尚元元 喻楠 董靈娣 李莎莎 劉昱奚

(1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院檢驗科，銀川 750004)

侵襲性真菌感染 (IFI)是指致病性真菌向組織內(nèi)侵入、增殖所致的真菌感染性疾病，這類感染主要發(fā)生在醫(yī)院內(nèi)。近年來，多項流行病學研究顯示，IFI在免疫力低下的患者發(fā)病率逐漸升高，而且因IFI多合并細菌感染，其臨床癥狀易被基礎疾病所掩蓋，不能及時診斷和獲得抗真菌治療，其病死率居高不下，嚴重危及人類，尤其是免疫力低下患者的健康和生命，被稱為“臨終感染”[1]。治療IFI的關鍵在于早期診斷，早期適時使用抗真菌藥物。由于IFI早期癥狀和體征常缺乏特異性，故診斷存在一定困難，其主要原因一是缺乏具有代表性的臨床表現(xiàn)，二是缺少靈敏度和特異度都高的檢測手段。傳統(tǒng)形態(tài)學診斷方法，耗時長，敏感性差；組織病理診斷，作為一個侵入性操作，可行性差；影像學表現(xiàn)缺乏特異性；因此，對于院內(nèi)侵襲性真菌感染的診斷，尋求和探索一種快速、高敏感度和高特異度的方法，已經(jīng)是該領域需要迫切解決的問題[2-3]。各項研究顯示，真菌細胞壁中含有大量 (1，3)-β-D葡聚糖成分，人體血液或深部組織中的吞噬細胞可以吞噬、消化真菌，使真菌細胞壁的 (1，3)-β-D葡聚糖釋放出來，血液和體液中既可以檢測到 (1，3)-β-D葡聚糖含量[4]。本研究收集高危院內(nèi)IFI感染患者的血漿，進行 (1，3)-β-D葡聚糖含量的檢測，并與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法比較，分析兩種方法的診斷效能，探討G實驗對院內(nèi)侵襲性真菌感染的診斷價值?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇

選擇寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院住院患者中高危院內(nèi)IFI患者132例 (住院時間2016.1～2017.4)。診斷入選標準：首先根據(jù)我國衛(wèi)生部頒發(fā)的《醫(yī)院感染診斷標準》[5]確定為院內(nèi)感染，參照歐洲癌癥研究和治療組織/深部真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應和感染病研究院真菌病研究組 (EORTC/MSG)共識組制定的IFI診斷標準[6]，分為四個診斷標準：確診，臨床診斷，擬診和排除。

1.2 G實驗

采用MB-80微生物快速檢測動態(tài)系統(tǒng)及試劑檢 (北京金山川科技發(fā)展公司生產(chǎn))檢測入選病例血漿中 (1，3)-β-D葡聚糖含量。操作過程中注意避免各種污染及可能存在的熱原質(zhì)對標本的影響。

1.3 真菌培養(yǎng)

根據(jù)標本種類的不同接種在不同培養(yǎng)基上，25℃、37℃培養(yǎng)，每24 h觀察1次結果，根據(jù)菌落生長的形態(tài)，生長特點及色素進行初級鑒別，如果生長為酵母菌的，進一步將酵母菌接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上進行分離鑒定，不能顯色的酵母類及非酵母類真菌根據(jù)其鏡下菌絲、孢子特征或進一步小培養(yǎng)的生長特點進行鑒定，仍不能確定的采用全自動微生物分析儀 (VITEK 2 COMPACT)進行鑒定。

1.4 統(tǒng)計方法

應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，評價和比較真菌培養(yǎng)和G實驗的診斷價值并進行ROC曲線分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基本情況

132例高危院內(nèi)IFI感染的患者中，共有43例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染，其中確診9例，臨床診斷21例，擬診13例，排除89例；男性76例，女性58例，男性與女性性別比為1.31∶1；年齡最小的為11歲，最大的為90歲，平均年齡56.43±13.56歲。

2.2 檢測結果

真菌培養(yǎng)檢測結果 43例診斷為院內(nèi)IFI的患者 (包括確診、臨床診斷和擬診)，真菌培養(yǎng)陽性29例，標本來自于血液，痰液，支氣管、肺泡灌洗液，尿液、腹水、鼻竇抽取液、腸道黏膜及深部組織；每例標本均先行真菌直接涂片，后行真菌培養(yǎng)，3例深部組織同時行病理檢查；其中白念珠菌13例 (5例標本來源為靜脈血，2例為痰液1例為尿液,1例為腹水，1例為腸道黏膜組織，1例為腎臟穿刺活檢組織)，占44.83%，熱帶念珠菌6例 (2例為血液，1例為痰液，1例為支氣管肺泡灌洗液，1例為尿液，1例為腹水)，占20.69%，光滑念珠菌3例 (1例為血液，1例為痰液，1例為尿液)，占10.34%，季也蒙念珠菌1例 (標本為腹水)，占3.45%，曲霉5例 (2例為痰液，1例為支氣管、肺泡灌洗液，1例來自鼻竇抽取液，1例為支氣管鏡穿刺組織)，占17.24%，混合感染1例 (標本為痰液)，占3.45%，3例深部組織病理檢查，有2例亦在組織病理切片中找到了真菌的菌絲和孢子。見表1。

G實驗檢測結果 43例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染的43例患者血漿 (1-3)-β-D葡聚糖水平為20.34～819.84 pg/mL，平均132.34 pg/mL。本研究采用 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL為陽性的判斷標準。見表1。

真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實驗檢測結果 真菌培養(yǎng)和G實驗檢測兩項檢查中任一項檢測陽性或者兩項同時為陽性者即判斷為陽性。見表1。

表1 真菌培養(yǎng)、G實驗及真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實驗檢測結果

2.3 指標分析

真菌培養(yǎng)、G實驗及真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實驗檢測的敏感度、特異度、陽性預測值，陰性預測值及Youden指數(shù)，見表2。

真菌培養(yǎng)、G實驗及聯(lián)合檢測的ROC曲線分析，見表3、圖1。

3 討 論

近年來，隨著醫(yī)療技術的進一步發(fā)展，各種有創(chuàng)性檢查和治療手段在臨床上的廣泛開展，以及器官移植、導管技術、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)激素及廣譜抗生素在臨床上的廣泛應用，以及人口老齡化等因素多種因素的作用下，使免疫受損人群不斷增加，侵襲真菌感染持續(xù)上升。這種感染主要發(fā)生在院內(nèi)，其死亡率也在不斷增加。美國的一項研究顯示，2000年院內(nèi)侵襲性真菌感染患者的死亡率較1979年增長了207%[7]。院內(nèi)侵襲性真菌感染的致病菌主要包括念珠菌，曲霉菌，隱球菌等，其中白念珠菌是主要致病菌[8]。此次調(diào)查顯示白念珠菌13例，占44.83%，排在其后的是熱帶念珠菌6例，占20.69%，曲霉5例，占17.24%，白念珠菌仍是我院主要致病菌。有研究表明，降低院內(nèi)侵襲性真菌感染相關死亡率的關鍵在于的早期診斷和早期應用抗真菌藥物；以外，早期診斷和早期應用抗真菌藥物還可以減少患者的住院費用[9]。

表2 真菌培養(yǎng)、G實驗及真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實驗檢測的敏感度、特異度、陽性、陰性預測值及Youden指數(shù)

Tab.2 Sensitivity, specificity and PPV,NPV,Youden of fungal culture,G test and combined detection for the diagnosis of IFI

檢測方法敏感度特異度陽性預測值陰性預測值Youden指數(shù)真菌培養(yǎng)0.670.960.720.800.63G實驗0.700.880.730.860.58聯(lián)合檢測0.840.920.780.920.76

表3 真菌培養(yǎng)、G實驗及聯(lián)合檢測的ROC曲線分析

圖1 真菌培養(yǎng)、G實驗及聯(lián)合檢測的ROC曲線

Fig.1 ROC curves of fungal culture,G test and combined detection

目前臨床上對于真菌病原學檢查，真菌的鏡檢和培養(yǎng)仍然是一種常規(guī)的檢查方法，此次調(diào)查顯示真菌培養(yǎng)的敏感度為67%，特異度為96%，陽性預測值和陰性預測值分別是0.72和0.80，陽性率低，敏感性差，耗時長是該傳統(tǒng)方法的不足之處。盡管近幾年來傳統(tǒng)檢測手段較前有所改進，特別是在念珠菌血癥的診斷上可以應用全自動血培養(yǎng)和檢測系統(tǒng)，使得血液中的念珠菌更高效的被檢測到。但各項研究表明，其敏感性仍較低，念珠菌血癥的檢出的陽性率只有50%左右[10]。隨著院內(nèi)侵襲性真菌感染菌種的變遷，曲霉菌感染所占比例逐漸增多，而曲霉在空氣中存在很多孢子和菌絲，真菌培養(yǎng)即使發(fā)現(xiàn)曲霉，也很難鑒別是致病菌還是污染菌，導致診斷困難。

近幾年，侵襲性真菌感染的血清學檢測方面取得了較大的進展。真菌細胞壁中含有大量 (1，3)-β-D葡聚糖成分，多項研究表明，真菌細胞壁50%以上都是 (1-3)-β-D葡聚糖，而在酵母樣真菌中，(1-3)-β-D葡聚糖含量可更高，與此相反的是其他微生物及人的細胞中不含該成份。人體血液或深部組織中的吞噬細胞可以吞噬、消化真菌，使真菌細胞壁的 (1，3)-β-D葡聚糖釋放出來，血液和體液中既可以檢測到 (1，3)-β-D葡聚糖含量，而淺表真菌感染 (如口咽部念珠菌病等)或真菌定植時 (1-3)-β-D葡聚糖極少釋放入血液中，因此血漿 (1-3)-β-D葡聚糖檢測是篩選侵襲性真菌感染的有用方法，具有臨床意義。此次調(diào)查顯示G實驗對于院內(nèi)侵襲性真菌感染的敏感度為70%，特異度為88%，陽性預測值和陰性預測值分別是0.73和0.86，G試驗不僅可檢測念珠菌感染還可以檢測曲霉、鐮刀菌等多種真菌，由于G實驗敏感性相對較高，耗時短，一般只需要2 h，而普通的真菌培養(yǎng)則至少需要5 d，而且G試驗檢測的特異性和敏感性不受抗生素影響，近年來G實驗被廣泛用于侵襲性真菌感染血清學檢測，為早期診斷提供依據(jù)。此次調(diào)查結果顯示，43例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者，有8例為念珠菌血癥，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有7例，陽性率87.5%；20例考慮為肺部侵襲性真菌感染的患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有13例，陽性率65.0%；7例考慮為泌尿系侵襲性真菌感染的患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有5例，陽性率71.4%；6例考慮為消化道侵襲性真菌感染的患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有4例，陽性率66.7%；2例鼻竇侵襲性真菌感染患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有1例，陽性率50.0%。此結果顯示，G實驗對念珠菌血癥的陽性率較高，而對肺部侵襲性真菌感染 (多為曲霉)的陽性率相對較低；這是因為宿主的免疫力和病原體的多少對曲霉感染所致血漿 (1-3)-β-D葡聚糖的變化有很大的影響。當宿主免疫力較強，病原體較少時，厚壁的纖維組織會包繞霉菌，葡聚糖就不能進入血中。

此外，30例血漿 (1-3)-β-D葡聚糖陽性的院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者中，有26例G實驗的檢測都在2次以上；13例血漿 (1-3)-β-D葡聚糖陰性的院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者，其G實驗均只檢測了1次，均為入院早期進行的檢測，后期并未復查。因次，對于臨床高度懷疑院內(nèi)侵襲性真菌感染的病例，一次G實驗檢測結果是遠遠不夠的，臨床中必須建立連續(xù)檢測的概念，連續(xù)檢測不僅僅是避免假陽性、假陰性的發(fā)生，還可以掌握評價抗真菌治療的療效，進一步指導臨床用藥，為判斷預后及是否需要調(diào)整方案提供實驗室依據(jù)。此次調(diào)查結果顯示43例診斷經(jīng)G實驗診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者中，有23.3% (7/30)經(jīng)過抗真菌治療后，血中 (1-3)-β-D葡聚糖水平先增高，后下降，最后降為正常水平，有44.3% (13/30)經(jīng)過抗真菌治療后，血漿 (1-3)-β-D葡聚糖水平直線下降，患者臨床感染癥狀亦得到有效控制，另有6.7% (2/30)經(jīng)過抗真菌治療后，血漿 (1-3)-β-D葡聚糖水平一直未明顯下降，臨床感染癥狀亦未得到有效控制。

但G實驗也同樣存在不足之處：首先G試驗的陽性結果只能代表存在侵襲性真菌感染，但是并不能夠確定其種類，而且由于β-葡聚糖普遍存在周圍環(huán)境中，G實驗有假陽性結果，如應用纖維素膜進行透析、紗布以及其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖、污染、敗血癥患者 (尤其是鏈球菌血癥)、某些抗腫瘤藥物 (香菇多糖、裂殖菌多糖)、某些靜脈制劑 (白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子)的使用、磺胺類藥物、個人飲食 (某些患者喜歡吃蘑菇類食物)等[11]，同時，G實驗還存在一些假陰性因素，如G試驗不能檢測隱球菌和接合菌，因為隱球菌細胞壁為α-葡聚糖而非 (1-3)-β-D葡聚糖，故隱球菌感染的檢測結果為陰性，除此之外使用某些抗真菌藥物如卡泊芬凈，可非競爭性抑制 (1-3)-β-D葡聚糖的合成，標本放置時間過長等都會導致G實驗出現(xiàn)假陰性結果。

本次研究還顯示，G實驗和真菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測的敏感度提高為84%，特異度提高為92%，陽性預測值0.78，陰性預測值0.92；Youden指數(shù)范圍為[-1,1]，數(shù)值越高，診斷價值越高，G實驗Youden指數(shù)0.58，真菌培養(yǎng)Youden指數(shù)0.63，聯(lián)合檢測Youden指數(shù)提高到0.76，因此，聯(lián)合檢測的診斷價值要高于單獨真菌培養(yǎng)及G實驗檢測的診斷價值。另一方面，將43例院內(nèi)侵襲性真菌感染患者的G實驗結果、真菌培養(yǎng)結果及聯(lián)合檢測結果進行ROC曲線分析，曲線下面積分別為0.717,0.757及0.798，ROC曲線下面積越大，說明診斷意義越好。聯(lián)合檢測的診斷意義高于單獨真菌培養(yǎng)或G實驗的診斷意義。因此，對于臨床懷疑侵襲性真菌感染的患者，建議真菌培養(yǎng)和G實驗同時送檢，并加強動態(tài)監(jiān)測，發(fā)揮G實驗和真菌培養(yǎng)各自的優(yōu)勢，為院內(nèi)侵襲性真菌感染的早診斷、早治療及療效判定提供快速和準確的實驗室依據(jù)。