盧東升，任雨軒，周 營， 陳 陽

(1. 信陽師范學院 生命科學學院，河南 信陽 464000;2.信陽高級中學，河南 信陽 464000)

0 引言

空心蓮子草[Alternantheraphiloxeroides(Mart.)Griseb.]為莧科(Amaranthaceae)蓮子草屬(Alternanthera)多年生草本植物[1].其生態(tài)適應性強，繁殖迅速，現(xiàn)已成為常見野生雜草，在我國華東、華中、華南及西南等20多個省、市、自治區(qū)均有分布.該種植物常形成單一的優(yōu)勢群落，陸生型排擠了本土植物的正常生長，危害當?shù)氐纳锒鄻有?，在農田與農作物爭奪陽光、水分、肥料以及生長空間，造成減產，影響農田作業(yè)，同時，其群落內部本土植物的生長空間受到限制.空心蓮子草在水生環(huán)境中生長迅速，覆蓋水域，堵塞水道，影響淡水養(yǎng)殖和農田灌溉，成為世界公認的惡性雜草， 被列入國家環(huán)?？偩?003年公布的“中國第一批外來入侵生物名單”[2].人們對空心蓮子草的適應性、入侵機制、對當?shù)刂参锶郝浣M成及植物多樣性的影響和對其種群擴散的防控等進行了大量研究[3,4].據(jù)何麗爛等[5]報道，鏈格孢菌(Alternariasp.)及尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為空心蓮子草的致病菌.周兵等[6]研究了鏈格孢菌(Alternariaalternata)不同菌株對空心蓮子草的致病性.結果，鏈格孢菌不同菌株的致病性有明顯不同.前人對紫莖澤蘭、豚草等入侵植物內生真菌的生態(tài)功能進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)一些內生真菌對宿主植物或入侵地其他植物的種子發(fā)芽有顯著影響.陳志誼等[7]以紫莖澤蘭不同菌屬的內生真菌孢子液侵染不同植物的種子,觀察內生真菌對植物種子發(fā)芽率的影響.實驗用炭疽菌(Colletotrichum)、鏈格孢菌屬(Alternaria)、炭角菌屬(Xylaria)、擬莖點霉屬(Phomopsis)等真菌菌株51個，測試的植物有紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)、土牛膝(Achyranthesaspera)、柳葉箬(Isachneglobosa)、鳳尾莧(Amaranthuscaudatus)、鈕子瓜(Zehneriamaysorensis)、何首烏(Polygonummultiflorum)、地桃花(Urena)、黃花稔(Sidaacuta)、黃葵(Abelmoschusmoschatus)等9種.結果，在所測試的9種植物中,鏈格孢菌能夠對其中的7種植物致病, 炭疽菌能夠對8種植物致病,擬莖點霉可以使6種植物致病,炭角菌能夠對5種植物致病.這說明，紫莖澤蘭內生真菌中含有致病菌,當這些菌釋放出來時,能夠感染周邊部分植物并且降低了這些植物的種子發(fā)芽率,從而間接地增強了紫莖澤蘭的入侵力.TAN等[8]研究了豚草種子內生真菌發(fā)酵液對豚草種子發(fā)芽的影響.結果顯示，供試的內生真菌菌株的發(fā)酵液均不同程度地抑制豚草種子發(fā)芽.但內生真菌發(fā)酵液處理后的種子仍然保持較高程度的活力，不同內生真菌發(fā)酵液處理后,有活力的種子維持在50%～87.5%之間,均高于(或等于)清水處理的種子,說明內生真菌代謝產物只是抑制種子的發(fā)芽,但并不導致種子的腐爛和死亡.這些研究結果初步顯示種子攜帶的內生真菌可能在豚草入侵生物學中發(fā)揮重要的作用.但未見有關空心蓮子草內生真菌的報道.內生真菌是存在于健康植物體內的真菌種類，其對宿主植物的生長、發(fā)育、生理、生態(tài)以及對不良環(huán)境的抗性均有重要影響.因此，開展空心蓮子草內生真菌的研究，有助于了解其入侵機制，對該草的防控及內生真菌資源的利用具有重要意義.為此，于2017年7月至9月，對河南省信陽地區(qū)分布的空心蓮子草內生真菌種類、分布及多樣性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 標樣采集

在河南省信陽市選取5 個不同生境條件下的空心蓮子草樣地 (編號為 SY1、SY2、SY3、XYH、ZHL)，樣地情況見表1.選健康空心蓮子草植株，采集新鮮枝葉，裝入無菌紙塑料袋中，帶回實驗室備用，當天采集的材料當天完成植物組織的消毒及接種培養(yǎng).

表1 空心蓮子草5個樣地生境Tab. 1 The five sample plot habitats of Alternanthera philoxeroides

1.2 內生真菌的分離與鑒定

參照文獻[9]對葉棲內生真菌進行分離.

莖內生真菌分離前，用自來水反復沖洗去除表面雜物，晾干表面水后將莖切成3 cm長的莖段，分別用75%乙醇、2%次氯酸鈉、75%乙醇消毒2、10、1 min，不同消毒劑消毒后均用無菌水沖洗3次，最后用無菌紙吸去表面水后將莖段切成 0.5 cm 短段.將莖段接入PSA平板培養(yǎng)基，放入28 ℃恒溫箱內培養(yǎng)3～4 d，當組織塊出現(xiàn)明顯菌落時，依據(jù)菌落形態(tài)特征挑取不同真菌頂端菌絲轉接至PSA 斜面培養(yǎng)基進行純化，25 ℃恒溫培養(yǎng).將純化后的真菌再次接入PSA平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌落滿皿后，誘導產孢.觀察記錄菌落、菌絲、產孢結構及孢子形態(tài)結構特征，參照文獻[10-12] 進行鑒定.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計內生真菌在空心蓮子草組織內的種數(shù)、不同組織中的定殖率、分離率，參照文獻[13]計算其多樣性指數(shù)、相似性系數(shù).聚類分析用SPSS19統(tǒng)計軟件，以不同組織及不同樣地內生真菌種類組成、分離率、豐度、定殖率建立數(shù)據(jù)庫，經系統(tǒng)聚類，按組間連接方法計算區(qū)間平方歐氏距離，構建聚類樹形圖.

2 結果與分析

2.1 內生真菌種類及分布

本研究供試空心蓮子草健康組織774塊，經培養(yǎng)，有632塊得到了內生真菌，內生真菌的得菌率為81.7%.對內生真菌進行分離純化，共得到真菌菌株360個，經鑒定有真菌16種.15種為半知菌.經統(tǒng)計，不同真菌種類以及同種真菌在不同組織內的分離率存在較大差異.其中，曲霉1(Aspergillussp. 1)、曲霉2(Aspergillussp. 2)、刺盤孢菌(Colletotrichumsp.)、大莖點霉(Macrophomasp.)、彎孢霉菌(Curvulariasp.)在供試的各種組織均有分布，且分離率較高，是空心蓮子草的優(yōu)勢內生真菌，見表2.樣地不同，組織不同，其內生真菌的定殖率不同.供試的5個樣地中，以樣地XYH內生真菌的定殖率最高，達89.7%，樣地SY1內生真菌的定殖率最低，為76.8%.供試的5種組織中，以老莖定殖率最高，達90.9%，嫩莖的定殖率最低，為70.2%，見表3.另外，各樣地間，空心蓮子草內生真菌種群結構也存在明顯差異.單端孢菌、鐮刀菌和小穴殼菌等3種菌僅分布于樣地SY2，殼梭孢菌僅分布于樣地ZHL，青霉2僅分布于樣地XYH.這說明，空心蓮子草體外環(huán)境與體內環(huán)境對其內生真菌的群落結構有重要影響.

表2 空心蓮子草不同部位內生真菌種類及分離率Tab. 2 The endophytic fungal species and the separation rate of different parts of Alternanthera philoxeroides

續(xù)表2

表3 空心蓮子草不同部位內生真菌的定殖率Tab. 3 The endophytic fungi colonization rate in the different parts of Alternanthera philoxeroides

2.2 內生真菌的多樣性及相似性

空心蓮子草內生真菌有16種，種類較豐富.但樣地不同、組織不同，其內生真菌的豐度有明顯不同.樣地SY1、SY2、SY3、XYH、ZHL的真菌種數(shù)依次為10種、10種、6種、9種和10種.其中，樣地SY1、SY2、ZHL真菌種數(shù)較多，樣地SY3真菌種數(shù)較少.嫩莖、老莖、葉尖、葉中、葉基組織內的真菌種數(shù)依次為9種、10種、12種、9種、10種.以葉尖分離得到的真菌種類最多，老莖、葉基次之，嫩莖得到的真菌種類最少.對空心蓮子草不同樣地不同組織內生真菌多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計，結果，樣地不同、組織不同，其真菌多樣性指數(shù)也不同.其中，樣地ZHL最高，為2.13，樣地SY1最小，為1.87(表4).對不同樣地的空心蓮子草內生真菌群落進行比較，樣地之間的相似系數(shù)區(qū)別明顯.其中，樣地SY1與樣地SY3之間相似系數(shù)最大，為0.900，樣地SY2與樣地XYH之間相似系最小，為0.667(表5).上述結果說明，空心蓮子草的生境及組織類型對空心蓮子草的真菌豐度、多樣性及相似性都有影響.

表4 空心蓮子草不同部位內生真菌的多樣性指數(shù)Tab. 4 The endophytic fungi diversity index in the different parts of Alternanthera philoxeroides

表5 空心蓮子草不同樣地間內生真菌的相似系數(shù)Tab. 5 The endophytic fungi similarity coefficient between sample plot habitats of Alternanthera philoxeroides

2.3 聚類分析

以空心蓮子草5種組織內生真菌的群落結構、真菌種類及分離率為參數(shù)進行聚類分析，組織類型聚為2大類，老枝與嫩枝組織聚為一類，葉尖組織、葉中組織與葉基組織聚為一大類.葉器官3種組織中，葉尖與葉中聚為一小類，葉基為一小類(圖1).此結果說明，空心蓮子草組織類型越相似，其內生真菌群落結構及真菌種類也越接近.以空心蓮子草5個樣地內生真菌的定殖率及真菌豐度為參數(shù)進行聚類分析，樣地類型聚為3類，SY1、ZHL和SY2聚為一類，SY3和XYH各為一類(圖2).這說明，空心蓮子草生境對其內生真菌的定殖率及豐度有重要影響.SY1、ZHL和SY2三個樣地環(huán)境相似，均為光照充足的空曠之地.樣地SY3與XYH均為樹蔭下，與上述三個樣地差異較大，但樣地XYH為濕地，樣地SY3為旱地，二者濕度有較大差異，這與聚類分析結果較相似.

圖2 空心蓮子草內生真菌不同樣地聚類分析Fig. 2 The endophytic fungi cluster analysis of differentsample plots of Alternanthera philoxeroides

3 結論

空心蓮子草莖和葉棲居有內生真菌，但器官、組織不同，內生真菌種類不同，葉尖組織內生真菌種類最多.空心蓮子草內生真菌種類豐富，主要為半知菌.其中，曲霉1(Aspergillussp. 1)、曲霉2(Aspergillussp. 2)、刺盤孢菌(Colletotrichumsp.)、大莖點霉(Macrophomasp.)、彎孢霉菌(Curvulariasp.)是優(yōu)勢內生真菌.生境及組織類型對空心蓮子草內生真菌的群落結構及定殖率有重要影響.

本研究僅對空心蓮子草內生真菌多樣性進行了初步觀測，有關這些內生真菌生態(tài)功能以及他們在宿主植物入侵生物學中所具有的作用，均需要深入研究.