紀(jì) 會(huì)，柴志欣，王 會(huì)，鐘金城

（西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041）

miRNA是一類長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，一般以互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因結(jié)合，引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）清除mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而影響編碼蛋白基因的表達(dá)。miRNA最先是在秀麗線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物、果蠅和植物等生物中。miRNA基因盡管不編碼蛋白，但其編碼的RNA在生物整個(gè)生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，科學(xué)家們?cè)谟嘘P(guān)牛miRNA的研究方面也做了大量研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在牛的脂肪沉積與代謝，脂肪細(xì)胞生成、增殖與分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。本文就miRNA生物合成機(jī)制、最新研究進(jìn)展及在牛脂肪代謝中的研究進(jìn)行總結(jié)，以期為今后更好地發(fā)掘牛脂肪組織中miRNA的功能提供參考。

1 miRNA的合成及其作用機(jī)制

1.1 miRNA的合成

miRNA是一類由基因組DNA轉(zhuǎn)錄生成用于調(diào)控RNA的非編碼序列。miRNA生物合成過(guò)程主要分為在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中2個(gè)階段（圖1［1］）。首先，在細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）的催化作用下，miRNA相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄得到初級(jí)miRNA（pri-miRNA），此時(shí)pri-miRNA含有1個(gè)莖環(huán)，在5′端有帽狀結(jié)構(gòu)，3′端包含長(zhǎng)達(dá)幾千核苷酸（nt）的多聚腺苷酸尾狀結(jié)構(gòu)。隨后內(nèi)切酶Drosha（RNA聚合酶Ⅲ）與微處理復(fù)合物亞基DGCR8結(jié)合識(shí)別pri-miRNA，將pri-miRNA剪切成60～70 nt的發(fā)卡小分子RNA（即pre-miRNA前體），由輸出蛋白Exportin-5與RAN-GTP結(jié)合蛋白相互作用將pre-miRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核［2-3］；其次，在細(xì)胞質(zhì)中，premiRNA被Dicer內(nèi)切酶剪切掉莖環(huán)結(jié)構(gòu)后形成長(zhǎng)19～25 nt的雙鏈RNA，小分子雙鏈RNA隨后結(jié)合到（Argonaute）AGO蛋白上形成一個(gè)復(fù)合物前體（PrimiRISC），miRNA 的過(guò)客鏈（Passenger strand）被 PrimiRISC迅速移去后降解，剩下的成熟導(dǎo)向鏈（guide strand）與AGO蛋白相互作用形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。關(guān)于兩條鏈在RISC復(fù)合物中是如何分開(kāi)、如何外排，此過(guò)程目前還沒(méi)有明確解釋。

1.2 miRNA的作用機(jī)制

miRNA主要的作用機(jī)制是誘導(dǎo)靶mRNA降解或阻止翻譯起始，從而在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控，降解靶mRNA序列。miRNA降解mRNA過(guò)程：miRNA通過(guò)5′端被稱為種子序列（Seed sequence）的7nt序列與靶基因mRNA 3′UTR（非編碼區(qū)）完全互補(bǔ)結(jié)合，部分功能性miRNA也可與5′UTR中開(kāi)放閱讀框架結(jié)合，RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）誘導(dǎo)mRNA序列poly-A尾巴脫腺苷酸化隨后脫帽［4］，使其失去穩(wěn)定性而降解，mRNA豐度減少，翻譯減少。阻止翻譯起始：如果miRNA與靶mRNA序列部分互補(bǔ)，通常不會(huì)導(dǎo)致mRNA降解［5］，而是RISC復(fù)合物定位于3′UTR，阻礙起始蛋白與mRNA 5′帽子結(jié)合，從而抑制靶mRNA翻譯起始［6］（圖1）。miRNA調(diào)控通過(guò)RISC復(fù)合物完成，AGO家族蛋白是復(fù)合物的核心元件，也是miRNA功能途徑中的關(guān)鍵蛋白，其能夠結(jié)合miRNA以及剪切靶標(biāo)基因。AGO蛋白（Argonaute proteins）由 N末端、PAZ、MID和PIWI四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，PIWI區(qū)具有切割mRNA的催化中心。通常認(rèn)為，miRNA與AGO1結(jié)合組成miRNA效應(yīng)器復(fù)合物（miRNARISC，miRISC）引導(dǎo)靶mRNA裂解或抑制翻譯，這種結(jié)合作用主要在植物和果蠅中研究發(fā)現(xiàn)［7-8］，在哺乳動(dòng)物中研究較少。然而，miRNA-AGO2機(jī)制在哺乳動(dòng)物中作用顯著，AGO2具有RNA酶切活性，催化miRNA切割mRNA［9］。有研究表明，AGO2介導(dǎo)的RNA沉默途徑與腫瘤密切相關(guān)。Chiyomaru 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-141 依賴AGO2介導(dǎo)HOTAIR基因沉默，抑制腫瘤增殖。到目前為止，miRNA-AGO2作用機(jī)制在生物體內(nèi)有許多功能不為所知，需要繼續(xù)探索、發(fā)現(xiàn)。

圖1miRNA的合成及其作用機(jī)制

2 牛脂肪組織中miRNA的相關(guān)研究進(jìn)展

胴體中皮下和肌內(nèi)脂肪含量是家畜肉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，因胴體肌內(nèi)脂肪較皮下脂肪難沉積而導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪不足和皮下脂肪過(guò)多，成為高品質(zhì)家畜肉質(zhì)生產(chǎn)的難點(diǎn)之一。近年來(lái)，研究人員運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)不斷挖掘牛脂肪組織中發(fā)揮作用的miRNA并探究其功能，發(fā)現(xiàn)其中的 miR-378、miR-27b、miR-320a、miR-2400、miR-23a等發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.1 miR-378調(diào)控脂質(zhì)代謝的研究

Jin等［11］利用qRT-PCR分析比較了不同背脂厚度雜種閹牛皮下脂肪組織中特異miRNA的表達(dá)模式，實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到18個(gè)miRNAs的表達(dá)與背脂厚度相關(guān)，其中miR-378表達(dá)顯著。Hu等［12］通過(guò)對(duì)映射激酶介導(dǎo)的PPARγ磷酸化作用抑制脂肪生成的研究發(fā)現(xiàn)，816個(gè)潛在的靶基因中，其中靶基因MAPK1（蛋白激酶1）可介導(dǎo)脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子PPARγ（過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ）磷酸化并降低其轉(zhuǎn)錄活性。Rangwala等［13］和Rosen等［14］的研究結(jié)果表明，PPARγ在牛前脂肪細(xì)胞脂肪形成過(guò)程中表達(dá)量上調(diào)，降低PPARγ水平可顯著抑制3T3-L1細(xì)胞中前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［15］，推測(cè)miR-378通過(guò)靶向調(diào)控MAPK1和PPARγ來(lái)促進(jìn)牛白色脂肪組織中脂肪的形成。Liu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)miR-378的牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，脂滴體積增大，甘油三酯含量增加，說(shuō)明miR-378可促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞分化。Kulyté等［17］研究發(fā)現(xiàn)，miR-378 過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致人體脂肪細(xì)胞脂肪分解加速，而脂肪細(xì)胞脂解增強(qiáng)是導(dǎo)致癌癥惡病質(zhì)的原因之一，說(shuō)明miRNA-378的表達(dá)與人患癌癥有相關(guān)性。也有大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-378在哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用至關(guān)重要，且具有保守性。

2.2 miR-27b等其他轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控作用

Gu等［18］從牛脂肪和乳腺組織中共鑒定出59個(gè)不同的miRNA。Moura等［19］通過(guò)檢測(cè)飼喂不同日糧（高或低脂肪含量）對(duì)牛皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪的影響，發(fā)現(xiàn)在高脂日糧組牛脂肪組織中檢測(cè)到的miRNA數(shù)量高于低脂日糧組牛，其中 miRNA（miR-19a，miR-92a，miR-92b，miR-101，miR-103，miR-106，miR-142-5p 和 miR-296）差異表達(dá)顯著（P＜0.05），說(shuō)明這 8種 miRNAs相應(yīng)靶基因可能參與飼喂高脂肪日糧誘導(dǎo)牛脂肪組織脂肪沉積過(guò)程。汪海洋等［20］利用miRNA微陣列芯片技術(shù)對(duì)西門(mén)塔爾牛肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)在差異表達(dá)極顯著的88個(gè)miRNA中，miR-27b等重要miRNA可能以其獨(dú)特通路（如MAPK信號(hào)）來(lái)調(diào)節(jié)牛肌內(nèi)脂肪的形成。Romao等［21］從3個(gè)不同發(fā)育時(shí)段的8頭英國(guó)大陸雜種閹牛中獲得24個(gè)皮下脂肪組織，共檢測(cè)到224個(gè)miRNA，預(yù)測(cè)其中17個(gè)特異性miRNA可能參與調(diào)節(jié)牛脂肪組織的能量平衡。褚敏［22］利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)篩選冷暖兩季牦牛皮下脂肪及背最長(zhǎng)肌miRNAs，并分析其分子代謝通路，結(jié)果共檢測(cè)到70個(gè)miRNA在2個(gè)季節(jié)皮下脂肪組織的表達(dá)量達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05），其中miR-335、miR-378b、miR-200a、miR-200b、miR-200c 及miR-210對(duì)牦牛脂肪代謝起調(diào)控作用；皮下脂肪組織差異表達(dá)miRNA共預(yù)測(cè)到815個(gè)達(dá)到顯著水平（P＜0.05）的靶基因，主要富集在脂肪細(xì)胞生成與代謝、脂肪酸合成與分解等77個(gè)通路中。孫加節(jié)［23］通過(guò)測(cè)序篩選秦川牛胎牛期和成年期背部脂肪組織中特異性表達(dá)miRNAs，利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)miRNA-n25和miRNA-n26在脂肪組織中高表達(dá)，且在母牛背部脂肪組織中表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），其靶基因與脂肪形成或脂滴沉積等過(guò)程顯著相關(guān)（P＜0.05）。郭云濤［24］利用 RNA-Seq技術(shù)對(duì)日本黑毛和牛及荷斯坦牛背部皮下脂肪組織miRNA表達(dá)情況進(jìn)行了比較分析，鑒定出bta-miR-30f、bta-miR-196b和bta-miR-2887等14個(gè)上調(diào)表達(dá)miRNA，3 個(gè)下調(diào)表達(dá) miRNA（bta-miR-320a、bta-miR-874和bta-miR-1247-3p），預(yù)測(cè)出15個(gè)新miRNA。其中在日本黑毛和牛中下調(diào)表達(dá)且豐度較高的bta-miR-320a在各物種間較保守，bta-miR-320a啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)p53（抑癌基因）、細(xì)胞周期和MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化，進(jìn)而影響牛脂肪沉積。Wei等［25］提出，miR-2400可通過(guò)調(diào)節(jié)靶向PRDM11（轉(zhuǎn)錄抑制子）促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖。Long等［26］從胎牛骨骼肌中分離出血小板源性前體細(xì)胞并誘導(dǎo)其成為脂肪細(xì)胞。使用miRNAome測(cè)序發(fā)現(xiàn)，下調(diào)bta-miR-23a可以增加脂質(zhì)積累和C/EBPα（轉(zhuǎn)錄因子 CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α）、PPARγ及 FABP4（脂肪酸結(jié)合蛋白4）的表達(dá)，促進(jìn)牛骨骼肌中脂肪形成，說(shuō)明在早期肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中bta-miR-23a作為一種抗脂肪形成調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。

2.3 miRNA調(diào)控脂質(zhì)代謝通路

不同研究者在皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪、不同品種牛脂肪組織間及在不同環(huán)境或不同飼養(yǎng)條件下的牛脂肪組織中篩選出大量差異表達(dá)miRNA，分析miRNA在脂肪組織中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制，也驗(yàn)證了miRNA通過(guò)特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)牛脂肪組織中脂肪生成，說(shuō)明miRNA在牛脂肪組織中發(fā)揮重要調(diào)控作用，需要不斷研究挖掘關(guān)鍵miRNA，并且了解miRNA在牛體內(nèi)的作用機(jī)制和生物學(xué)功能，才能將理論運(yùn)用到實(shí)踐，指導(dǎo)不同牛品種的培育，獲得高品質(zhì)牛肉。在信號(hào)通路研究中，MAPK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期運(yùn)行和基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用，MAPK包括多個(gè)成員，是miRNA調(diào)控基因表達(dá)的重要信號(hào)通路，活化后的MAPK成員向核內(nèi)遷移，磷酸化包括轉(zhuǎn)錄因子（如PPARγ）在內(nèi)的核蛋白和膜受體，實(shí)現(xiàn)miRNA對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄和其他事件的調(diào)節(jié)，在牛脂肪組織中MAPK與miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)值得深入探究。

miRNA可以穩(wěn)定地存在于血清和血漿等多種體液中，這類miRNA稱為循環(huán)miRNA，一般以內(nèi)分泌或旁分泌的形式發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞間的循環(huán)miRNA可調(diào)節(jié)細(xì)胞中脂質(zhì)生成和積累，且效果顯著［27］。Kahn等［28］鑒定出脂肪細(xì)胞可通過(guò)“外泌體”微小囊泡將miRNA分泌到血液中，且所分泌的miRNA有助于調(diào)節(jié)肝臟等組織器官，小鼠體內(nèi)多個(gè)循環(huán)miRNA均來(lái)自脂肪組織，循環(huán)miRNA在肝臟中能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前，對(duì)循環(huán)miRNA的生物學(xué)功能及作用機(jī)制研究較少，牛脂肪組織中相關(guān)循環(huán)miRNA尚未見(jiàn)報(bào)道，但可推測(cè)牛體內(nèi)關(guān)鍵循環(huán)miRNA對(duì)脂肪組織細(xì)胞中脂質(zhì)生成和積累均具有調(diào)節(jié)作用，比如皮下脂肪組織與肌肉組織之間是否存在特異循環(huán)miRNA參與調(diào)節(jié)還有待驗(yàn)證。

3 miRNA在牛其他組織中的調(diào)控作用

對(duì)牛miRNA的研究結(jié)果顯示，miRNA除了參與調(diào)控脂肪生成代謝，對(duì)其他器官的發(fā)育也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，大量miRNA與牛乳腺發(fā)育和泌乳繁殖性狀相關(guān)。李惠俠等［29］應(yīng)用miRNA基因沉默技術(shù)研究了高溫條件下miR-24對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)miRNA-24對(duì)乳腺組織發(fā)育具有重要調(diào)控作用，抑制miRNA-24的表達(dá)可以緩解高溫誘導(dǎo)下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生率、促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。王杰等［30］也利用基因沉默技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-152在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中通過(guò)抑制靶基因SOCS3（細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白 3）的表達(dá)，調(diào)控 p-STAT5、p-mTOR、S6K1、cyclinD1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)乳蛋白合成和乳腺上皮細(xì)胞增殖。目前，對(duì)miRNA在奶牛乳腺發(fā)育中的調(diào)控研究已有大量報(bào)道，但microRNA在乳腺發(fā)育和泌乳等生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用還有待研究。此外，部分miRNA對(duì)犏牛雄性不育有重要調(diào)控作用。李彩霞等［31］通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，比較分析了牦牛和犏牛睪丸組織中miRNA的數(shù)量和種類，篩選出差異顯著的10個(gè)miRNA，與牦牛相比，犏牛睪丸中有8個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，2個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中miR-34c、miR-34b和miR-355分別與性別決定、附睪及精子發(fā)生密切關(guān)系，其他7個(gè)miRNA可能在牦牛精子發(fā)生中起重要調(diào)節(jié)作用。廖珂［32］為了解miRNA在犏牛睪丸功能發(fā)揮及生殖調(diào)控過(guò)程中的作用，通過(guò)對(duì)牦牛、普通牛、犏牛睪丸組織中miRNA鑒定及生物學(xué)功能研究，發(fā)現(xiàn)睪丸組織中表達(dá)量較高的miRNA（bta-miR-125a、bta-miR-125b、bta-miR-26a、bta-miR-26b）可調(diào)控靶基因，可能與犏牛精子發(fā)生阻滯相關(guān)。牦牛與普通牛雜交，得到的后代犏牛具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)肉、產(chǎn)乳量均高于牦牛，但表現(xiàn)出雄性不育，雜種優(yōu)勢(shì)的利用受到極大限制，目前相關(guān)研究報(bào)道較少。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，miRNA在牛脂肪組織及其他組織中的生物學(xué)調(diào)控作用方面的研究越來(lái)越多，利用高通量測(cè)序或芯片技術(shù)篩選影響牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程及脂代謝過(guò)程中的關(guān)鍵miRNA，利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)其靶基因并進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析，得到靶基因在脂肪細(xì)胞生成與代謝、脂肪酸合成與分解的信號(hào)通路。繼而，對(duì)牛前脂肪細(xì)胞中目標(biāo)miRNA進(jìn)行干擾或過(guò)表達(dá)，根據(jù)脂肪細(xì)胞分化狀態(tài)變化和脂質(zhì)積聚情況驗(yàn)證miRNA調(diào)控作用。高通量測(cè)序由于測(cè)序成本逐年降低和測(cè)序技術(shù)本身的優(yōu)勢(shì)如準(zhǔn)確定量和新miRNA的鑒定等原因受到廣泛青睞。但是，在對(duì)miRNA的研究過(guò)程還存在較多疑問(wèn)，在生物體中，miRNA與靶基因間的調(diào)控機(jī)制具有一定規(guī)律，但對(duì)此規(guī)律性了解得不夠透徹，miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)通過(guò)多種組合模式構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)miRNA分子可調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)基因則被多個(gè)miRNA分子調(diào)控，在某些信號(hào)刺激下，從整體上調(diào)控有機(jī)體的生命活動(dòng)，在沒(méi)有徹底理清這個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)前，無(wú)法把miRNA功能開(kāi)發(fā)運(yùn)用到真正的肉牛培育上。目前已有近上萬(wàn)條miRNA被鑒定，miRNA功能分析方法主要依賴GO分類法、信號(hào)通路分析和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，但均存在不足，導(dǎo)致絕大多數(shù)miRNA的功能尚不明確，所以開(kāi)發(fā)高效的生物信息分析工具也是未來(lái)研究中急需解決的主要問(wèn)題?，F(xiàn)階段處于挖掘牛新的miRNA及其功能的實(shí)驗(yàn)探索時(shí)期，相信不久的將來(lái)，miRNA在調(diào)控牛生長(zhǎng)發(fā)育、改良肉品質(zhì)、調(diào)節(jié)脂肪代謝、均衡牛營(yíng)養(yǎng)水平等方面的作用將有突破性進(jìn)展，進(jìn)而在牛肉生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)量與質(zhì)的飛躍。