張會(huì) 單雷 李新國(guó) 郭峰 孟靜靜 萬(wàn)書(shū)波 彭振英

摘要：?；?ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase，F(xiàn)AT）是控制植物種子油脂合成的關(guān)鍵酶，根據(jù)其氨基酸序列和底物特異性不同可分為FATA和FATB兩類。為了更深入了解花生FAT（AhFAT）的特點(diǎn)與功能，本研究對(duì)AhFAT家族基因進(jìn)行了全基因組生物信息學(xué)分析。在花生基因組中共有20個(gè)FAT基因，不均勻分布在2個(gè)基因組的12條染色體上。20個(gè)AhFATs可以分為AhFATA和AhFATB兩個(gè)亞家族，AhFATA亞家族有2個(gè)基因，AhFATB亞家族有18個(gè)基因。AhFATA家族基因具有6或8個(gè)外顯子，AhFATB家族基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，外顯子數(shù)目5～8個(gè)；AhFATs都不具有跨膜結(jié)構(gòu)域但是都具有保守的Acyl-ACP_TE結(jié)構(gòu)域。對(duì)AhFAT家族基因進(jìn)行可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)發(fā)生了可變剪接，且具有組織特異性。對(duì)AhFATs表達(dá)模式分析的結(jié)果顯示，AhFATAs和AhFATBs都在種子發(fā)育后期表達(dá)量較高。

關(guān)鍵詞：花生；?；d體蛋白硫酯酶（FAT）；可變剪接；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S565.2：Q7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）06-0019-08

Abstract Fatty acyl-ACP thioesterase （FAT） is the key enzyme regulating the synthesis of plant seed oil. According to the amino acid sequence and substrate specificity， FAT is divided into FATA and FATB subfamily. In order to better understand the characteristics of AhFAT gene family， the bioinformatics analysis was carried out. There were 20 AhFAT genes in the peanut genome， which heterogeneously distributed on 12 chromosomes in the two genomes. The twenty AhFAT genes could be divided into AhFATA and AhFATB subfamily， which had 2 and 18 members respectively. The AhFATA subfamily owned 6 or 8 exons， and the AhFATB subfamily had complex gene structures with 5～8 exons. None of the AhFATs had transmembrane domains， but they all owned the conserved Acyl-ACP_TE domain. The alternative splicing analysis of AhFAT gene family revealed that only a few AhFATs undergone alternative splicing and they had different splicing types in different tissues. The AhFATs expression pattern analysis results showed that both AhFATAs and AhFATBs expressed at higher levels in the later stage of seed development.

Keywords Peanut； Fatty acyl-ACP thioesterase （FAT）； Alternative splicing； Expression pattern

在高等植物中，脂肪酸生物合成是由位于質(zhì)體中的Ⅱ型脂肪酸合成酶催化完成的[1]。該反應(yīng)包括丙二酸單酰輔酶A與?；?ACP衍生物的聚合反應(yīng)，使?；兼溡悦總€(gè)循環(huán)增加兩個(gè)碳單位進(jìn)行延伸[2]。酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase， FAT）終止脂肪酸合成，水解?；虯CP之間的硫酯鍵，釋放出游離脂肪酸和ACP[3-6]。脂肪酸被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步酯化形成脂酰-CoA，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行脂肪酸鏈的延長(zhǎng)和脫飽和、磷脂和甘油三酯的合成等代謝[7，8]。FAT的特異性在很大程度上決定了大多數(shù)植物脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和不飽和度[9]。

FAT是由核基因編碼的質(zhì)體靶向的可溶性酶[7]。根據(jù)其氨基酸序列和底物偏好性分為FATA和FATB兩個(gè)亞家族[10，11]。FATA偏好不飽和?；?ACP，尤其對(duì)18∶1-ACP活性最高[12，13]。相反，F(xiàn)ATB通常對(duì)飽和酰基-ACP顯示出高活性，但是它對(duì)18∶1-ACP也有一定的活性[4，14]。目前，F(xiàn)AT基因已在擬南芥[15]、向日葵[12]、麻風(fēng)樹(shù)[16]、紫蘇[17]、椰子[18]、蓖麻[19]、毛白楊[14]等植物中相繼被克隆。

FAT的底物特異性對(duì)確定植物油的脂肪酸組成和含量具有重要意義[4，20-22]。如將擬南芥AtFATA在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)，脂肪酸組成沒(méi)有發(fā)生變化，但是重組菌株脂肪酸產(chǎn)量相比對(duì)照菌株提高了70%，同時(shí)胞外游離脂肪酸產(chǎn)量是野生菌株的7倍并占總脂肪酸含量的15%[23]。向日葵FATA1基因在大腸桿菌中表達(dá)導(dǎo)致細(xì)菌總脂肪酸含量增加，這種增加在游離脂肪酸中最顯著，而對(duì)照菌株中游離脂肪酸基本不存在[12]。Bonaventure等發(fā)現(xiàn)AtFATB基因發(fā)生斷裂后導(dǎo)致不同組織中飽和脂肪酸的總量相比于野生型擬南芥減少了40%至50%，其中棕櫚酸含量明顯降低[15]。這種減少只發(fā)生在飽和脂肪酸的胞質(zhì)池中，影響胞外磷脂的脂肪酸組成、莖和葉中蠟質(zhì)以及種子中三酰甘油的合成[24]。AtFATB基因的突變降低了突變體的生長(zhǎng)速率，導(dǎo)致幼苗在第4周時(shí)高度大約是野生型的一半。相反，在擬南芥過(guò)量表達(dá)AtFATB1則導(dǎo)致棕櫚酸積累，表明AtFATB1對(duì)擬南芥棕櫚酸的產(chǎn)量有一定影響[25]。隨后又在麻風(fēng)樹(shù)中克隆得到了FATB1基因，將JcFATB1基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致飽和脂肪酸含量增加，特別是棕櫚酸含量增加，而不飽和脂肪酸水平降低[16]。

花生（Arachis hypogaea L.）起源于南美洲，是我國(guó)重要的油料作物之一，在全球許多地區(qū)都有種植[26，27]?；ㄉ椭饕勺貦八幔?0%）、油酸（36%～67%）和亞油酸（15%～43%）組成[3]。由于FAT對(duì)于控制植物油中脂肪酸含量和組成具有重要作用，所以利用FAT降低花生種子中棕櫚酸的相對(duì)含量，改良油品質(zhì)具有重要意義。目前，關(guān)于AhFAT的研究多集中在異源表達(dá)和底物特異性研究方面。陳高從花生發(fā)育種子中克隆了AhFATA基因，該基因在花生所有組織中均有表達(dá)，而且在大腸桿菌中表達(dá)該基因可以改變其脂肪酸組成，導(dǎo)致棕櫚油酸和油酸積累[24]。后來(lái)陳高又從花生種子中克隆了AhFATB1基因，該基因在花生所有組織中均有表達(dá)，但是在未成熟種子表達(dá)量最高；當(dāng)其在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因菌株中肉豆蔻酸、棕櫚油酸和油酸含量顯著上升[24]。廖伯壽課題組分別從野生花生A. duranensis和A. ipaensis克隆了AhFATB1A和 AhFATB1B基因，分別屬于A-基因組和B-基因組[3]。但是到目前為止，有關(guān)AhFAT基因家族的全基因組研究報(bào)道較少。本研究針對(duì)AhFAT家族基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為研究AhFATs的特性及其對(duì)花生種子脂肪酸合成的影響提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AhFAT基因獲取

利用NCBI公布的花生AhFATA基因序列（GU324446.1）和AhFATB基因序列（EF117305.1）作為參考序列在花生基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Peanutbase（https：//www.peanutbase.org/）進(jìn)行比對(duì)，得到AhFAT基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2 AhFAT基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件將獲取的AhFAT氨基酸序列與NCBI中苜蓿（Medicago truncatula，Mt）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、大豆（Glycine max，Gm）的FATA（ACB29661.1、NP_189147.1、XP_006602508.1）和FATB（ADA79524.1、NP_172327.1 、XP_003522440.1）氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析序列之間的相似區(qū)域和保守性位點(diǎn)。為進(jìn)一步探究AhFAT的進(jìn)化關(guān)系，我們利用AhFATA（GU324446.1）和AhFATB（EF117305.1）氨基酸序列在植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中進(jìn)行Blast搜索。從藻類：杜氏鹽藻（Dunaliella salina，Dsa）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，Cre）；苔蘚類：小立碗蘚（Physcomitrella patens，Ppa）、地錢(qián)（Marchantia polymorpha，Mpo）；蕨類：卷柏（Selaginella moellendorffii，Smo）；單子葉植物：玉米（Zea mays，Zma）、水稻（Oryza sativa，Osa）、高粱（Sorghum bicolor，Sbi）；雙子葉植物：擬南芥（Arabidopsis thaliana，Ath）、大豆（Glycine max，Gma）、油菜（Brassica rapa，Bra）、棉花（Gossypium raimondi，Gra）、蓖麻（Ricinus communis，Rco）、黃瓜（Cucumis sativus，Csa）、毛果楊（Populus trichocarpa，Ptr）、苜蓿（Medicago truncatula，Mtr）、可可（Theobroma cacao，Tca）等17個(gè)物種中檢索出同源序列。將檢索得到的序列與AhFAT序列利用軟件MEGA 5.0進(jìn)行比對(duì)，采用臨接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000。利用TMHMM（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&group;=programs&subgroup;=proloc）分析跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位。利用在線SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因結(jié)構(gòu)。

1.3 AhFAT基因的可變剪接和表達(dá)模式分析

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)栽培花生‘豐花一號(hào)的根、葉、果針入土30 d（Seed1）和50 d（Seed2）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，已將數(shù)據(jù)上傳至NCBI（NCBI： PRJNA354652）。本試驗(yàn)根據(jù)該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中AhFAT的FPKM值，用HemI軟件進(jìn)行表達(dá)模式分析。用ASTALAVISTA program （http：//genome.crg.es/astalavista/）分析其可變剪接情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhFAT家族基因獲取

以NCBI中AhFATA（GU324446.1）和AhFATB（EF117305.1）作為參考序列在花生基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Peanutbase進(jìn)行搜索，找出了20個(gè)AhFAT基因（表1）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個(gè)AhFAT基因不均勻地分布于2個(gè)基因組中的12條染色體上，其中有9個(gè)位于A基因組，11個(gè)位于B基因組。Araip.B03上分布有4個(gè)AhFATs，Aradu.A01和Araip.B02各有3個(gè)，Aradu.A02上有2個(gè)，其余8個(gè)染色體上各有1個(gè)。AhFAT分為AhFATA和AhFATB兩個(gè)亞家族，AhFATA亞家族有2個(gè)基因Aradu.J7RE1和Araip.D1M07，它們是一對(duì)等位基因，分別位于Aradu.A04和Araip.B04上。AhFATB亞家族有18個(gè)基因，其中包含7對(duì)等位基因，分別位于7對(duì)染色體上。由于Araip.T3UA2基因不完整，可能會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生很大的誤差，所以不予分析。

2.2 多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

將AhFATs與其它物種FAT進(jìn)行比對(duì)（圖1），發(fā)現(xiàn)FATA和FATB在N端差異極大，由此推測(cè)N端的差異可能是造成兩個(gè)亞家族底物特異性不同的原因。而且FATB的序列基本都比FATA的序列要長(zhǎng)。所選其它物種兩個(gè)亞家族蛋白的氨基酸序列中都保留了三個(gè)類似木瓜蛋白酶類三聯(lián)體的保守殘基，而AhFAT個(gè)別序列中天冬酰胺N和組氨酸H與已知物種FATB和FATA序列中的保守殘基不同。FATA和FATB在第150至370氨基酸之間的核心區(qū)域保守性較高，表明兩亞家族之間存在著相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能[7]。

利用MEGA5.0對(duì)19個(gè)AhFATs與其它17個(gè)物種的FAT蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。結(jié)果顯示，F(xiàn)AT家族分成兩個(gè)大的分支，即FATA和FATB兩個(gè)亞家族，兩分支都具有高度的保守性；藻類植物單獨(dú)為一個(gè)分支，說(shuō)明各植物FAT與藻類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

在FATA亞家族分支中，苔蘚和蕨類植物單獨(dú)分為一支，單子葉和雙子葉植物也各自分為一支，花生Araip.D1M07和Aradu.J7RE1與苜蓿在同一分支上，表明兩者親緣關(guān)系較近。FATB亞家族基因數(shù)目比較大，分支也比較復(fù)雜，苔蘚和蕨類植物在同一分支上，單子葉植物和雙子植物還分為多個(gè)小的分支，這可能是由FATB亞家族的不同進(jìn)化過(guò)程造成。AhFATB家族與大豆、苜蓿的親緣關(guān)系較近，而與棉花、毛果楊、油菜、蓖麻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位分析

利用TMHMM分析19個(gè)AhFATs的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都不含有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于胞質(zhì)可溶性蛋白。但是該家族的基因都含有保守的Acyl-ACP_TE結(jié)構(gòu)域，是典型的植物硫酯酶家族成員。其中Aradu.8Y7VD、Araip.J6FGQ、Aradu.Q57RH、Aradu.J7RE1和Araip.D1M07都具有兩個(gè)Acyl-ACP_TE結(jié)構(gòu)域。利用ProtComp 9.0預(yù)測(cè)AhFATs的亞細(xì)胞定位（表1），結(jié)果表明除了Araip.MR3NT的定位不夠明確外，其余AhFATs都定位在葉綠體中。

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)AhFATs的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，AhFATA和AhFATB的基因結(jié)構(gòu)有不同特點(diǎn)。AhFATA家族有2個(gè)成員，分別具有6個(gè)和8個(gè)外顯子。AhFATB家族基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，它們的外顯子數(shù)目差別較大，從5個(gè)到8個(gè)不等（圖3）。等位基因的基因結(jié)構(gòu)類似，如Aradu.J7RE1和Araip.D1M07，Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y。有些基因的預(yù)測(cè)序列不完整，如Aradu.Q1LBD，其基因結(jié)構(gòu)與Araip.1PE3B的3′端類似，而缺少5′端部分序列。

2.5 可變剪接事件預(yù)測(cè)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)AhFAT的可變剪接事件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，在19個(gè)AhFATs中，有5個(gè)具有可變剪接現(xiàn)象，僅占26%（表2）。發(fā)生可變剪接的類型也較少，只有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可變剪接（TSS）、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)可變剪接（TTS）和外顯子末端可變剪接（AE）。TSS發(fā)生頻率最高，有12次；其次是TTS，有6次；AE僅發(fā)生3次。不同AhFAT的可變剪接具有明顯的差異。AhFATA亞家族的兩個(gè)基因在四個(gè)組織中都發(fā)生了可變剪接。Aradu.J7RE1和Araip.D1M07都發(fā)生了TSS和TTS，其中基因Aradu.J7RE1還發(fā)生了AE。AhFATB家族基因雖然多，但是大多都沒(méi)有發(fā)生可變剪接，只有Araip.SBA9Y、Aradu.ZG6C0和Aradu.8Y7VD發(fā)生了可變剪接，僅占16.7%；其中Araip.SBA9Y和Aradu.ZG6C0均發(fā)生了TSS，Aradu.8Y7VD發(fā)生了AE和TTS。

2.6 表達(dá)模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中各基因的FPKM值對(duì)AhFATs的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果表明，在20個(gè)AhFATs中，Aradu.ZL5SD、Araip.RRH7G、Araip.4509F、Araip.3B5IK在四個(gè)組織中都不表達(dá)，Aradu.Q1LBD、Araip.T3UA2、Aradu.0EA4R、Araip.S1TFK、Aradu.B3QR0、Aradu.D1B7C、Araip.J6FGQ、Araip.MR3NT、Aradu.Q57RH、Araip.1PE3B只在一個(gè)或者兩個(gè)組織中表達(dá)，只有6個(gè)基因在四個(gè)組織中都表達(dá)。AhFATB亞家族基因的表達(dá)量總體而言高于AhFATA亞家族。AhFATA家族的兩個(gè)基因Aradu.J7RE1和Araip.D1M07在四個(gè)組織中均有表達(dá)，且在種子發(fā)育后期表達(dá)量較高。AhFATB亞家族中Araip.21S3V、Aradu.8Y7VD、Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在四個(gè)組織中也均有表達(dá)，Araip.21S3V和Aradu.8Y7VD在種子發(fā)育后期表達(dá)量最高，表明二者在花生種子油脂合成中具有主導(dǎo)作用；Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在葉中表達(dá)量最高，顯示出二者在葉片脂肪酸合成中的重要作用。

3 討論與結(jié)論

花生是我國(guó)重要的油料作物，但是花生油的價(jià)值和品質(zhì)沒(méi)有橄欖等植物的油高，所以提高花生油品質(zhì)成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)。FAT能夠控制種子油脂肪酸組成和脂肪酸含量，所以對(duì)其進(jìn)行深入研究可以為調(diào)控花生油脂肪酸組成提供一定理論基礎(chǔ)。本研究對(duì)花生基因組中19個(gè)AhFAT基因進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)AhFATAs和AhFATBs且都具有保守的Acyl-ACP_TE結(jié)構(gòu)域，表明兩個(gè)亞家族的基因具有相似的功能[13]。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)亞家族的N端序列相似很低，由此推測(cè)N端的不同可能會(huì)造成它們的底物偏好性不同，這與王威浩等[7]發(fā)現(xiàn)植物FAT氨基酸序列的N端不保守性可能是進(jìn)化過(guò)程中植物根據(jù)自身特點(diǎn)所作出的選擇這一結(jié)果相似。序列比對(duì)還發(fā)現(xiàn)AhFAT個(gè)別序列的天冬酰胺N和組氨酸H與有關(guān)報(bào)道中三個(gè)保守氨基酸催化位點(diǎn)有所不同，這兩個(gè)位點(diǎn)的變化可能會(huì)導(dǎo)致AhFAT催化活性的變化[28]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)AhFATs分為AhFATA和AhFATB兩個(gè)大分支，F(xiàn)ATA家族成員相對(duì)FATB家族成員少很多，僅占整個(gè)家族的30.5%，而且FATB家族的分支也比較復(fù)雜，由此推測(cè)FATB具有不同的進(jìn)化途徑而造成FATB家族成員較多[29]。AhFATA和AhFATB與不同植物的FATA和FATB分別聚集在一起，說(shuō)明AhFAT的進(jìn)化與其它植物進(jìn)化類似[30]。

選擇性剪接是真核生物基因功能調(diào)控的一種重要方式。它在每一個(gè)生物過(guò)程中都起著重要作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡，調(diào)控胚胎和成體組織的分化，以及細(xì)胞對(duì)各種環(huán)境因素的反應(yīng)[31]。對(duì)花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，19個(gè)AhFAT基因只有少數(shù)產(chǎn)生了剪接事件，且在特定組織中發(fā)生，這與周晏秋[32]對(duì)獼猴桃組織特異性可變剪接事件研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)AhFATA家族兩個(gè)基因在花生四個(gè)組織都發(fā)生可變剪接，且發(fā)生的種類多，說(shuō)明這兩個(gè)基因的表達(dá)可能會(huì)受到可變剪接的調(diào)控[33，34]。

研究基因的表達(dá)模式對(duì)于了解基因的功能具有重要意義。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)AhFAT家族基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，AhFATAs和AhFATBs都在種子發(fā)育后期表達(dá)量較高，推測(cè)AhFAT家族基因?qū)φ{(diào)控花生種子油脂積累具有重要作用[24]。這與擬南芥中FATA活性降低后雖然沒(méi)有引起形態(tài)突變，但是導(dǎo)致擬南芥種子的含油量降為野生型含油量的50%的結(jié)果相一致[3]。陳高在研究AhFAT基因表達(dá)模式時(shí)發(fā)現(xiàn)AhFATB1基因在花中表達(dá)量最高；在花生果針入土第70天的種子中表達(dá)量達(dá)到最高峰[24]。AhFATB家族基因中Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在葉中表達(dá)量最高，表明其與葉片中脂肪酸合成相關(guān)。這個(gè)結(jié)果與先前擬南芥中FATB基因斷裂導(dǎo)致莖和葉中蠟質(zhì)和磷脂含量降低的結(jié)果相符[15]。

參 考 文 獻(xiàn)：

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