崔 霞，穆 軍

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

絮凝劑作為一種常見的水處理試劑，廣泛用于不同的工業(yè)領(lǐng)域，按其分子組成可分為無機(jī)絮凝劑、合成有機(jī)高分子絮凝劑和天然高分子絮凝劑[1-2]。菲律賓蛤仔黏附污泥作為一種已被報(bào)道的新型天然生物絮凝劑，具備絮凝、脫色、重金屬去除等典型微生物絮凝劑活性，且能自然沉淀、適合淡水和海水處理[3-6]。菲律賓蛤仔黏附污泥是一種具有復(fù)雜生態(tài)關(guān)系的活性生物污泥，周海軍等[7]在探究其絮凝活性產(chǎn)生機(jī)制過程中，選取了影響菲律賓蛤仔生態(tài)環(huán)境的生物因素，包括抑制細(xì)菌(加青霉素和鏈霉素)，抑制真菌（加灰黃霉素和5-氟胞嘧啶），無菌（加青霉素，鏈霉素，灰黃霉素和5-氟胞嘧啶）等，以及不加泥沙棲息地的非生物影響因素，以正常養(yǎng)殖條件下的菲律賓蛤仔作為對照組，通過高嶺土懸濁液絮凝活性測定方法對比各影響因素下的菲律賓蛤仔黏附污泥絮凝性能后發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在黏附污泥絮凝機(jī)制中起到重要作用，泥沙棲息環(huán)境是黏附污泥具有絮凝活性的必要非生物因素。值得注意的是，在加入青霉素，鏈霉素等抗生素的蛤仔暫養(yǎng)系統(tǒng)中，收集的菲律賓蛤仔黏附污泥仍具有一定的絮凝活性，將該條件下的黏附污泥進(jìn)行微生物分離篩選后，獲得了一批耐藥型絮凝活性菌，但目前針對耐藥絮凝活性菌的微生物多樣性及其物種組成還尚未進(jìn)行探討。

本文利用Illumina高通量測序方法研究了抑制細(xì)菌條件下的菲律賓蛤仔黏附污泥中耐藥型絮凝活性菌的微生物組成，同時(shí)，對多數(shù)菌落形態(tài)相似的代表性耐藥絮凝活性菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)與16S rDNA鑒定，旨在探討菲律賓蛤仔抗生素脅迫暫養(yǎng)下黏附污泥的耐藥絮凝活性菌的物種組成，目前，這是首個(gè)關(guān)于菲律賓蛤仔粘附污泥中耐藥型絮凝活性菌微生物組成的研究。

1 材料與方法

1.1 耐藥絮凝活性菌的來源

選取加入青霉素，鏈霉素等抗生素養(yǎng)殖系統(tǒng)中的菲律賓蛤仔，收集其所吐黏附污泥，通過與無菌水混合進(jìn)行梯度稀釋，在含有抗生素的固體平板培養(yǎng)基上涂布分離，培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g，酵母膏0.5 g，尿素0.5 g，硫酸銨0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫鉀2.0 g，磷酸氫二鉀5.0 g，青霉素0.06 g，鏈霉素0.08 g，瓊脂20 g，溶解于1 L的陳化海水中，pH值7.2～7.4，培養(yǎng)基在115°C條件下滅菌30 min。涂布后的培養(yǎng)基在25°C下培養(yǎng)7 d，隨機(jī)挑選單菌落并進(jìn)行劃線分離后，獲得50株純化的耐藥細(xì)菌。將純化的耐藥細(xì)菌分別接種到液體培養(yǎng)基中（與固體培養(yǎng)基成分相同，不含瓊脂），25°C、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)后的發(fā)酵液上清液通過高嶺土懸濁液來測定其絮凝活性，最終篩選得到50株具有30%左右絮凝活性的耐藥細(xì)菌[7]。

1.2 耐藥絮凝活性菌的DNA提取

使用TaKaRa全基因組提取試劑盒DNA Extraction Kit Ver.3.0進(jìn)行耐藥細(xì)菌DNA的提取和純化。

（1）菌體裂解：將50株耐藥絮凝活性菌混合發(fā)酵培養(yǎng)，取細(xì)菌發(fā)酵液到離心管中，12 000 r/min條件下離心2 min，棄掉上清液，加入500 μL Buffer BS緩沖液得到細(xì)胞懸浮液，再加入50 μL Lysozyme溶菌酶充分混合，在37°C水浴中加熱60 min；將加熱后的混合液在12 000 r/min條件下離心5 min，丟棄上清液；向離心后的物質(zhì)中加入180 μL Buffer GL緩沖液，20 μL Proteinase K蛋白酶和10 μL Proteinase A蛋白酶，充分混勻后置于56°C水浴中加熱10 min；最后向溶液中加入200 μL Buffer GB緩沖液和200 μL無水乙醇，充分混合。

（2）DNA的提取與純化：將步驟（1）中的溶液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)柱，再插入收集管中，12 000 r/min條件下離心2 min，棄掉下部過濾液；取500 μL Buffer WA緩沖液加入旋轉(zhuǎn)柱中，12 000 r/min條件下離心1 min，棄掉下部過濾液；再取700μLBufferWB緩沖液沿管壁加入旋轉(zhuǎn)柱中，以清除沾附于管壁上的鹽份，12 000 r/min條件下離心1 min，再次丟棄過濾液。重復(fù)加入700 μL的Buffer WB緩沖液進(jìn)行離心過濾。將上述步驟操作后的旋轉(zhuǎn)柱放入新的1.5 mL試管中，在膜的中心處加入50～200 μL的無菌蒸餾水，室溫靜置5 min，12 000 r/min條件下離心2 min洗脫DNA。將提取的基因組DNA通過1%的凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 PCR擴(kuò)增和Illumina Miseq測序

通常對于細(xì)菌多樣性分析，選用16S rDNA的V3-V4區(qū)域用于擴(kuò)增構(gòu)建，PCR擴(kuò)增使用常見引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')。取適量的DNA樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。取稀釋后的DNA（50 ng）作為聚合反應(yīng)的模板，反應(yīng)中包含1 μL正向和反向引物，15 μL的2xTaq Master Mix溶液（Vazyme，南京）和13 μL的ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94 °C 預(yù)變性5 min，90 °C 變性 30 s，60 °C退火30 s，72°C延伸30 s，變性到延伸反應(yīng)需25～35個(gè)循環(huán)，最后反應(yīng)在72°C修復(fù)延伸7 min，并在4°C條件下終止反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物使用1%的凝膠電泳檢測，檢測后使用AMPure XP beads(Agencourt AMPure XP kit)進(jìn)行磁珠純化，取1 μL純化過的一輪產(chǎn)物進(jìn)行濃度檢測，將檢測后的PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增，再次使用電泳檢測，檢測后進(jìn)行二次磁珠純化。純化后的PCR產(chǎn)物通過Qubit dsDNA檢測試劑盒(Life Technologies)進(jìn)行定量，再用Agilent生物分析儀2100(美國)進(jìn)行檢測。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4 測序原始數(shù)據(jù)處理

將PCR產(chǎn)物通過Illumina Miseq測序平臺進(jìn)行測序，將得到的雙端序列通過Trimmomatic(Version 0.35)軟件[8]和FLASH(Version 1.2.11)軟件[9]進(jìn)行去雜和優(yōu)質(zhì)序列拼接；生成的序列嵌合體使用UCHIME(Version 4.2)軟件[10]進(jìn)行去除，作為下一步分類學(xué)單元聚類的優(yōu)質(zhì)序列。將上述預(yù)處理生成的優(yōu)質(zhì)序列采用CD-HIT方法[11]進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）挑選聚類，采用Naive Bayesian分類算法[12]將97%相似水平的代表序列歸為一個(gè)分類單元OTU，并挑選OTU分類中豐度最大的序列作為代表序列，與Greengenes數(shù)據(jù)庫[13]進(jìn)行比對，生成OTU分類表格。挑選出TOP100的OTU通過Figtree軟件[14]對進(jìn)化樹進(jìn)行呈現(xiàn)。同時(shí)，采用相同分類算法，將100%相似水平下的代表序列歸為一個(gè)分類單元OTU，并挑選OTU分類中豐度最大的序列作為代表序列，與Greengenes數(shù)據(jù)庫[13]進(jìn)行比對，生成100%相似水平下OTU分類表格。

在97%相似度進(jìn)行的OTU分類條件下，抽樣計(jì)算了不同深度的Alpha多樣性指數(shù)，其中，Chao指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)；Gini-simpson和Shannon Wiener指數(shù)，即估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)，反應(yīng)樣品中微生物群落的豐富度和均勻度。Good＇s coverage指數(shù)反應(yīng)樣品中微生物群落內(nèi)的物種豐度性程度。

1.5 耐藥絮凝活性菌的鑒定

在分離篩選得的50株耐藥絮凝菌中，取兩株代表性耐藥絮凝活性菌，用奧林巴斯CX41生物顯微鏡觀察兩株菌的形態(tài)特征。兩株耐藥絮凝活性菌的DNA按照DNA提取試劑盒(TianGen，中國)方法進(jìn)行提取，細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增采用GeneAmp?9700 PCR 儀(ABI，美國)；PCR 反應(yīng)體系包括 1 μL 的 10 μM 引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1 μL 的 10 μM 引物 1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')，1 μL DNA 模板，1 μL 的 2xTaq Master Mix 溶液(Vazyme，南京)，加 ddH2O 將反應(yīng)體系至30 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 °C 預(yù)變性 5 min，95 °C 變性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min，變性到延伸反應(yīng)需35個(gè)循環(huán)，最后反應(yīng)在72°C修復(fù)延伸7 min，并在4°C條件下終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，進(jìn)行上機(jī)測序。將16S rDNA測序結(jié)果分別在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，采用MAGA6.0軟件將兩株耐藥絮凝活性菌和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中與菌株相對應(yīng)的前20個(gè)同源性較高的模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐藥絮凝活性菌群的微生物多樣性分析

樣品GNHY.B通過高通量測序共得到30 168條優(yōu)化序列，平均長度分布在440～449 bp。在97%相似性水平上，樣品共得到967個(gè)OTUs，挑選出豐度最高的前TOP100 OTUs構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示，并計(jì)算出TOP100的OTUs所占豐度值。樣品的Alpha多樣性指數(shù)分別以1 000為一個(gè)步長，在每個(gè)步長進(jìn)行10次重復(fù)抽取序列來計(jì)算。由表1可知，Good’s Coverage指數(shù)為0.975 2，指數(shù)越接近1說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品的所有物種；表1中的Shannon Wiener與Gini-Simpson指數(shù)值分別為2.65和0.59，根據(jù)Shannon Wiener與Gini-Simpson指數(shù)的計(jì)算方法[15-16]可知，均低于相對理論計(jì)算值，表明樣品GNHY.B中的微生物多樣性較低。

經(jīng)測定的菲律賓蛤仔黏附污泥耐藥細(xì)菌群落的原始數(shù)據(jù)提交在 NCBI（National Center of Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中，登錄號為SRP138342。

圖1 耐藥絮凝活性菌群TOP100 OTUs的物種發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenic tree of TOP100 OTUs in drugresistant bioflocculant-producing bacterial community

表1 耐藥絮凝活性菌群的微生物多樣性指數(shù)Tab.1 Richness and diversity estimation of drug-resistant bioflocculant-producing bacterial community based on MiSeq sequencing

2.2 耐藥絮凝活性菌群的微生物組成分析

根據(jù)97%相似度進(jìn)行的OTU分類學(xué)結(jié)果，分析樣品GNHY.B中細(xì)菌群落的相對豐度。結(jié)果表明，樣品GNHY.B共覆蓋7個(gè)門，以變形菌門Proteobacteria為主，所占比例為99.71%；共包含21個(gè)綱，37個(gè)目，57個(gè)科和56個(gè)屬，以變形菌門Proteobacteria中的γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，交替單胞菌目Alteromonadales，交替單胞菌科Alteromonadaceae，Glaciecola屬為主，各鑒定水平下的代表群落均占樣品相對豐度的99%以上，如圖2所示為樣品GNHY.B在屬的水平下的群落結(jié)構(gòu)分布圖。鑒定結(jié)果中雖然顯示出樣品中含有其他物種，但其豐度值總和占樣品相對豐度不到1%的比例，因此，耐藥絮凝活性菌樣品GNHY.B主要以最高豐度的細(xì)菌屬類Glaciecola為主。樣品GNHY.B在100%相似度下進(jìn)行OTU分類的結(jié)果表明，最高豐度群落為變形菌門Proteobacteria中的屬類Glaciecola，所占比例為99.33%，與樣品GNHY.B在97%相似度進(jìn)行OTU分類的結(jié)果相同。鑒定結(jié)果再次表明了樣品GNHY.B微生物群落結(jié)構(gòu)的單一性，并初步推斷在抑制細(xì)菌的蛤仔暫養(yǎng)系統(tǒng)中，所收集的菲律賓黏附污泥樣品篩選出的50株耐藥絮凝活性菌大部分可能屬于同一物種。

圖2 耐藥絮凝活性菌群屬水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.2 Microbial community structure distribution of drug-resistant bioflocculant-producing bacterial community at genera level by 16S rDNA sequencing

2.3 耐藥絮凝活性菌的鑒定結(jié)果

耐藥絮凝活性菌GHNY-1與GHNY-2的菌落形態(tài)特征均為小圓形、凸起、乳白色微黃、邊緣整齊、平滑；通過細(xì)胞的簡單染色與顯微鏡觀察，耐藥絮凝活性菌GHNY-1與GHNY-2的細(xì)胞形態(tài)如圖3所示，均為卵形細(xì)胞。16S rDNA測序結(jié)果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對可知，耐藥絮凝活性菌GHNY-1、GHNY-2與菌株P(guān)araglaciecola chathamensis的同源性分別為99.24%和99.09%。如圖4所示，為耐藥絮凝活性菌GHNY-1、GHNY-2和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的前20個(gè)同源性較高的模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中，系統(tǒng)發(fā)育樹中最接近的進(jìn)化枝為相應(yīng)相似性最高的模式菌株P(guān)araglaciecola chathamensis。由于SHIVAJI,et al[17]在2014年已將屬Glaciecola重新劃分為兩個(gè)屬，即Glaciecola與Paraglaciecola，其中，Paraglaciecola chathamensis為 Glaciecola chathamensis重新鑒定后的物種；原物種Glaciecola chathamensis首次發(fā)現(xiàn)于太平洋的沉積物中，是一種胞外多糖產(chǎn)生菌，在海水配制的固體培養(yǎng)基上形成平滑，凸起，無色素的菌落，為卵形或彎曲的桿狀細(xì)胞[18]。結(jié)果表明，耐藥絮凝活性菌GHNY-1、GHNY-2的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)與物種Glaciecola chathamensis具有較高的相似性，與其重新鑒定后的物種Paraglaciecola chathamensis的同源性最高，均在99%以上，因此，均被鑒定為Paraglaciecola sp.。

圖3 耐藥絮凝活性菌GHNY-1(A)與GHNY-2(B)的細(xì)胞形態(tài)圖Fig.3 Cell Morphology images of drug-resistant bioflocculant-producing bacteria GHNY-1(A)and GHNY-2(B)

將耐藥絮凝活性菌GHNY-1、GHNY-2的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號分別為：MH261367，MH261368。

3 結(jié)論

以菲律賓蛤仔抗生素脅迫暫養(yǎng)下的黏附污泥中分離出的50株耐藥絮凝活性菌為研究對象，利用Illumina高通量測序方法研究了其微生物組成，同時(shí)，對代表性的耐藥型絮凝活性菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)與16S rDNA鑒定，結(jié)果表明，以97%相似度進(jìn)行OTU分類，Alpha多樣性指數(shù)表明耐藥絮凝活性菌的微生物多樣性較低，微生物群落組成分析表明耐藥絮凝活性菌以屬Glaciecola為主，所占豐度比例為99.33%；以100%相似度再次進(jìn)行OTU分類，鑒定結(jié)果與97%相似度下的OTU分類結(jié)果和物種組成相同，初步表明耐藥絮凝活性菌的物種組成主要為同一物種；選取耐藥絮凝活性菌GHNY-1和GHNY-2，將其16S rDNA測序結(jié)果分別在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對可知，同源性最高的模式菌株均為Paraglaciecola chathamensis，該模式菌株為Glaciecola chathamensis重新鑒定后的新物種，同時(shí)物種Glaciecola chathamensis與耐藥絮凝活性菌GHNY-1和GHNY-2的菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)方面展現(xiàn)出了高度相似性，因此均被鑒定為Paraglaciecola sp.。本研究證明了菲律賓蛤仔抗生素脅迫暫養(yǎng)下的黏附污泥具有絮凝活性，在生物因素方面主要是由于耐藥絮凝活性菌Paraglaciecola sp.的存在，同時(shí)也從耐藥菌出現(xiàn)的角度證實(shí)了細(xì)菌是菲律賓蛤仔黏附污泥活性成分的產(chǎn)生源。

圖4 菌株GHNY-1，GHNY-2與其在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中前20個(gè)同源性較高的模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.4 The phylogenetic relationship of the strains GHNY-1,GHNY-2 and their top 20 closely related type strains identified in the EzBioCloud's database