初 明，王月丹 （北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100191）

0 引言

2012年，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署公布的《全球環(huán)境展望5》中指出，每年有近200萬的過早死亡病例與顆粒物污染導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)?！睹绹鴩铱茖W(xué)院院刊》（PNAS）也發(fā)表了研究報告稱，人類平均壽命因?yàn)榭諝馕廴疽呀?jīng)縮短了約5年半［1］。2013年10月17日，世界衛(wèi)生組織下屬國際癌癥研究機(jī)構(gòu)首次指出大氣污染對人類致癌，并明確了顆粒物是主要的環(huán)境致癌物。

顆粒物污染系懸浮在空氣中的固體或液體顆粒物，因?qū)ι锖腿梭w健康造成危害而得名。顆粒物種類很多，一般指 0.1～75 μm 的化學(xué)煙霧、煤煙、煙、塵粒、粉塵和霧塵。其中，PM2.5是指大氣中直徑小于或等于2.5 μm的顆粒物，也稱為可入肺顆粒物，其直徑還不到人頭發(fā)絲直徑的1／20。與較粗的大氣顆粒物相比，PM2.5多為帶正電荷的“陽離子”顆粒，粒徑小，活性強(qiáng)，比表面積大，易附帶有毒、有害物質(zhì)，如重金屬、微生物等，且在空氣中停留的時間長，分散的距離遠(yuǎn)，因而對人體健康的影響更大。大量研究［2-10］表明，顆粒物直徑越小，進(jìn)入呼吸道的部位越深，直徑10 μm的顆粒物PM10通常沉積在上呼吸道，直徑小于2.5 μm 的顆粒物 PM2.5可深入細(xì)支氣管和肺泡，直接影響肺的通氣功能，造成肺組織的損傷，引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統(tǒng)炎癥，累及心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，并促進(jìn)癌癥的發(fā)生。PM2.5顆粒物污染不僅威脅人類的健康，而且對社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，結(jié)合科學(xué)研究，預(yù)防PM2.5迫在眉睫。本研究通過動物空氣暴露試驗(yàn)研究一種防PM2.5噴霧對空氣污染導(dǎo)致大鼠肺部炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的成年 SD大鼠，雄性40只，體質(zhì)量343～395 g。實(shí)驗(yàn)動物均購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，動物合格證號：SCXK（京）2011-0012，常規(guī)飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部的SPF級動物室，12 h光照，溫度22～24℃，濕度（55%±15%）。

1.2 主要試劑一種防 PM2.5噴霧（專利號：ZL201410108955.9，由北京意嘉健康科技有限公司提供）［11］，這種防 PM2.5噴霧能夠在皮膚的表面形成正電場，通過靜電排斥的原理有效減少PM2.5通過呼吸系統(tǒng)進(jìn)入肺部；RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（美國 Invitrogen公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；大鼠IL-4、IL-6和TNF-α的酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒（美國R＆D公司）。

1.3 主要設(shè)備大氣PM2.5吸入暴露裝置（由北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院提供）［12］。裝置的放置點(diǎn)距離北京市北四環(huán)西路1000米。北京市北四環(huán)西路是北京市的主干道，每日承載220 000輛機(jī)動車通行。室外大氣經(jīng)進(jìn)氣口導(dǎo)入染毒柜或潔凈柜后排出，氣流量 300～350 L／min。 氣體進(jìn)入染毒柜前經(jīng) PM2.5切割器濾除空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑≥2.5 μm的顆粒物，從而使進(jìn)入染毒柜內(nèi)的顆粒物直徑＜2.5 μm，且與外界PM2.5濃度保持一致；氣體進(jìn)入潔凈柜前經(jīng) PM2.5切割器過濾再經(jīng)高效空氣過濾器（high efficiency particulate air filter，HEPA）濾除全部顆粒物，使進(jìn)入潔凈柜內(nèi)的空氣不含大氣顆粒物。染毒柜與潔凈柜內(nèi)其他氣態(tài)污染物濃度相同。其他主要設(shè)備包括便攜式PM2.5檢測儀（KHS-PMA，北京清風(fēng)康華科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo MK3，美國 Thermo公司）；正置熒光顯微照相系統(tǒng)（BX53，日本 Olympus公司）；NanoDrop One分光光度計(jì)（美國Thermo公司）；實(shí)時熒光定量PCR儀（7500 Fast，美國Applied Biosystems公司）。

1.4 動物空氣暴露實(shí)驗(yàn)按照不同處理方法設(shè)過濾空氣-去離子水組（簡稱空氣-純水組）、空氣-防 PM2.5噴霧組（ 簡稱空氣-噴霧組）、PM2.5-純水組、PM2.5-噴霧組，每組10只，暴露時間為90 d。暴露點(diǎn)的空氣PM2.5濃度采用便攜式 PM2.5檢測儀檢測，每日 8：30、12：30 和 16：30 檢測暴露點(diǎn)實(shí)時 PM2.5水平，取平均值與國家環(huán)境監(jiān)測站的同期監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較?？諝?噴霧組和 PM2.5-噴霧組每日 8：30、12：30 和16：30對大鼠的口鼻及面部霧化噴霧10 s?？諝?純水組和PM2.5-純水組以霧化純水10 s處理。 其中，以空氣-純水組為陰性對照組，以PM2.5-純水組為陽性對照組。

1.5 標(biāo)本采集第91天，大鼠腹腔注射50 g／L戊巴比妥50 mg／kg。麻醉處死后，暴露氣管，氣管插管，結(jié)扎右肺葉，行左肺支氣管肺泡灌洗，每次3 mL，重復(fù)3次，回收率約83%，收集大鼠BALF。取右肺中葉（未經(jīng)灌洗），行4%多聚甲醛固定，并進(jìn)行病理組織切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 BALF中炎癥細(xì)胞因子含量檢測采用ELISA法，檢測BALF中IL-4、IL-6和TNF-α的含量。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，混勻，37℃孵育 2 h；洗板 3 次，每孔加入100 μL生物素標(biāo)記的抗體工作液（1∶10 000），37℃孵育1 h；洗板3次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素工作液，37℃孵育1 h；洗板3次，每孔加入 90 μL底物工作液，37℃避光顯色30 min后，每孔加50 μL終止液。反應(yīng)終止5 min內(nèi)酶標(biāo)儀檢測吸光度值，檢測波長為450 nm。

1.7 肺組織中炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)檢測采用qPCR法檢測大鼠肺組織中IL-4、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量。按照試劑盒說明書提取大鼠肺組織的總RNA，并進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄?；蛞镉缮虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限公司合成?；蛞镄蛄腥缦?。 IL-4：上游5’-CGA GCT CAC TCT CTG TGG TG-3’，下游 5’-GAA CGA GGT CAC AGG AGA A-3’；IL-6：上游 5’-GCT GGA GTC ACA GAA GGA G-3’，下游 5’-GGC ATA ACG CAC TAG GTT T-3’；TNF-α：上游 5’-GCC AGC CGA TGG GTT GTA-3’，下游 5’-GGT TGA CTT TCT CCT GGT ATG-3’；磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehydes-phosphate dehydrogenase， GAPDH）：上游 5’-CTC ATG ACC ACA GTC CAT GC-3’，下游 5’-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3’。采用SYBR?GREEN染料法行qPCR反應(yīng)，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對于GAPDH的變化倍數(shù)作為目的基因表達(dá)的相對水平，以相對于空氣-純水組的變化倍數(shù)來比較組間差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間連續(xù)計(jì)量資料的比較采用多因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用 LSD法。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［13］。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對大鼠 BALF中炎癥細(xì)胞因子含量的影響實(shí)驗(yàn)實(shí)施期間（2014-12-01／2015-02-28），暴露點(diǎn) PM2.5測得的濃度值范圍為 68.2 ～228.4 μg／m3，平均 127.6 μg／m3。 空氣暴露實(shí)驗(yàn)實(shí)施 90 d，與空氣-純水組比較，PM2.5-純水組大鼠 BALF 中 IL-4、IL-6 和TNF-α 的含量明顯升高（P＜0.01）。 與 PM2.5-純水組比較，PM2.5-噴霧組大鼠 BALF 中 IL-4、IL-6 和 TNF-α的含量明顯下降（P＜0.01）。 空氣-純水組與空氣-噴霧組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1，表1）。

圖1 PM2.5對大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子含量的影響

表1 PM2.5對大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子含量的影響（n＝10，±s，pg／mL）

表1 PM2.5對大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子含量的影響（n＝10，±s，pg／mL）

bP＜0.01 vs PM2.5-純水組。

組別 IL-4 IL-6 TNF-α空氣-純水組 112.11±39.21 231.51±49.21 252.64±45.33空氣-噴霧組 106.56±33.82 196.84±43.17 226.31±52.16 PM2.5-純水組 378.38±57.70 896.25±83.32 778.38±54.26 PM2.5-噴霧組 142.16±48.90b 272.30±38.90b 302.16±42.67b

2.2 PM2.5對大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)的影響空氣暴露實(shí)驗(yàn)實(shí)施90 d，與空氣-純水組比較，PM2.5-純水組大鼠肺組織中 IL-4、IL-6 和 TNF-α的 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。 與 PM2.5-純水組比較，PM2.5-噴霧組大鼠肺組織中 IL-4、IL-6 和TNF-α 的 mRNA 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。 空氣-純水組與空氣-噴霧組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖 2）。

圖2 PM2.5對大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

2.3 大鼠肺組織病理學(xué)改變空氣暴露實(shí)驗(yàn)實(shí)施90 d，空氣-純水組、空氣-噴霧組和 PM2.5-噴霧組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常。PM2.5-純水組肺間隔增厚，肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯淤血（圖3）。

圖3 大鼠肺組織病理學(xué)改變

3 討論

PM2.5顆粒物，又稱“可入肺顆粒物”，主要通過呼吸道進(jìn)入人體。值得注意的是，PM2.5也可通過吸附在皮膚的毛孔中，導(dǎo)致皮膚炎癥，特別是攜帶脂溶性有毒物質(zhì)的PM2.5顆粒更容易通過皮膚進(jìn)入人體。流行病學(xué)研究表明，長期暴露于空氣污染物中的人群，其死亡率與空氣污染物的濃度呈正相關(guān)。空氣中的病毒、細(xì)菌、灰塵和煙霧等PM2.5顆粒物均帶正電，負(fù)離子空氣凈化器即通過產(chǎn)生生態(tài)負(fù)離子中和沉降空氣中的PM2.5顆粒物。在此基礎(chǔ)上，本課題組研發(fā)了一種防PM2.5噴霧，其基本原理是在皮膚表面形成靜電場，通過靜電排斥的作用減少PM2.5顆粒物通過呼吸和皮膚進(jìn)入機(jī)體，發(fā)揮保護(hù)作用［11］。本研究選用PM2.5空氣污染物所致的SD大鼠肺損傷模型，探討這種防PM2.5噴霧對空氣污染導(dǎo)致大鼠肺部炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。

研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，成年小鼠 PM2.5顆粒物暴露后出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性和以嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)，同時IL-4分泌增加，而IFN-γ的表達(dá)水平無明顯變化，影響Th1／Th2的動態(tài)平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能異常。Th2細(xì)胞的過度活化會釋放大量的細(xì)胞因子，包括 IL-4、IL-6和 TNF-α等，加重氣道炎癥反應(yīng)［13］。本研究結(jié)果證明，大鼠長期暴露于PM2.5較高的環(huán)境下會導(dǎo)致肺部慢性炎癥，肺組織中炎癥細(xì)胞因子長期處于較高水平，引起肺間隔增厚、肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤及肺泡間隔淤血。值得注意的是，盡管PM2.5-噴霧組的大鼠同樣長期暴露于 PM2.5較高的環(huán)境，但是在使用防 PM2.5噴霧進(jìn)行干預(yù)后，未見明顯的肺組織病理學(xué)改變，而且在大鼠的肺組織和BALF中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平與暴露于潔凈空氣的大鼠相比，沒有明顯的差異，處于正常水平。這一結(jié)果證明了防PM2.5噴霧可明顯抑制肺部的炎癥反應(yīng)，對肺部發(fā)揮保護(hù)作用。鑒于PM2.5顆粒物暴露不僅可造成肺組織的損傷，而且可累及心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。因此，我們需要進(jìn)一步明確防PM2.5噴霧的保護(hù)作用，為全方面預(yù)防PM2.5顆粒物對人體造成的危害提供理論依據(jù)和可行方案。