陳迎春 劉中香 王亞梅 李艷紅 董燕飛 相聰坤

(河北省中醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011)

β細(xì)胞受損引起胰島素分泌量降低，出現(xiàn)高血糖，引發(fā)1型糖尿病〔1〕。目前，治療糖尿病的主要手段為口服藥物、外源性胰島素的引入及胰島移植，但極易產(chǎn)生不對(duì)癥、胰島素耐受、移植胰島供體不足及排異現(xiàn)象〔2，3〕，因此尚無理想的治療手段。研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞〔4〕，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞也具有胰島β細(xì)胞的分化能力〔5～7〕，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞亦可分化為胰島素分泌細(xì)胞〔8，9〕。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)同樣具有多向分化潛能。研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯對(duì)糖尿病有一定的改善功效〔10，11〕。但有關(guān)葛根芩連湯聯(lián)合ADSCs移植治療糖尿病的研究尚不充分〔12～14〕。本研究探討聯(lián)合葛根芩連湯和ADSCs移植治療對(duì)糖尿病大鼠腎功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠75只由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0054。60～65日齡，體重200～240 g，環(huán)境：23～27℃，恒溫，濕度50%～70%，喂養(yǎng)飼料：顆粒型普通大鼠飼料及消毒無菌水，大鼠自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前1 d禁食不禁水。

1.2主要材料及來源 L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、混合抗生素(青霉素、鏈霉素)、檸檬酸-檸檬酸鈉、鏈脲佐菌素(STZ)均購自GIBCO公司，胰蛋白酶購于sigma公司，胰島素ELISA試劑盒(大鼠)購于Excell公司，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。PKH-26(Sigma公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱購于上海人和科技有限公司，全自動(dòng)生化儀購自日立公司(型號(hào)7170S)。超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)公司) 和熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3體外復(fù)蘇并培養(yǎng)ADSCs和標(biāo)記 取出實(shí)驗(yàn)室保存的ADSCs，以防冷凍管爆裂，置于37℃水浴，不間歇、輕輕搖動(dòng)冷凍管，快速融解后放置于無菌操作臺(tái)中，吸取細(xì)胞懸浮液。加至預(yù)先配置好的1∶10倍稀釋的L-DMEM培養(yǎng)基(胎牛血清與青霉素、鏈霉素混合，抗生素按10∶1比例配置)。于培養(yǎng)瓶中接種細(xì)胞，并靜置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換新鮮培養(yǎng)液，除去未貼壁細(xì)胞，至細(xì)胞融合85%時(shí)去除培養(yǎng)基，吸取貼壁細(xì)胞，加至培養(yǎng)皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用已配置的等體積的10%胎牛血清低糖培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞吹打成懸液，1 500 r/min，離心5 min，棄去上清非貼壁細(xì)胞，在新配置的無菌培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)濃度，依照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基，第五代P5供于該研究，吸取PKH-26液5 μl至1.5 ml的EP管中，加入1 ml完全培養(yǎng)液，吹打均勻，即得PKH-26標(biāo)記液。取貼壁達(dá)90%融合的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入上述標(biāo)記液40 μl/cm2，于37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，吸棄標(biāo)記液，加入37℃的完全培養(yǎng)液5 ml，孵育，10 min后吸棄，繼續(xù)加入培養(yǎng)液重復(fù)清洗2次。培養(yǎng)24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察PKH-26標(biāo)記效果和細(xì)胞形態(tài)變化。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)PKH-26陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算標(biāo)記率。標(biāo)記率=視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。移植時(shí)PBS洗滌細(xì)胞3次，將終濃度調(diào)為1×1010/L備用。

1.41型糖尿病大鼠模型建立及分組 75只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、糖尿病組、葛根芩連湯組、ADSCs移植組和聯(lián)合葛根芩連湯和ADSCs移植(聯(lián)合)組，每組15只。預(yù)先配置pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，并用此稀釋STZ為2% STZ注射液。5組均禁食12 h，正常對(duì)照組連續(xù)5 d于腹腔注射0.1 mol的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其余4組連續(xù)5 d于大鼠腹腔靜脈注射40 mg/kg的STZ注射液。并于尾部靜脈取血檢測(cè)造模結(jié)果。造模4 w后，葛根芩連湯組和聯(lián)合組灌胃葛根芩連湯，參考《傷寒論》取葛根250 g，黃連150 g，黃芩150 g，甘草100 g，用10倍重量的水對(duì)葛根與其余中藥分開浸泡20 min，先煮葛根20 min，然后加入其余已侵泡的藥湯繼續(xù)煮40 min，濾出湯劑，第二煎加入8倍重量的水，煎煮30 min，混合二次煎劑，濃縮至全方生藥量 2 g/ml，給予葛根芩連湯水煎液生藥量10 g/kg灌胃。糖尿病組灌胃等量生理鹽水。持續(xù)6 w正常飼養(yǎng)。ADSCs移植組和聯(lián)合組大鼠尾部注射300 μl ADSCs懸液(含5×106cell)。

1.5移植治療8 w后測(cè)定各組血糖、血清胰島素、血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)及24 h尿蛋白的水平 移植治療第8周，各組行眼眶取血測(cè)量血糖。于第8周用乙醚麻醉各組大鼠，經(jīng)大鼠主動(dòng)脈取血，取部分血漿按胰島素ELISA試劑盒說明書的方法，測(cè)定5組血清胰島素濃度。另取部分血液，室溫下，5 000 r/min，離心3 min，保留血清移去沉渣，-80℃保存?zhèn)溆?。肌酐測(cè)試(苦味酸不除蛋白法)試劑盒和BUN(OPA法)試劑盒分別用來測(cè)定SCr和BUN。SCr測(cè)試(苦味酸不除蛋白法)試劑盒組成為：R1 氫氧化鈉0.2 mol/L，苦味酸25 mmol/L。BUN(OPA法)試劑盒原理組成為R1：HADH、疊氮鈉。R2：α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、尿酸、疊氮鈉。移植治療第8周，收集各組24 h尿液，混勻，用移液槍各取尿量5 ml，5 000 r/min，離心3 min，吸取上清液，放入全自動(dòng)生化儀，檢測(cè)24 h尿蛋白水平。

1.6熒光顯微鏡觀測(cè)PKH-26標(biāo)記的ADSCs存活及分布 熒光顯微鏡觀察過程中保持低溫，保留組織微結(jié)構(gòu)完整。于移植細(xì)胞后8 w對(duì)組織切片進(jìn)行觀察，每張切片在高倍鏡(×200)下任取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中的PKH-26 陽性細(xì)胞數(shù)，取其均值。

1.7大鼠體重、腎重測(cè)量 于移植治療第8周后，測(cè)量正常對(duì)照組、糖尿病組、葛根芩連湯組、ADSCs移植組和聯(lián)合組體重，稱重3次取均值。后對(duì)以上5組大鼠腹腔麻醉，取左右雙腎組織，置于培養(yǎng)皿中稱重，計(jì)算腎重/體重比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ADSCs的觀察 分別在顯微鏡下觀察原代和P5代的ADSCs形態(tài)。原代的ADSCs形態(tài)各異，顯微鏡下可見菱形、圓形、不規(guī)則形，體積偏小，且可見少量雜質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到85%左右時(shí)，反復(fù)培養(yǎng)和傳代，細(xì)胞傳至第5代時(shí)，細(xì)胞多呈現(xiàn)長窄梭形，形態(tài)較規(guī)則，生長速度增快，出現(xiàn)細(xì)胞偽足，體積增大，未能觀察到雜細(xì)胞(圖1)。

圖1 體外培養(yǎng)ADSCs(×200)

2.2各組血糖、血清胰島素、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平 與糖尿病組比較，ADSCs移植組、葛根芩連湯組、聯(lián)合組血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白明顯降低，血清胰島素明顯升高(P<0.05)，聯(lián)合組更顯著(P<0.01)。見表1。

2.3PKH-26 標(biāo)記的ADSCs存活及分布 熒光顯微鏡下觀察，聯(lián)合組PKH-26陽性細(xì)胞最多，見圖2。葛根芩連湯組、糖尿病組及正常對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)被PKH-26染色的細(xì)胞。

表1 各組血糖、血清胰島素、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平比較

與糖尿病組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；表2同

圖2 ADSCs存活及分布(×200)

2.4各組體重、腎重變化 聯(lián)合組體重最接近正常對(duì)照組，且與ADSCs移植組和葛根芩連湯組體重相比，均有所升高，ADSCs移植組和葛根芩連湯組體重最低。腎重/體重比值即腎重指數(shù)：正常對(duì)照組最低，聯(lián)合組低于ADSCs移植組和葛根芩連湯組但稍高于正常對(duì)照組，糖尿病組腎重指數(shù)最高，可達(dá)0.82。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組體重、腎重及腎重指數(shù)

3 討 論

糖尿病最主要的危害是引起全身多器官慢性損傷，出現(xiàn)功能障礙，其中腎器官衰竭為最常見的器官損傷之一〔15～17〕。目前已有的治療糖尿病的方法均不能從根本上治愈。隨著基因工程的發(fā)展，研究者試圖利用干細(xì)胞的分化特性，分化出具有健全功能特性的胰島β細(xì)胞，改善機(jī)體胰島β細(xì)胞的水平。間充質(zhì)干細(xì)胞在脂肪中存在較多，具有高分化潛能。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與其他間充質(zhì)干細(xì)胞在多向分化、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理特性上并無明顯差異〔18〕，另外脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有方便取材、來源量大、具有較快增殖速度等優(yōu)勢(shì)，已成為越來越多的研究者關(guān)注對(duì)象〔19〕。大量研究結(jié)果表明，可高度自我復(fù)制和多向分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為胰島β細(xì)胞〔20，21〕。葛根芩連湯在我國歷史悠久，古人用葛根芩連湯治療濕熱引起的痢疾、腹瀉，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則已證實(shí)其可應(yīng)用于各科疾病，葛根芩連湯有消渴作用〔22〕，其在治療2型糖尿病上有一定的效果〔23〕，已有文獻(xiàn)證實(shí)了葛根芩連湯可降血糖、調(diào)血脂〔24〕，研究者發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯對(duì)多種動(dòng)物模型均有降血糖功效〔25〕，其機(jī)制可能是該湯劑促進(jìn)了肝糖原的合成。

ADSCs在體外復(fù)蘇和培養(yǎng)簡便易行，為后期的動(dòng)物移植提供了充分的原料。比較5組大鼠的血糖、血清胰島素、血SCr和BUN及24 h尿蛋白可知，ADSCs移植和葛根芩連湯聯(lián)用，可以有效控制大鼠的上述指標(biāo)，測(cè)試結(jié)果均最接近正常對(duì)照組。而ADSCs移植組、葛根芩連湯組大鼠血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平與糖尿病組相比明顯降低，血清胰島素明顯升高，提示單一使用ADSCs移植或單一灌胃葛根芩連湯對(duì)大鼠的血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平也有一定的改善。通過顯微鏡觀察也可發(fā)現(xiàn)，ADSCs在聯(lián)合組大鼠腎臟中分布廣于ADSCs移植組，因此葛根芩連湯對(duì)ADSCs是有促進(jìn)作用的。大鼠腎重指數(shù)也證實(shí)，聯(lián)合治療可對(duì)糖尿病大鼠腎臟起到保護(hù)作用。