工業(yè)化和城市化進程的加速，大量的重金屬、有機污染物進入環(huán)境，對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定構成嚴重威脅。砷（As）是最普遍的環(huán)境有毒元素，它引起了全球性的環(huán)境健康問題[10]。流行病學研究表明，孟加拉國的居民由于長期飲用高As污染地下水，導致該國居民的皮膚、肝臟、膀胱、肺等器官癌變的風險增大[11]。環(huán)境中的生物過程能夠調(diào)控As的形態(tài)分布，從而影響As的環(huán)境毒性及其遷移轉(zhuǎn)化。對東南亞地區(qū)眾多沉積物樣品的分析發(fā)現(xiàn)，可提取態(tài)的As和Fe呈現(xiàn)正相關關系[12]。厭氧環(huán)境中鐵礦的還原溶解通常是由微生物主導，因此在淹水稻田、河口沉積物、濕地等厭氧環(huán)境中，微生物與鐵礦的相互作用對As的氧化還原轉(zhuǎn)化及遷移起重要作用[13]。

由于活性炭[14]和生物炭[6]具有得失電子能力，當它們進入環(huán)境中后，必然會影響微生物還原含As鐵礦的過程，進而引起礦物的溶解、轉(zhuǎn)化，以及次生礦物的生成，最終影響到As的溶解釋放、遷移轉(zhuǎn)化等環(huán)境行為。本文擬構建生物炭或活性炭、微生物以及含As水鐵礦的復合培養(yǎng)體系，探究生物炭和活性炭對微生物還原鐵礦過程的影響，以及鐵礦還原過程中As的溶解釋放行為。

1 材料與方法

1.1 生物炭、活性炭和含As水鐵礦的制備

木屑采自木材加工廠，經(jīng)過清洗烘干處理后，在馬弗爐中500℃燒制1 h，制備得到生物炭。實驗中使用的活性炭購自國藥集團（CAS：7440-44-0）。將生物炭和活性炭粉末放置于厭氧箱的進樣室中，抽真空24 h以去除吸附在活性炭中的氧氣；隨后在厭氧箱中加入除氧的超純水至炭的濃度為20 g·L-1；曝氮氣2 h，以除去懸液中殘留的氧氣并密封。最后將裝有20 g·L-1活性炭和生物炭懸液的血清瓶，置于滅菌鍋中121℃滅菌處理20 min。

含五價砷的水鐵礦[As（Ⅴ）-FH]通過共沉淀的方法合成：配制 1 mol·L-1的 Fe（NO3）3和 4.66 g·L-1的Na2HAsO4·7H2O的混合溶液，隨后用1 mol·L-1的KOH中和以上混合溶液，生成的沉淀即為As（Ⅴ）-FH，其中Fe∶As為50∶1（W∶W）[15]。合成的As（Ⅴ）-FH清洗后制備成懸液，懸液中Fe（Ⅲ）的濃度為200 mmol·L-1，裝入血清瓶中，曝氮氣除氧后，密封室溫保存。

1.2 微生物的培養(yǎng)

本研究選取在微生物胞外電子傳遞研究中使用的模式細菌Shewanmella oneidensis MR-1（ATCC No.700550）開展實驗。首先將S.oneidensis MR-1在LB培養(yǎng)基中（蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1）好氧培養(yǎng)16 h（150 r·min-1，28 ℃）。隨后離心收集菌體（6000 g，6 min），用厭氧碳酸鹽緩沖溶液清洗后，重懸于厭氧緩沖鹽溶液中（～2×1011cells·mL-1），除氧備用。

厭氧培養(yǎng)過程中的厭氧礦物質(zhì)培養(yǎng)基組成如下：0.6 g·L-1KH2PO4，0.3 g·L-1NH4Cl，0.5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.1 g·L-1CaCl2·2H2O；30 mmol·L-1NaHCO3；1 mL維生素溶液，1 mL硒-鎢溶液，1 mL微量元素溶液；pH為7.0±0.1。本研究中，30 mmol·L-1的乳酸鈉和10 mmol·L-1的As（Ⅴ）-FH分別作為培養(yǎng)基中的電子供體和電子受體供微生物代謝。

1.3 厭氧批培養(yǎng)實驗

厭氧批培養(yǎng)實驗在100 mL的血清瓶中進行。首先用注射器將2 mL的活性炭或生物炭懸液（20 g·L-1）或2 mL的滅菌超純水加入含有30 mmol·L-1乳酸鈉和10 mmol·L-1As（Ⅲ）-FH的厭氧礦物質(zhì)培養(yǎng)基。隨后接種1 mL S.oneidensis MR-1懸液或1 mL滅菌超純水，將血清瓶放入振蕩箱中避光培養(yǎng)（28℃，80 r·min-1），啟動厭氧批培養(yǎng)實驗。

在設定的時間點，于厭氧箱中取樣，取出的樣品分三份：0.1 mL的培養(yǎng)液加入1 mL的HCl（1 mol·L-1）中，用于測定培養(yǎng)體系中總的Fe（Ⅱ）和總Fe；培養(yǎng)液過濾后，收集0.1 mL濾液加入1 mL的HCl（1 mol·L-1）中，用于測定培養(yǎng)體系中溶解態(tài)的Fe（Ⅱ）和總Fe；培養(yǎng)液過濾后，收集0.1 mL濾液加入1 mL的H3PO4（10 mmol·L-1）中，用于測定培養(yǎng)體系中溶解態(tài)的As（Ⅲ）和總As。H3PO4可以減小富鐵水樣中As的氧化及沉淀，因此將用于測定濾液中溶解態(tài)As（Ⅲ）和總As的樣品保存在H3PO4溶液中[16]。

1.4 分析測定

Fe（Ⅱ）和總Fe均使用鄰菲羅啉法測定。As（Ⅲ）和總As的濃度通過原子熒光光譜儀測定（AFS-230E，Haiguang，China）[17]。培養(yǎng)體系中死菌和活菌的鑒定通過死活菌染色試劑盒（LIVE/DEAD BacLight，Invitrogen）進行分析。具體步驟如下：用注射器從培養(yǎng)瓶中取懸液0.5 mL加入2 mL離心管中，超聲振蕩1 min之后，渦旋振蕩5 min；200 g離心1 min，收集上清液，轉(zhuǎn)入新的1 mL離心管中；10 000 g離心5 min收集固體，用0.85%的NaCl溶液清洗；收集固體，重懸于0.5 mL的NaCl溶液中，分別加入1 μL的SYTO 9和Propidium iodide，用鋁箔紙包裹避光，放入振蕩箱中振蕩15 min（200 r·min-1，25 ℃）；離心收集固體，用NaCl溶液清洗兩遍，去上清；用10 μL的Na-Cl溶液重懸固體，轉(zhuǎn)移至載玻片，用蓋玻片覆蓋后，用熒光顯微鏡（Nikon 80i，Japan）觀察死菌和活菌。

分別在48 h和250 h，用注射器從培養(yǎng)瓶中取1 mL的培養(yǎng)液，用于制備掃描電子顯微鏡（SEM）樣品。SEM制樣步驟如下：將培養(yǎng)液7000 g離心5 min收集固體，用50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）清洗三遍；將固體重懸于50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液，同時加入戊二醛（終濃度為2.5%）和甲醛（終濃度為0.4%），固定30 min（可避免磷酸鹽與懸液中的固體反應生成新的沉淀）；7000 g離心5 min收集固體，用50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液清洗固體三遍；用水、15%、30%、50%、70%、90%、95%、100%和100%的乙醇對固體樣品進行梯度脫水，每個梯度10～15 min；脫水后的固體重懸于HMDS（Hexamethyldisilazane）中，30 s后離心收集固體，室溫放置10 min，密封保存。制備好的樣品噴金后，用SEM進行樣品形貌觀察（S-4800，Hitachi，Japan）。同時，分別在 48 h和250 h，將整瓶培養(yǎng)液-20℃冷凍之后，迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機中冷凍干燥。冷凍干燥完畢的樣品，迅速轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中收集固體，研磨后密封保存，盡快進行X射線衍射分析（XRD，Ultima IV，209 Rigaku，Japan）。

2 結果與討論

2.1 活性炭和生物炭對As（Ⅴ）-FH中Fe（Ⅱ）還原的影響

如圖1A所示，當接種S.oneidensis MR-1后，所有培養(yǎng)體系中Fe（Ⅱ）的比例均呈現(xiàn)增加的趨勢，但是在未接種細菌的對照組中，所有培養(yǎng)體系中Fe（Ⅱ）的比例在整個培養(yǎng)過程中均保持基本穩(wěn)定。在生物對照組中，F(xiàn)e（Ⅱ）的比例在84.5 h時達到52.7%，隨后基本維持穩(wěn)定。在加入活性炭和生物炭的培養(yǎng)體系中，F(xiàn)e（Ⅱ）的比例在84.5 h時分別為45.4%和47.6%。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，F(xiàn)e（Ⅲ）還原的比例始終呈增加趨勢，246 h時Fe（Ⅲ）還原的比例分別為100%和73.6%，遠高于此時生物對照組中Fe（Ⅲ）還原的比例（57.0%）。以上研究結果說明在培養(yǎng)初期，活性炭和生物炭的加入并未顯著促進微生物對鐵礦的還原，但隨著培養(yǎng)時間的延長，加入炭材料的培養(yǎng)體系中Fe（Ⅲ）還原的比例遠高于生物對照組。

已有研究發(fā)現(xiàn)，當生物炭施加入土壤后，它可以促進土壤中Fe2+持續(xù)不斷的生成并釋放至溶液中[18-20]。本研究中，通過檢測活性炭和生物炭對微生物還原As（Ⅴ）-FH過程中培養(yǎng)體系中Fe2+的生成量，發(fā)現(xiàn)在接菌并有活性炭和生物炭存在時，培養(yǎng)液上清中Fe2+的濃度緩慢增加，培養(yǎng)結束時達到最大值，分別為 1.01 mmol·L-1和 1.17 mmol·L-1。但是在沒有加入炭材料的生物對照組中，培養(yǎng)液上清中Fe2+的濃度在95.5 h時達到最大值1.65 mmol·L-1，隨后又逐漸降低至0.45 mmol·L-1，并基本維持穩(wěn)定。溶液中Fe2+濃度的降低，是由于Fe2+與培養(yǎng)體系中的陰離子形成沉淀[21]。在沒有接種S.oneidensis MR-1的培養(yǎng)體系中，整個培養(yǎng)周期均難以檢測到Fe2+（圖1B）。以上結果表明，活性炭和生物炭的加入使Fe2+的釋放減緩。由于活性炭和生物炭的加入既沒有促進培養(yǎng)初期微生物對鐵礦的還原，也沒有加速培養(yǎng)液中Fe2+的增加，因而我們推測可能是炭材料的加入對微生物的生長產(chǎn)生了影響。

2.2 活性炭和生物炭對微生物生長的影響

圖1 活性炭和生物炭對Shewanalla oneidensis MR-1還原含As（Ⅴ）-FH過程中Fe還原比例和Fe2+釋放的影響Figure 1 Effect of activated carbon and biochar on the percent of Fe reduced and the released Fe2+during Shewanalla oneidensis MR-1 reduction of As（Ⅴ）-bearing ferrihydrite

圖2 熒光染色法鑒定生物炭影響Shewanalla oneidensis MR-1還原As（Ⅴ）-FH過程Figure 2 Live-dead cell counts using epifluorescence microscopy in the culture suspensions during microbial reduction of As（Ⅴ）-FH in the absence（biotic control）and presence of biochar

以往的文獻報道結果表明，生物炭和活性炭可以明顯加速微生物還原鐵礦[7，14]，但是本研究中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)初期活性炭和生物炭沒有明顯促進微生物還原含As鐵礦，因而我們推斷這可能是本研究中使用的活性炭和生物炭具有生物毒性[22]。因此，我們進一步通過死活菌染色，表征體系中死菌和活菌的量（圖2）。當培養(yǎng)48 h時，在生物對照組中，所有菌體都呈現(xiàn)綠色熒光，為活菌；但在加入生物炭的培養(yǎng)體系中，大部分的菌呈現(xiàn)紅色熒光，為死菌。當培養(yǎng)120 h時，在生物對照組和加入生物炭的培養(yǎng)體系中，觀察到的都為活菌。當培養(yǎng)250 h時，在生物對照組中，觀察到的均為活菌；在加入生物炭的培養(yǎng)體系中，除了活菌外，還有部分死菌。因此，本研究中活性炭和生物炭的加入，在培養(yǎng)初期會對微生物的生長造成毒害作用，抑制了鐵礦的微生物還原，從而減緩了Fe2+的釋放；隨著培養(yǎng)時間的增加，微生物逐漸適應培養(yǎng)環(huán)境，活性炭和生物炭可以持續(xù)不斷地促進微生物還原鐵礦，從而加大了鐵礦的還原比例以及培養(yǎng)后期Fe2+的大量釋放。

2.3 活性炭和生物炭對As（Ⅴ）-FH中As釋放和轉(zhuǎn)化的影響

As（Ⅴ）-FH中Fe（Ⅲ）的還原及Fe2+的釋放會導致鐵礦中As的釋放和轉(zhuǎn)化?；钚蕴亢蜕锾客ǔ１砻鎺ж撾?，因而其對As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的吸附能力很弱[23]。因此，我們分析了活性炭和生物炭影響微生物還原As（Ⅴ）-FH的過程中，培養(yǎng)液上清中As（Ⅲ）和總As的濃度。結果如圖3A所示，當沒有加入活性炭和生物炭時，溶液中總As的濃度從0 h的1.86 mg·L-1升高至23.5 h的2.45 mg·L-1，隨后急劇下降，到84.5 h時降至0.01 mg·L-1，此后溶液中總As的濃度基本維持穩(wěn)定。但是，當加入活性炭和生物炭時，溶液中總As的濃度持續(xù)不斷地增加，分別到108 h和37.8 h達到最大值3.20 mg·L-1和2.51 mg·L-1，隨后緩慢降低，直到培養(yǎng)結束時才降到最低值，分別為0.13 mg·L-1和0.01 mg·L-1。與生物對照組相比，活性炭和生物炭的加入阻礙了培養(yǎng)液上清中As（Ⅴ）的去除。此外，對于以上As（Ⅴ）-FH的培養(yǎng)體系，在整個培養(yǎng)過程中，溶液中As（Ⅲ）的濃度始終低于0.08 mg·L-1（圖3B），這說明S.oneidensis MR-1不具有還原As（Ⅴ）的能力[15]。在沒有接種微生物的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)液上清中總As的濃度始終維持在1.68～2.24 mg·L-1，活性炭和生物炭的存在，僅會使溶液中總As的濃度稍微降低，這可能是由于活性炭和生物炭對As（Ⅴ）有微弱的吸附能力[23]。在培養(yǎng)初始階段培養(yǎng)液上清中即可以檢測到As，這是由于磷酸根（4.4 mmol·L-1）與As（Ⅴ）競爭水鐵礦表面的吸附位點，從而導致水鐵礦中共沉淀的As（Ⅴ）的溶出[24]。

圖3 活性炭和生物炭影響Shewanalla oneidensis MR-1還原含As（Ⅴ）-FH礦過程中溶液總As和As（Ⅲ）的濃度Figure 3 Effect of activated carbon and biochar on the concentration of total As and As（Ⅲ）in the supernatant during Shewanalla oneidensis MR-1 reduction of As（Ⅴ）-bearing ferrihydrite

2.4 活性炭和生物炭對次生礦物生成的影響

次生礦物的類型主要受Fe2+生成的速度和共存配體的類型影響[25-26]。因此，微生物還原As（Ⅴ）-FH過程中，培養(yǎng)48 h和250 h后生成的固體產(chǎn)物的礦物學組成，首先進行XRD檢測（圖4）。經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，在生物對照組和加入生物炭的培養(yǎng)體系中均檢測到藍鐵礦的生成，而在加入活性炭的培養(yǎng)體系中，沒有檢測到次生礦物的生成。經(jīng)過250 h的培養(yǎng)，次生礦物的譜峰強度增加，說明了礦物的含量在逐漸增加，在生物對照組中，既檢測到藍鐵礦，又檢測到菱鐵礦，而在加入活性炭和生物炭的培養(yǎng)體系中，均只檢測到藍鐵礦生成。在沒有接種微生物的培養(yǎng)體系中，均沒有檢測到次生礦物的生成（圖4B）。

為了驗證礦物學組成的結果，我們選取培養(yǎng)48 h和250 h后的固體樣品進行SEM觀察（圖5）。經(jīng)過48 h的培養(yǎng)：在生物對照組中，觀察到少量片狀的次生礦物生成，其余仍為無定型的水鐵礦；在加入活性炭的培養(yǎng)體系中，沒有觀察到明顯的次生礦物；在加入生物炭的培養(yǎng)體系中，觀察到少量片狀的次生礦物生成。經(jīng)過250 h的培養(yǎng)：在生物對照組中，觀察到大量片狀和立方體形的次生礦物生成；在加入活性炭的培養(yǎng)體系中，觀察到條片狀的次生礦物；在加入生物炭的培養(yǎng)體系中，觀察到大量片狀的次生礦物生成。

圖4 活性炭和生物炭影響微生物還原As（Ⅴ）-FH過程中固體樣品的礦物學組成（A）和沒有加微生物的對照組中固體樣品的礦物學組成（B）Figure 4 Effect of activated carbon and biochar on the composition of secondary mineral during Shewanalla oneidensis MR-1（A）and abiotic（B）reduction of As（Ⅴ）-bearing ferrihydrite

經(jīng)過48 h和250 h的培養(yǎng)，通過XRD檢測到的次生礦物種類與SEM觀察到的次生礦物種類均一致。因此，我們可以推斷出片狀的次生礦物為藍鐵礦，正方體形的次生礦物為菱鐵礦。Muehe等[15]也在厭氧培養(yǎng)體系中檢測到片狀的藍鐵礦和正方體形的菱鐵礦，與本研究結果一致。本研究中使用的厭氧礦物質(zhì)培養(yǎng)基的組成是根據(jù)地下環(huán)境中的地球化學組成模擬設計的[15，27]，其中磷酸根的濃度為 4.4 mmol·L-1，氯離子的濃度為7.0 mmol·L-1，硫酸根的濃度為2.0 mmol·L-1，碳酸根的濃度為30 mmol·L-1。次生礦物的生成，與它們的溶解性具有相關性。菱鐵礦和藍鐵礦的lgKsp分別為-36和10.9，因此這兩種次生礦物均可生成[28]，并且先生成藍鐵礦，后生成菱鐵礦。盡管在加入活性炭的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)結束時鐵完全被還原，但是通過XRD檢測到的次生礦物的譜峰強度很弱，并且在48 h的時候未能檢測到次生礦物的生成。我們之前的研究結果發(fā)現(xiàn)，當將Fe2+加入含有活性炭的培養(yǎng)體系時，僅發(fā)現(xiàn)納米級的小顆粒，沒有次生礦物生成；但當培養(yǎng)體系中沒有活性炭時，可以檢測到明顯的次生礦物生成[14]。因此，本研究中活性炭抑制次生礦物生成的原因可能是，活性炭對Fe2+具有較強的吸附能力，使緩慢生成的Fe2+被均勻地吸附在活性炭表面，抑制了藍鐵礦和菱鐵礦礦物晶體的生長。

圖3的結果表明溶液中的As最終都被固體礦物所固定，而在本實驗中檢測到藍鐵礦和菱鐵礦的生成。為了進一步確定As是否累積在藍鐵礦中，我們通過SEM-EDX元素面掃觀察As在不同次生礦物中的分布，見圖6。由于藍鐵礦和菱鐵礦的主要成分分別為 Fe3（PO4）2和 FeCO3，因而在 SEM-EDX 元素面掃時選取Fe、P和As三種元素。圖6中片狀礦物的元素組成包括Fe、P和少量的As，而正方體形礦物的元素組成僅為Fe。因此，我們推斷出，在生成的片狀藍鐵礦和正方體形菱鐵礦中，As主要累積在片狀的藍鐵礦中。

綜合以上研究結果，本研究中活性炭和生物炭的加入在培養(yǎng)初期會對微生物的生長造成毒害作用，抑制了鐵礦的還原和Fe2+的釋放，從而減緩了次生礦物的生成，使溶液中的As不能被盡快固定在次生礦物中。但是在培養(yǎng)中期微生物逐漸適應培養(yǎng)環(huán)境，鐵礦的還原可以持續(xù)進行，因而與生物對照組相比，活性炭和生物炭的加入，最終顯著增加了鐵的還原比例。

圖5 活性炭和生物炭影響微生物還原As（Ⅴ）-FH過程中固體樣品的礦物形貌Figure 5 Effect of activated carbon and biochar on the morphology of solid mineral during Shewanalla oneidensis MR-1 reduction of As（Ⅴ）-bearing ferrihydrite

3 結論

（1）活性炭和生物炭由于具有生物毒性，在培養(yǎng)初期會抑制微生物還原As（Ⅴ）-FH過程中鐵的還原和Fe2+的釋放。

（2）在培養(yǎng)中期微生物逐漸適應培養(yǎng)環(huán)境，鐵礦的還原持續(xù)進行，反應結束時活性炭和生物炭顯著增加了As（Ⅴ）-FH中鐵還原的比例。

圖6 藍鐵礦和菱鐵礦的SEM-EDX元素面掃Figure 6 SEM-EDX mapping the elemental composition of Fe，P，and As in the secondary minerals

（3）活性炭和生物炭抑制微生物還原As（Ⅴ）-FH過程中溶液中As的去除。

（4）活性炭和生物炭減緩了次生礦物生成的速度，改變了次生礦物的種類。

（5）藍鐵礦和菱鐵礦兩種次生礦物依次生成，As主要累積在藍鐵礦中。