王博龍，張軍雷，鄒盛勤

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RP-HPLC-PDAD法測定青葉膽中齊墩果酸和熊果酸的含量

王博龍1,2，張軍雷1,2，*鄒盛勤1,2

（1. 江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，宜春 336000；2. 宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西，宜春 336000）

建立了青葉膽中齊墩果酸和熊果酸的反相高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器（RP-HPLC-PDAD）定量分析方法。采用95 %乙醇為溶劑超聲提取，色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃。以甲醇∶水∶磷酸(88∶12∶0.15，v/v/v) 為流動(dòng)相等度洗脫，流速0.9 mL·min-1，采用光電二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長210 nm。齊墩果酸進(jìn)樣量在0.1048~2.6200μg時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r = 0.9999)，平均回收率為96.9%，RSD為1.7 %(n = 9)；熊果酸進(jìn)樣量在0.2304~5.7600μg時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r = 0.9999)，平均回收率為97.5 %，RSD為1.5 %(n = 9)。方法準(zhǔn)確，操作簡便，數(shù)據(jù)可靠，可用于青葉膽中齊墩果酸和熊果酸的含量測定。

青葉膽；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法；光電二極管陣列檢測器

青葉膽來源于龍膽科植物青葉膽（T. N. Ho et W. L. Shih）的干燥全草[1]，又名小青魚膽、七疸藥、肝炎草等，味苦、微寒，主要分布于云南、四川、廣西和江西等南部各省區(qū)[2]。青葉膽于1977年即被《中國藥典》收載，具有清肝利膽、清熱利濕的功效，用于黃疸尿赤、熱淋澀痛等癥[3-4]。因青葉言其色，膽者言其味，色青綠而味苦如膽汁而得名[2,5]。文獻(xiàn)報(bào)道青葉膽的有效成分主要有獐牙菜苦苷、齊墩果酸、熊果酸和黃酮類成分等[6]，其化學(xué)成分含量的測定方法主要有分光度法及高效液相色譜法等[7-9]。《中國藥典》雖已收錄青葉膽，但鑒別項(xiàng)下只有齊墩果酸和獐牙菜苦苷2成分的薄層色譜定性鑒別，而無主要化學(xué)成分的定量鑒別項(xiàng)[3]。為完善中國藥典中青葉膽的定量質(zhì)量控制指標(biāo)，以齊墩果酸和熊果酸等三萜酸為青葉膽的主要藥效成分，本研究建立快速、可靠的高效液相色譜法定量方法，同時(shí)測定了青葉膽中齊墩果酸和熊果酸的含量，方法操作簡便，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，可為控制與評(píng)價(jià)青葉膽藥材質(zhì)量提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀 (美國沃特世公司)；CP225D電子分析天平(賽多利斯公司)； SK2510HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。熊果酸、齊墩果酸對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)分別為：O110087，U107242）；甲醇（色譜純）；乙醇、磷酸（分析純）；水為超純水[10]。青葉膽分別購自于廣西、云南、江西，經(jīng)宜春學(xué)院周秀玲副教授鑒定為龍膽科植物青葉膽T. N. Ho et W. L. Shih的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品混合貯備液的配制

分別精密稱定齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品2.62、5.76 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為含齊墩果酸0.1048 mg·mL-1和熊果酸0.2304 mg·mL-1的對(duì)照品混合貯備液。

2.2 樣品溶液的配制

青葉膽樣品恒溫干燥后粉碎備用。精密稱取青葉膽各樣品粉末1.0 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入95 ％乙醇50 mL，稱重。超聲提取1 h，冷卻后稱重，用乙醇補(bǔ)足失重，搖勻。進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.3 色譜條件

選用Kromasil C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為CH3OH∶H2O∶H3PO4（88∶12∶0.15，v/v/v）；洗脫速度0.9 mL·min-1；柱溫為30 ℃。在210 nm檢測波長下，待測組分理論塔板數(shù)均大于10000，對(duì)稱因子分別為1.02、0.96，分離度均大于2.0。混合對(duì)照品和青葉膽樣品溶液的色譜見圖1。

圖1 對(duì)照品混合貯備液(A)和青葉膽樣品溶液(B) HPLC色譜

2.4 精密度試驗(yàn)

用微量進(jìn)樣器吸取上述對(duì)照品混合溶液10 μL，平行進(jìn)樣5次，積分后計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的峰面積，其RSD分別為0.6 ％(n = 5)和0.9 ％(n = 5)。儀器精密度符合定量要求。

2.5 對(duì)照品的線性關(guān)系考察

用微量進(jìn)樣器精密吸取按“2.1”項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品貯備液1、5、10、15、25 μL進(jìn)樣分析。按選定的色譜條件測定峰面積，和相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)樣量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合后齊墩果酸線性回歸方程為：Y = 5.32×105X-1.06×104（r = 0.9999），熊果酸線性回歸方程為：Y = 5.04×105X-9.07×103（r = 0.9999）。齊墩果酸進(jìn)樣線性范圍為0.1048~2.6200 μg，熊果酸進(jìn)樣線性范圍在0.2304~5.7600 μg，線性范圍符合定量要求。

2.6 重復(fù)性考察

取青葉膽（江西）樣品6份，每份1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下步驟制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液10 μL，進(jìn)樣，測定其峰面積積分值，通過線性回歸方程計(jì)算待測組分的含量。齊墩果酸含量的RSD為1.7％(n = 6)，熊果酸含量的RSD為1.9%（n = 6），方法重復(fù)性良好。

2.7　加樣回收率試驗(yàn)[10-11]

精密稱取已知待測組分含量的青葉膽（江西）樣品9份，按高（120%）、中（100%）、低（80%）濃度分別加入相應(yīng)對(duì)照品適量，制備不同濃度的加標(biāo)樣品溶液。進(jìn)樣測定加標(biāo)樣品中齊墩果酸和熊果酸的總含量，按回收率計(jì)算方法計(jì)算得齊墩果酸平均回收率為96.5 %，RSD為1.4 %；熊果酸平均回收率為97.5 %，RSD為1.2 %。

2.8 峰純度檢測

為增強(qiáng)方法的定性能力，選定檢測波長、基線噪音及間隔起止時(shí)間等條件，采用Empower軟件適應(yīng)性選件自動(dòng)連續(xù)計(jì)算色譜圖的純度角和閾值，并繪制純度曲線和自動(dòng)閾值曲線。當(dāng)系統(tǒng)純度角小于閾值時(shí)，在噪音內(nèi)光譜均勻分布，色譜峰為純組分；當(dāng)系統(tǒng)純度角大于閾值時(shí)，表示有色譜組分有重疊[12]。對(duì)照品和樣品純度圖中齊墩果酸和熊果酸峰的純度角均小于自動(dòng)閾值，純度線均勻的處于閾值線下方（見圖2），表明此色譜分離條件下熊果酸、齊墩果酸及其他組分分離良好，待測組分色譜峰均為單一紫外吸收峰。

圖2 對(duì)照品(A,B)和樣品溶液(C,D)中齊墩果酸(1)和熊果酸(2)的峰純度分析

2.9 穩(wěn)定性考察

精密稱定粉碎后的江西產(chǎn)青葉膽藥材粉末1.0 g，制備樣品測試溶液，依次精密吸取供10 μL，于0~12 h內(nèi)每間隔2 h進(jìn)樣1次，測定齊墩果酸和熊果酸色譜峰峰面積，2個(gè)待測組分峰面積的 RSD 分別為1.5 %和2.1 %，待測組分在12 h內(nèi)穩(wěn)定[13]。

2.10 樣品含量測定

精密吸取不同產(chǎn)地青葉膽樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣，重復(fù)3次，測定樣品溶液中齊墩果酸和熊果酸的峰面積，根據(jù)組分積分值用線性方程計(jì)算待測組分的平均含量[10]。測定結(jié)果見表1。

表1 青葉膽不同樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量測定結(jié)果（%，n=3）

3 討論

在不同產(chǎn)地的青葉膽樣品中，廣西產(chǎn)樣品中的齊墩果酸含量最高，其含量為0.801 %，云南產(chǎn)樣品中含量最低，其含量為0.178 %；廣西產(chǎn)樣品中熊果酸含量最高，其含量為0.184 %，云南產(chǎn)樣品中最低，其含量為0.134 %。不同產(chǎn)地青葉膽中同分異構(gòu)體齊墩果酸和熊果酸的含量差異較大，但熊果酸含量均低于齊墩果酸，2組分含量均為廣西> 江西> 云南。

由于齊墩果酸和熊果酸在結(jié)構(gòu)式具有-COOH基團(tuán)，在甲醇水溶液中存在電離現(xiàn)象，磷酸的加入可抑制此現(xiàn)象的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水-磷酸體系（88∶12∶0.15）等度洗脫的分離效果和定性能力好，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中。且PDAD檢測器可在紫外及可見光波長范圍內(nèi)進(jìn)行三維數(shù)據(jù)采集（色譜加光譜），在以保留時(shí)間定性的基礎(chǔ)上，比對(duì)待測組分和對(duì)照品的光譜，并分析其峰的純度，方法的定性能力大為增強(qiáng)[14]。

本實(shí)驗(yàn)以云南、江西、廣西等產(chǎn)地的青葉膽為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其活性成分齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行了分離和含量測定，方法定量準(zhǔn)確，簡單易行，回收率高，可用于青葉膽中齊墩果酸和熊果酸含量的同時(shí)測定，為控制與評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

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CONTENT DETERMINATION OF OLEANOLIC ACID INBY RP-HPLC-PDAD

WANG Bo-long1,2, ZHANG Jun-lei1,2,*ZOU Sheng-qin1,2

（1.Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines,Yichun, Jiangxi 33600, China;2.College of Chemistry and Bioengineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China）

Objective: A precise and sensitive method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid inwas developed by RP-HPLC-PDAD. Methods: The two compounds were extracted by ultrasonic wave aided method with 95 % ethanol solution, and separated on a Kromasil C18column (5 μm 4.6 mm × 250 mm) at 30 ℃. A isocratic program was carried out at a flow rate of 0.9 mL·min-1using methanol-water-phosphoric acid (88:12:0.15, v/v/v) as the mobile phase. Results: The photodiode array detector was used for qualitative and quantitative analysis and the detection wavelength was set at 210 nm. Oleanolic acid and ursolic acid showed good linear relationship with the peak area (= 0.99999) at the range of 0.1048~2.6200 μg and 0.2304~5.7600μg, respectively with the respective recovery rates of 96.9% and 97.5%, and RSD of 1.7 % (n = 9) and 1.5 %(n = 9). Conclusion: The proposed method is accurate, simple and promises to be applicable for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in.

; oleanolic acid; ursolic acid; HPLC; photodiode array detector

1674-8085(2018)03-0084-04

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.03.017

2018-03-03；

2018-04-17

國家“863”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2002AA2Z3217）；江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YC2013-S286）

王博龍(1977-)，男，陜西扶風(fēng)人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物臨床前及臨床有效性、安全性評(píng)價(jià)研究(E-mail：wblong77@126.com);

張軍雷(1987-)，男，安徽亳州人，碩士生，主要從事藥物臨床前及臨床有效性研究(E-mail:ah-junlei@163.com);

*鄒盛勤(1970-)，男，江西奉新人，教授，主要從事天然產(chǎn)物活性成分提取與分析研究(E-mail:zsqycxy@163.com).