陶 冶,程 銘,焦文佳,夏廉臣,王雪暉,王春維,祝愛俠

(武漢輕工大學(xué),湖北武漢 430023)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(ZiziphusjujubaMill.vat.spinosa(Bunge)Hu ex H.E Chou)干燥成熟的種子,作為一種藥食同源的傳統(tǒng)中草藥,主要含有脂肪酸、黃酮類、生物堿、氨基酸、三萜類等生物活性成分。酸棗仁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其性平味甘、酸,歸肝、膽經(jīng)?！侗静菥V目》、《金匱要略》等中醫(yī)藥典中均有記載,對(duì)人體安全、無毒、無副作用。酸棗仁不論生用、熟用都有安神催眠作用,而且在炮制中“久炒油枯而療效降低”[1],說明酸棗仁油在療效中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁中油脂含量高達(dá)32%[2]。酸棗仁油中主要由六種脂肪酸組成,其中不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸和花生烯酸等約占總量的90%,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值,同時(shí)也具有抗氧化、防治動(dòng)脈硬化、降血脂、提高免疫力等藥理作用[3-6]。

目前,提取酸棗仁油的方法主要有微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超臨界CO2萃取法等,不同提取方法對(duì)酸棗仁油得率及脂肪酸組成影響的研究尚未見報(bào)道。本文著重考察亞臨界丁烷萃取法、超聲提取法和索氏抽提法對(duì)酸棗仁油得率的影響,GC-MS法分析三種不同方法得到的酸棗仁油脂肪酸組成和含量,比較了三種不同方法提取油脂中抗氧化活性物質(zhì)VE的含量以及氧化穩(wěn)定性,以期為酸棗仁油的工業(yè)化生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 市購(原產(chǎn)地河南);甲醇、正己烷均為高效液相色譜級(jí) 購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;丁烷 純度大于95% 河南河陽石化有限公司。

CBE-5L型亞臨界流體萃取設(shè)備 河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司;7890/5975I氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司;毛細(xì)管色譜柱HP-FFAP美國Agilent公司;離心機(jī)(TGL205) 長沙平凡儀器儀表有限公司;渦旋混合器(S25) 德國IKA公司;YB-1000A型植物粉碎機(jī) 大連運(yùn)邦科技發(fā)展有限公司;PCWJ-10型超純水機(jī) 成都品成科技有限公司;Agilent 1260 美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 酸棗仁置于40 ℃烘箱中干燥5 h,粉碎,過80目篩,取篩下物至陰涼、干燥處保存。

1.2.2 酸棗仁油的提取

1.2.2.1 亞臨界丁烷萃取法 稱取500 g酸棗仁粉,裝入萃取袋后放入萃取罐中。實(shí)驗(yàn)中,先將系統(tǒng)抽成真空狀態(tài),真空度為0.1 MPa左右。萃取溶劑為丁烷,在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的萃取條件下進(jìn)行亞臨界萃取,萃取的過程中通過運(yùn)用循環(huán)熱水,對(duì)萃取罐進(jìn)行加熱,加熱溫度為45 ℃,萃取時(shí)間設(shè)定40 min,萃取結(jié)束后,將含有脂溶性成分的亞臨界流體從萃取罐中放出,進(jìn)入脫溶罐進(jìn)行減壓蒸發(fā),待溶劑脫除完畢,便可放出酸棗仁油,離心除雜,即為所需酸棗仁油[7]。計(jì)算得率如式(1)，萃取工藝路線見圖1。

圖1 亞臨界流體萃取裝置及工藝流程圖Fig.1 Subcritical extraction equipments and process chart

1.2.2.2 索氏抽提法 稱取5.0 g的酸棗仁粉末,置于濾紙筒,再將紙筒平緩的放入索氏提取筒內(nèi),加200 mL石油醚溶液,使紙筒完全浸沒于石油醚中。在80 ℃回流提取7.0 h,至紙筒周圍浸泡液基本呈無色,將提取液減壓抽濾后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),稱提取物重量[8],按式(1)計(jì)算得率。

1.2.2.3 超聲輔助提取法 稱取約20.0 g的酸棗仁粉末,置于100 mL錐形瓶中,用50 mL石油醚溶液在50 ℃超聲提取1.0 h,將提取液減壓抽濾后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),稱提取物重量[4],按式(1)計(jì)算得率。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 酸棗仁油得率的計(jì)算方法

式(1)

式(1)中:M為酸棗仁的質(zhì)量,g;M1為空瓶的質(zhì)量,g;M2為空瓶和酸棗仁油的質(zhì)量,g。

1.2.3.2 酸棗仁油主要理化指標(biāo)測定 酸價(jià)是脂肪中游離脂肪酸含量的標(biāo)志,油脂在制取或貯藏過程中受熱或在解脂酶的作用下分解產(chǎn)生游離脂肪酸,從而使油中酸價(jià)增加,游離脂肪酸的含量與油脂的品質(zhì)有關(guān),因此酸價(jià)常作為衡量油脂品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[9]。酸棗仁油酸價(jià)的測定:參照GB/T 5530-2005動(dòng)植物油脂酸值和酸度的測定。過氧化值反映的是油脂氧化酸敗的程度,酸敗程度越小,過氧化值越低,說明油脂質(zhì)量越好[10]。酸棗仁油過氧化值的測定:參照GB/T 5538-2005動(dòng)植物油脂過氧化值的測定。皂化值的高低表示油脂中脂肪酸分子量的大小,含有游離脂肪酸將使皂化值升高,皂化值在一定程度上也可以反映油脂的純度[11]。酸棗仁油皂化值的測定:參照GB/T 5534-2008動(dòng)植物油脂皂化值的測定。碘值是表示油脂不飽和程度的指標(biāo),不飽和程度越大,碘值越高。酸棗仁油碘值的測定:參照GB/T 5532-2008動(dòng)植物油脂碘值的測定。

1.2.3.3 酸棗仁油脂肪酸組成測定 取酸棗仁油50 mg,置于10 mL離心管,加2 mL正己烷溶解,再加2 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液,振蕩,搖勻,靜置30 min,取上層有機(jī)相,過膜,待做GC-MS分析[12-15]。

色譜柱HP-FFAP(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,升溫程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至190 ℃,再以2 ℃/min升至220 ℃,保持14 min。載氣為高純He,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為1 μL,分流比為10∶1,進(jìn)樣口溫度230 ℃,壓力為12.775 psi,檢測器溫度240 ℃。

質(zhì)譜條件:EI離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四級(jí)桿150 ℃;溶劑延遲14 min,掃描范圍50～500。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間、質(zhì)譜信息,同時(shí)結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果,參考相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)植物油中脂肪酸成分進(jìn)行分析,應(yīng)用峰面積歸一化法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析,用Microsoft Excel 對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.3.4 酸棗仁油中VE含量的測定 參照NY/T 1598-2008標(biāo)準(zhǔn),制備樣品溶液,采用高效液相色譜法對(duì)酸棗仁油中維生素E的含量和組成進(jìn)行色譜分析,根據(jù)不同維生素E標(biāo)樣的保留時(shí)間確定酸棗仁油中維生素E不同異構(gòu)體,根據(jù)維生素E進(jìn)樣量與峰面積成正比關(guān)系,算出酸棗仁油中維生素E總含量[16]。

色譜條件:色譜柱:phenomenex色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm);流動(dòng)相:100%甲醇;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:40 μL;檢測波長:300 nm;保留時(shí)間:20 min。

1.2.3.5 不同方法提取酸棗仁油的自氧化實(shí)驗(yàn) 采用Schaal烘箱法將亞臨界丁烷萃取法、索氏抽提法和超聲輔助提取法提取的酸棗仁油分別置于(60±1) ℃的恒溫烘箱中,每隔 2 d取油樣分析,測定其過氧化值(POV),比較不同方法提取的酸棗仁油的變化情況。過氧化值的測定方法參照GB/T 5538-2005標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件和Origin 9.0軟件對(duì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)酸棗仁油得率的影響

不同提取方法對(duì)酸棗仁油得率的影響結(jié)果如表1所示。由表1可見,索氏抽提法得率(28.02%)和亞臨界萃取法得率(26.76%)顯著高于超聲提取法(24.45%)(p<0.05),亞臨界丁烷萃取法得率(26.76%)較索氏抽提法得率(28.02%)有一定降低,但差異不顯著。索氏抽提法所需能耗較低,但耗時(shí)最長,為亞臨界萃取法的11倍,且提取溫度較高,不利于酸棗仁油中脂肪酸的保存,進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致酸棗仁油發(fā)生氧化;超聲提取雖時(shí)間短且溫度低,所需能耗也較低,但得率較低;亞臨界丁烷萃取法相比之下耗能較高,但可以在較低溫度下溶出更多目標(biāo)物,且反應(yīng)時(shí)間大大縮短,有效提高了生產(chǎn)效率,故選擇亞臨界丁烷提取法效果為最佳,這與文獻(xiàn)采用亞臨界萃取澳洲堅(jiān)果油結(jié)論一致[15]。

表1 不同提取方法所得酸棗仁油得率Table 1 Yield of jujube seed oil by different extraction methods

2.2 不同提取方法對(duì)酸棗仁油理化指標(biāo)的影響

從表2可以看出亞臨界丁烷萃取法油脂的酸價(jià)、過氧化值最低,索氏抽提法油脂的酸價(jià)、過氧化值最高。原因可能是由于索氏抽提工藝溫度較高,持續(xù)時(shí)間較長,導(dǎo)致油脂氧化程度高,而采用亞臨界丁烷萃取法在整個(gè)萃取和分離過程中都在低溫下進(jìn)行,能很好地保留提取物中的活性成分,因此亞臨界萃取法提取的油脂品質(zhì)較好[18]。比較三種不同方法提取酸棗仁油脂的皂化值,可以看出亞臨界丁烷提取法提取的油脂的皂化值最高,表明其純度最高。三種不同方法提取的酸棗仁油脂的皂化值在185～187 mg/g之間,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]。三種不同方法提取的酸棗仁油的碘值的大小依次為:亞臨界丁烷萃取法>超聲輔助提取法>索氏抽提法,說明采用亞臨界丁烷萃取的酸棗仁油脂中不飽和脂肪酸含量最高。

表2 三種不同方法提取酸棗仁油脂理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of jujube seed oil by three kinds of different methods

2.3 不同提取方法對(duì)酸棗仁油脂肪酸組成的影響

對(duì)三種不同方法所得酸棗仁油脂肪酸甲酯進(jìn)行GC-MS分析,得到總離子流圖見圖2～圖4。通過質(zhì)譜信息與質(zhì)譜庫對(duì)照,測得了三種方法提取的酸棗仁油中脂肪酸組成及相對(duì)含量,結(jié)果見表3。

圖2 亞臨界丁烷萃取所得酸棗仁油脂肪酸甲酯GC/MS分析總離子流色譜圖Fig.2 GC/MS analysis total ion chromatogram of fatty acid methyl ester in jujube seed oil obtained from subcritical butane extraction

圖3 索氏抽提所得酸棗仁油脂肪酸甲酯GC/MS分析總離子流色譜圖Fig.3 GC/MS analysis total ion chromatogram of fatty acid methyl ester in jujube seed oil obtained from soxhlet extraction

圖4 超聲輔助提取所得酸棗仁油脂肪酸甲酯GC/MS分析總離子流色譜圖Fig.4 GC/MS analysis total ion chromatogram of fatty acid methyl ester in seed kernel oil obtained from ultrasonic-assisted extraction

表3 不同提取方法所得酸棗仁油脂肪酸組成與相對(duì)含量Table 3 Composition and relative content of the fatty acids in jujube kernel oil obtained from different extraction methods

由表3可知,通過GC-MS 分析,亞臨界丁烷萃取法、超聲波輔助提取法、索氏抽提法所得酸棗仁油共被鑒定出15種脂肪酸成分,三種提取方法所得油脂不飽和脂肪酸中均含有油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、二十二烷酸和飽和脂肪酸棕櫚酸。亞臨界丁烷萃取法得到的酸棗仁油脂肪酸組成與后兩種有較大的差異,具體表現(xiàn)在亞臨界丁烷萃取法所得酸棗仁油含有少量的棕櫚酸,并檢測出十七烯酸、硬脂酸和二十碳二烯酸;其單不飽和脂肪酸含量為45.13%,不飽和脂肪酸總量為74.12%,明顯高于其它兩種方法,與前述碘值檢測結(jié)果相對(duì)應(yīng)。索氏抽提法和超聲輔助提取法所得酸棗仁油脂肪酸組成有4種明顯不同,具體表現(xiàn)在索氏抽提法相對(duì)于超聲輔助提取法所得酸棗仁油能檢測出十五烷酸和二十四烷酸,超聲輔助提取法相對(duì)于索氏抽提法所得酸棗仁油能檢測出十六碳烯酸和二十碳五烯酸。因此,從脂肪酸組成與相對(duì)含量兩個(gè)主要指標(biāo)分析,亞臨界丁烷萃取法可萃取出品質(zhì)較高的酸棗仁油。酸棗仁油的碳鏈長度在C14～C24之間,是一種以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸油脂,其不飽和脂肪酸含量高達(dá)69%～74%;油酸含量約為42%,亞油酸含量約為31%[20]。油酸和亞油酸含量是評(píng)價(jià)植物油品質(zhì)的一個(gè)重要營養(yǎng)指標(biāo),其在人體的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。通常在營養(yǎng)學(xué)界油酸被稱為“安全脂肪酸”,可以供給人體所需的大量熱能,同時(shí)也可有效預(yù)防冠心病等心腦血管疾病的發(fā)生[21]。亞油酸是一種人體必需脂肪酸,具有“血管清道夫”的美譽(yù),能降低血液膽固醇,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[22]。因此,酸棗仁油具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.4 不同提取方法對(duì)酸棗仁油中VE含量的影響

稱取不同提取方法得到的酸棗仁油若干克,稀釋后進(jìn)行高效液相色譜分析。所得酸棗仁油VE含量的高效液相色譜圖和VE標(biāo)準(zhǔn)品圖見圖5。

圖5 不同提取方法所得VE高效液相色譜圖Fig.5 VE high performance liquid chromatogrophy(HPLC)obtained by different extraction methods

VE是生育酚的混合物,主要存在于植物油脂中,作為脂溶性維生素之一是一種重要的生理抗氧化劑。根據(jù)不同提取方法所得酸棗仁油中VE的出峰時(shí)間對(duì)比VE標(biāo)品出峰時(shí)間,確定酸棗仁油中VE的主要成分為γ-VE,所以以γ-VE替代酸棗仁油中總VE含量。根據(jù)樣品峰面積由標(biāo)曲公式算出不同提取方法所得VE的含量,結(jié)果見表4。

表4 三種不同方法提取酸棗仁油中VE含量Table 4 VE content in jujube kernel oil extracted by three different methods

由表4可知,亞臨界丁烷萃取法所得酸棗仁油中VE含量顯著高于其他兩種方法所得酸棗仁油中VE的含量(p<0.05),酸棗仁油中VE含量由大到小的順序依次為:亞臨界丁烷萃取法>索氏抽提法>超聲提取法,主要是由于亞臨界丁烷萃取時(shí)低溫、無氧的條件降低了天然活性成分的破壞,較好的保存了酸棗仁油中的VE[23]。

2.5 不同方法提取酸棗仁油自氧化過程中過氧化值的變化

由圖6可見,在強(qiáng)制氧化2 d后,三種方法提取的酸棗仁油的過氧化值沒有明顯差異。強(qiáng)制氧化4 d后,三種方法提取的酸棗仁油的過氧化值均有不同程度的增加,亞臨界丁烷萃取法得到的酸棗仁油的過氧化值增長幅度較大,索氏抽提法及超聲輔助提取法獲得的酸棗仁油的過氧化值變化幅度小,后兩種方法提取的酸棗仁油在強(qiáng)制氧化10 d后,過氧化值的上升幅度較小,亞臨界萃取法得到的酸棗仁油過氧化值仍大幅度上升。強(qiáng)制氧化14 d后,亞臨界萃取法獲得的酸棗仁油氧化值達(dá)到5.739 mmol/kg,后兩種方法提取的酸棗仁油過氧化值均小于3 mmol/kg。因此,不同提取方法所得酸棗仁油的在兩周的強(qiáng)制氧化過程中體現(xiàn)出的抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次為:索氏抽提法>超聲輔助提取法>亞臨界丁烷萃取法,究其原因是因?yàn)閬喤R界萃取法提取的酸棗仁油脂中不飽和脂肪酸含量較高、易于氧化所致。

圖6 不同方法提取酸棗仁油自氧化過程中過氧化值的變化Fig.6 Changes of peroxide value during self-oxidation of jujube kernel oil extracted by different methods

3 結(jié)論與討論

三種不同方法提取的酸棗仁油在得率、組成成分、理化性質(zhì)和氧化穩(wěn)定性等方面存在較大差異,其中采用索氏抽提法提取的酸棗仁油得率最高,超聲提取法提取的酸棗仁油得率最低。不同的提取方法對(duì)油脂的質(zhì)量指標(biāo)如酸價(jià)、過氧化值、皂化值以及碘值等影響較大。由于索氏抽提法耗時(shí)長,所以提取的新鮮油脂中過氧化值大于其余兩種方法。三種方法提取的脂肪酸中不飽和脂肪酸含量依次為:亞臨界丁烷萃取法>超聲輔助提取法>索氏抽提法。三種方法提取的酸棗仁油中抗氧化活性物質(zhì)VE含量依次為:亞臨界丁烷萃取法>索氏抽提法>超聲提取法,主要是因?yàn)閬喤R界低溫、無氧萃取時(shí)降低了天然活性成分的破壞,較好的保存了原料中的VE。三種方法提取的油脂的抗氧化穩(wěn)定性依次為:索氏抽提法>超聲提取法>亞臨界丁烷萃取法;導(dǎo)致亞臨界丁烷萃取法所得油脂的氧化穩(wěn)定性差的原因,主要是由于亞臨界提取法所得酸棗仁油中不飽和脂肪酸含量高,易于氧化酸敗所致[24]。

酸棗仁的主要有效成分為酸棗仁油,而酸棗仁油不穩(wěn)定,容易變性和失效,選擇一種有效的提取方法使我們迫切需要解決的問題,本實(shí)驗(yàn)通過比較亞臨界丁烷萃取法、索氏抽提法和超聲輔助提取法,進(jìn)一步體現(xiàn)了亞臨界丁烷萃取法提油得率較高、產(chǎn)品質(zhì)量好、提取質(zhì)量好、提取速度快等特點(diǎn)。

通過比較3種不同提取方法對(duì)酸棗仁油的得率和理化性質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)亞臨界丁烷萃取法提油得率較高,所提酸棗仁油不飽和脂肪酸最多,品質(zhì)最高。

不同提取方法所得的酸棗仁油脂肪酸組成成分存在差異,但也有一些共同成分,實(shí)驗(yàn)通過比較3中不同提取方法所得的酸棗仁油成分,得出了它們之前各自的獨(dú)有成分和共同成分及相對(duì)含量,為酸棗仁的鑒定和質(zhì)量控制提供了一定依據(jù)。

在檢測不同方法所得酸棗仁油的VE含量和自氧化過程,發(fā)現(xiàn)亞臨界丁烷萃取法所得酸棗仁油中VE含量最高,索氏抽提法所得酸棗仁油抗氧化能力最強(qiáng),說明亞臨界丁烷萃取法能得到更好品質(zhì)的酸棗仁油,但是索氏抽提法所得酸棗仁油在長時(shí)間貯藏過程中,能體現(xiàn)出更好的抗氧化能力。

綜合評(píng)定:亞臨界丁烷萃取法得到的酸棗仁油品質(zhì)最好。