王春理 邊森 李剛 趙瑞鵬 石一李鵬翠 衛(wèi)小春

作者單位：030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 是一種中老年人常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性病變，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹和畸形等。大多數(shù)患者確診時(shí)已為 OA 晚期，只能進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。早期診斷預(yù)測(cè) OA 的發(fā)生，人為干預(yù)OA 的進(jìn)展，有助于 OA 的早期治療[2]。

雖然有研究表明 OA 的發(fā)病與增齡、創(chuàng)傷、負(fù)重、遺傳等因素密切相關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚[3-6]。有研究認(rèn)為，OA 的發(fā)病是各因素導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨的異常分化，這種分化類(lèi)似于胚胎期軟骨內(nèi)成骨和發(fā)育期骨骺生長(zhǎng)板軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨的終末分化[5]。在軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程中，軟骨細(xì)胞經(jīng)歷增殖、成熟、終末分化 ( 肥大化、骨化、凋亡自噬 ) 的過(guò)程。肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)十型膠原 ( type X Collagen，COL X ) 和基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteases，MMPs ) 來(lái)誘導(dǎo)軟骨降解[7]，它們被認(rèn)為是典型的肥大化的標(biāo)志物。關(guān)節(jié)的透明軟骨與軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中的透明軟骨具有同源性。而在正常成年人的關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)軟骨細(xì)胞成熟后并不會(huì)出現(xiàn)肥大化等終末分化的改變[5-6]，這種肥大化的表達(dá)卻會(huì)在成年 OA 軟骨中發(fā)生。

印度豪豬 ( Indian hedgehog，Ihh ) 蛋白主要由前肥大軟骨細(xì)胞合成和分泌，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的肥大化和軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程[8]。前肥大細(xì)胞分泌的 Ihh 蛋白與軟骨細(xì)胞的跨膜受體 patched 1 ( Ptch1 )結(jié)合，使原本與 Ptch1 緊密結(jié)合的跨膜蛋白的Smoothened ( Smo ) 解除抑制，激活 Hh 通路，激活了下游轉(zhuǎn)錄因子 Gli1、2、3 的活性，活化的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，激活相應(yīng)的靶基因表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化的進(jìn)程[8]。在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞，Ihh可以通過(guò)激活 Gli 來(lái)誘導(dǎo) Runx2 表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化[9]。因此，Hh 信號(hào)通路的激活有一系列下游基因的參與，檢測(cè)這些基因的表達(dá)也可反映 Hh 信號(hào)通路的活性[10]。

前期有研究者運(yùn)用基因鼠發(fā)現(xiàn)，激活 Hh 信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄且蛋白多糖含量減少，而抑制 Hh 信號(hào)通路則導(dǎo)致相反的結(jié)果[8]，上調(diào) Hh 信號(hào)通路的活性會(huì)加重關(guān)節(jié)退變和軟骨細(xì)胞肥大化的程度[11]。對(duì)人膝關(guān)節(jié) OA 的研究發(fā)現(xiàn)，Ihh促進(jìn)了軟骨細(xì)胞肥大化，并且增加了 MMP-13 的的表達(dá)[3]；條件性敲除 Ihh 基因可延緩小鼠 OA 的進(jìn)程[12]。因此，在人和鼠中，Ihh 都發(fā)揮了促進(jìn) OA 進(jìn)展的作用。近期有直接證據(jù)表明，在人膝軟骨損傷早期，關(guān)節(jié)滑液中 Ihh 的濃度與關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度相關(guān)[13]。據(jù)此推斷，滑液中 Ihh 可能成為早期發(fā)現(xiàn)軟骨損傷新的生物標(biāo)記物[13-14]。但 Ihh 在損傷后隨時(shí)間進(jìn)展中的表達(dá)情況尚不清楚，且抽取滑液對(duì)關(guān)節(jié)損傷較大，作為預(yù)防診斷的實(shí)用性較差。

本實(shí)驗(yàn)探究大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎 ( PTOA ) 早期進(jìn)展中 Ihh 表達(dá)量的變化情況，探討 Ihh 作為生物標(biāo)志物早期預(yù)測(cè) OA 的可能性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

3 月齡健康雄性 SD 大鼠 ( 山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心 ) 80 只，重量 ( 120±20 ) g，采用數(shù)字隨機(jī)表法分為 8 組：偽手術(shù)組 ( Sham 組 )、實(shí)驗(yàn) 1 天組、實(shí)驗(yàn)3 天組、實(shí)驗(yàn) 7 天組、實(shí)驗(yàn) 2 周組、實(shí)驗(yàn) 4 周組、實(shí)驗(yàn) 2 個(gè)月組、實(shí)驗(yàn) 3 個(gè)月組，每組 10 只。每組大鼠實(shí)驗(yàn)前體重用單因素方差分析，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. PTOA 大鼠模型的建立[15]：所購(gòu)大鼠適應(yīng)環(huán)境 5 天，實(shí)驗(yàn)組行前交叉韌帶切斷術(shù) ( ACLT )，Sham 組僅打開(kāi)關(guān)節(jié)囊。術(shù)前 1 天備物 ( 高壓滅菌烘干 )。10% 的水合氯醛 ( 0.3 ml / 100 g ) 腹腔注射麻醉，待大鼠睫毛反射消失、肌松程度良好，即達(dá)到麻醉狀態(tài)。碘伏消毒 3 次、鋪單、暴露右膝，固定大鼠右膝伸直位，提拉膝部皮膚、切開(kāi)，沿髕骨內(nèi)側(cè)緣打開(kāi)關(guān)節(jié)囊約 2 cm，抽屜試驗(yàn)確定無(wú)脛骨移位，切斷前交叉韌帶。檢查抽屜試驗(yàn)有明顯脛骨向前移位，視為造模成功。生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，縫合關(guān)閉關(guān)節(jié)囊，皮膚外翻縫合，術(shù)后注射青霉素4 U。術(shù)后連續(xù) 3 天腹腔注射青霉素 ( 4 U / 次，1 次 /日 )，并觀(guān)察傷口有無(wú)出血、感染、撕咬開(kāi)線(xiàn)等不良情況，及時(shí)處理。

2. 取材與保存：ACLT 組各組大鼠依時(shí)間點(diǎn)處理：10% 水合氯醛 ( 2 ml / 只 i.p ) 麻醉，心臟取血4～5 ml，追加麻醉處死大鼠，分離右后肢，攝 X 線(xiàn)片；6 只分離脛腓骨，刮取關(guān)節(jié)軟骨放入 EP 管 ( 裝有 2.5 ml EDTA )，-80 ℃ 條件保存；其余 4 只膝關(guān)節(jié)剝除多余軟組織，用于組織切片。血樣冰上靜置30 min，離心 ( 4000 rmp、r＝10 cm，10 min )，取上層血清于 2.5 ml EP 管，-80 ℃ 條件保存。Sham 組每對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)處理 1 只，攝 X 線(xiàn)片、取血樣，刮取軟骨，最后時(shí)間點(diǎn)全部處理，留取關(guān)節(jié)，標(biāo)本保存條件同上。各階段樣本統(tǒng)一處理。

3. 右膝攝 X 線(xiàn)片：用小動(dòng)物 X 線(xiàn)機(jī)掃描分離的右后肢，攝取正、側(cè)位 X 線(xiàn)片，保持每次攝取固定位置相同。

4. 印度墨水染色：10 ml 印度墨水+10 ml 蒸餾水配成染液，剝離軟組織的關(guān)節(jié)軟骨浸于染液中 5 min，流動(dòng)水沖洗 3 min，顯微鏡下拍照觀(guān)察，印度墨水染色按照改良 Mankin’s 評(píng)分評(píng)價(jià)損失程度[16]。

5. RT-PCR 檢測(cè)：液氮條件下研磨軟骨組織為粉末狀，trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，NanoDrop 2000檢測(cè) RNA 量和純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( PrimeScriptTMRT Master Mix Takara ) 將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 25 μl 體系的cDNA，以 5 μl 分裝保存。以 cDNA 為模板，利用擴(kuò)增試劑盒 ( SYBR Premix Ex Taq TM II Takara ) 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，BIO-RAD IQ5 軟件分析結(jié)果。擴(kuò)增引物見(jiàn)表 1，擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性 95 ℃ 10 min；接著 40 個(gè)循環(huán)：95 ℃ 10 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，退火溫度因基因調(diào)整，各樣本設(shè) 2 個(gè)副孔，mRNA相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔΔCt 表示。

表1 RT-PCR 擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences used in RT-PCR

6. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ( ELISA )：室溫解凍全部血清，用 Ihh 的 ELISA 試劑盒 ( 武漢優(yōu)爾生生物有限公司 ) 定量檢查血清中 Ihh 濃度，嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明操作，450 nm 濾光片檢測(cè)樣品吸光度值，用CurveExpert 軟件擬合最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用吸光度值推算濃度。

7. 組織學(xué)切片：各組關(guān)節(jié)放入 4% 多聚甲醛( 大于樣本的 4 倍體積 ) 固定 3 天，超聲脫鈣機(jī)脫鈣1 個(gè)月 ( 每 7 天更換脫鈣液 )，用脫水機(jī)梯度酒精脫水、浸蠟 ( 70% 2 h、75% 2 h、80% 2 h、85% 2 h、90% 2 h、95% 16 h、100% 40 min、100% 40 min、二甲苯 20 min、二甲苯 20 min、浸蠟 3 h、浸蠟2 h )，石蠟包埋。標(biāo)本切為 4 μm 厚的石蠟切片，烤片備用。

8. 免疫組化：預(yù)先烤片后 30 min，切片脫蠟水化 ( 二甲苯 10 min、二甲苯 10 min、無(wú)水乙醇2 min、無(wú)水乙醇 2 min、95% 乙醇 2 min、95% 乙醇2 min )。用磷酸鹽緩沖液 ( PBS ) 浸洗 ( 3 次，3 min /次 )，3% H2O2浸片 ( 室溫 避光 10 min )，PBS 浸洗，抗原修復(fù) ( 復(fù)合消化液 37 ℃ 30 min )，PBS 浸洗，血清封閉抗原 ( 室溫 30 min )，滴加一抗 ( sc-1196 santa cruz 稀釋比例 1∶500 )，4 ℃ 過(guò)夜 ( 對(duì)照組用PBS )，PBS 浸洗，滴加二抗 ( cs-2354 HRP 標(biāo)記驢抗山羊 IgG 二抗 1∶1000 ) 37 ℃ 孵育 40 min， DAB 顯色，OLIMPUS 顯微鏡拍照。

9. 番紅 O 觀(guān)察軟骨的損傷程度及糖胺多糖的含量：切片脫蠟水化，用蘇木素浸染 ( 1 min )、蒸餾水洗 ( 2 次，3 min / 次 )，滴鹽酸酒精 10 s，蒸餾水洗( 2 次，3 min / 次 )，fast green ( 6 min )，1% 乙酸滴洗＜10 s，番紅 O 6 min，脫水封片觀(guān)察。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 Graph Pad Prism5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用±s表示，實(shí)驗(yàn)組多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)間的組間比較用 Tukey 檢驗(yàn)法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、抽屜試驗(yàn)、X 線(xiàn)證實(shí) PTOA 造模成功

術(shù)中做抽屜試驗(yàn)對(duì)比前后活動(dòng)度，出現(xiàn)明顯脛骨前移，可認(rèn)為前交叉韌帶已經(jīng)斷裂。取樣后拍攝 X 線(xiàn)片發(fā)現(xiàn)：4 周組膝關(guān)節(jié)周?chē)_(kāi)始出現(xiàn)骨質(zhì)硬化；3 個(gè)月組觀(guān)察到關(guān)節(jié)間隙狹窄、關(guān)節(jié)周?chē)琴|(zhì)硬化、關(guān)節(jié)面毛糙、關(guān)節(jié)邊緣骨贅生成 ( 圖 1 )。

二、關(guān)節(jié)軟骨內(nèi) Ihh 及下游基因的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在 7 天組顯著升高

關(guān)節(jié)軟骨中 Ihh 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在 ACLT組中總體高于 Sham 組。在術(shù)后早期 ( 4 周內(nèi) ) 出現(xiàn)顯著表達(dá)升高，7 天組最高；7 天組的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著高于 Sham 組、1 天組、3 個(gè)月組 ( 表 2，圖 2 )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。Hh 信號(hào)通路下游分子：Smo、Gli1 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，都出現(xiàn)類(lèi)似的表達(dá)峰值。

圖1 右膝關(guān)節(jié)正側(cè)位 X 線(xiàn)：Aa、Bb、Cc 分別為 Sham 組、4 周組、3 個(gè)月組的 X 線(xiàn)片F(xiàn)ig.1 The anteroposterior and lateral radiographs of the right knee. Aa, Bb and Cc were the X-ray films of the Sham group, 4-week group and 3-month group respectively

表2 各組 Ihh 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative mRNA expressions of Ihh in each group

三、關(guān)節(jié)軟骨內(nèi) Ihh 蛋白在 3 天組、7 天組含量升高

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨 Ihh、Smo、Gli1 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 ( aP ＜ 0.01，bP ＜ 0.05；n = 6 )Fig.2 The relative mRNA expressions of Ihh, Smo, Gli1 of rat cartilage in each group ( aP ＜ 0.01, bP ＜ 0.05; n = 6 )

免疫組化可見(jiàn) 3 天組和 7 天組胞內(nèi)棕色顆粒明顯增多，超過(guò)細(xì)胞總數(shù)的 50%，且顏色加深呈深褐色；3 個(gè)月組時(shí)軟骨表面破損明顯，軟骨細(xì)胞減少，軟骨陷窩增大，正是軟骨退化的典型表現(xiàn)，但胞內(nèi)棕色顆粒數(shù)目減少，低于細(xì)胞總數(shù)的 20%，且顏色較淺?？梢?jiàn)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi) Ihh 蛋白含量在 3 天組、7 天組表達(dá)量升高，3 個(gè)月組又出現(xiàn)下降 ( 圖 3 )。

圖3 關(guān)節(jié)軟骨中 Ihh 蛋白表達(dá)量 ( 免疫組化 × 40 )，藍(lán)紫色為細(xì)胞核，棕黃色顆粒即 Ihh 蛋白Fig.3 Ihh expression in cartilage immunohistochemical figure ( × 40 ), the nuclei were purple; The brown-yellow particles were Indian hedgehog proteins

四、血清中的 Ihh 蛋白濃度的在 3 天組、7 天組顯著升高

血清中 Ihh 蛋白濃度在進(jìn)展早期 ( 3 天組、7 天組、2 周組、4 周組 ) 顯著升高，在晚期 ( 3 個(gè)月組 )下降 ( 表 3、圖 4 )。組間多重比較：3 天組與 3 個(gè)月組、7 天組與 Sham 組、7 天組與 3 個(gè)月組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。

表3 各組血清中的 Ihh 濃度Tab.3 Concentrations of Ihh in surum in each group

圖4 ELISA 檢測(cè)血清中 Ihh 蛋白含量 ( aP ＜ 0.05；n = 10 )圖5 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的 MMP-13、COL X 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 ( aP ＜ 0.001，bP ＜ 0.01，cP ＜ 0.05；n = 6 )Fig.4 Ihh concentration in surum measured by ELISA ( bP ＜ 0.05; n = 10 )Fig.5 The relative mRNA expressions of MMP-13, COL X in rat cartilage in each group ( aP ＜ 0.001, bP ＜ 0.01, cP ＜ 0.05; n = 6 )

五、MMP-13 和 COL X 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在3 個(gè)月組升高

關(guān)節(jié)軟骨內(nèi) MMP-13 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量早期變化較為緩慢，2 個(gè)月內(nèi)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3 個(gè)月組 mRNA 相對(duì)表達(dá)量迅速升高，與各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。COL X 同樣早期表達(dá)量變化不顯著，3 個(gè)月組較早期組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05 ) ( 圖 5 )。MMP-13、COL X 都是軟骨細(xì)胞肥大化的標(biāo)志性產(chǎn)物，在軟骨受損時(shí)表達(dá)水平升高[7]，成年人軟骨細(xì)胞的異常肥大分化是 OA 的表現(xiàn)。

六、印度墨水染色顯示 2 個(gè)月組、3 個(gè)月組著色深重

ACLT 各組相比：在術(shù)后 1 個(gè)月內(nèi)各組中軟骨表明光滑完整，無(wú)明顯 ink 著色；4 周組出現(xiàn)較明顯的稀疏著色痕跡，隨時(shí)間進(jìn)展，3 個(gè)月組關(guān)節(jié)墨汁著色面積超過(guò) 50%，且顏色深重，軟骨損傷嚴(yán)重，形成了不可逆的改變 ( 圖 6 )。

七、番紅 O 染色發(fā)現(xiàn)手術(shù)后 4 周組開(kāi)始出現(xiàn)軟骨損傷，3 個(gè)月組損傷嚴(yán)重

ACLT 術(shù)后早期關(guān)節(jié)軟骨無(wú)明顯改變，2 周組( ACLT ) 關(guān)節(jié)表面開(kāi)始纖維化，之后關(guān)節(jié)厚度越來(lái)越薄，番紅 O 染色變淺說(shuō)明糖胺多糖含量減少，潮線(xiàn)消失，細(xì)胞簇集，排列紊亂，細(xì)胞數(shù)目減少，軟骨細(xì)胞陷窩空泡增大。4 周組可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨表面纖維化，糖胺多糖含量減少，軟骨層次不清、細(xì)胞排列紊亂；2 個(gè)月組關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯變薄，纖維化和磨損使關(guān)節(jié)面凹凸不平，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少；3 個(gè)月組 ( 因間隙狹窄，關(guān)節(jié)軟骨與半月板擠壓嚴(yán)重，尚可看到其界線(xiàn) ) 關(guān)節(jié)表面纖維化明顯，關(guān)節(jié)軟骨極薄，糖胺多糖含量很少，軟骨細(xì)胞稀疏，軟骨陷窩寬大明顯，軟骨退化嚴(yán)重[15,17-18]( 圖 7 )。

討 論

一、SD 大鼠的 PTOA 模型代表性

創(chuàng)傷是導(dǎo)致 OA 進(jìn)展的重要誘因，其中前交叉韌帶 ( anterior cruciate ligament，ACL ) 和半月板損傷所致最為常見(jiàn)[9]。ACL 主要起穩(wěn)定關(guān)節(jié)的作用，受損傷可致關(guān)節(jié)不穩(wěn)，軟骨負(fù)重異常，引起關(guān)節(jié)退化損傷，促進(jìn) OA 的進(jìn)展。SD 大鼠與人類(lèi)有類(lèi)似的軟骨發(fā)育退變過(guò)程，交叉韌帶斷裂亦可誘發(fā) OA，故本實(shí)驗(yàn)用 SD 大鼠行 ACLT 造 PTOA 模型，模擬正常成年人 OA 的進(jìn)展過(guò)程。

圖6 Aa、Bb、Cc、Dd、Ee、Ff 分別為 3 天組、7 天組、2 周組、4 周組、2 個(gè)月組、3 個(gè)月組，A～F 為 Sham 組，a～f 為 ACLT 組Fig.6 The corresponding time points of Aa, Bb, Cc, Dd, Ee, Ff were 3 d group, 7 d group, 2 w group, 4 w group, 2 m group, 3 m group; The lower case letters corresponded to the Sham group, and the capital letters corresponded to the ACLT group

圖7 手術(shù)組大鼠右膝關(guān)節(jié) ( 番紅 O × 10 )；番紅 O 染色為紅色，顯示軟骨內(nèi)糖胺多糖的含量 a、b、c、d、e、f、g、h 分別為 ACLT 術(shù)后 1 天組、3 天組、7 天組、2 周組、4 周組、2 個(gè)月組、3 個(gè)月組和 Sham 組 3 個(gè)月的關(guān)節(jié)軟骨Fig.7 Safranin-O staining of the right keen joint after surgery ( × 10 ); Safranin-O staining was red, showing the glycosaminoglycan in the cartilage. a, b, c, d, e, f, g, h were the arthtitis cartilage in the group of 1 d group, 3 d group, 7 d group, 2 w group, 4 w group, 2 m group, 3 m group after surgery and Sham

二、隨時(shí)間推移關(guān)節(jié)軟骨的損傷情況

由于單個(gè)實(shí)驗(yàn)手段不穩(wěn)定因素較多，無(wú)法確切反映關(guān)節(jié)軟骨的損傷情況，筆者多角度檢測(cè)了其損傷情況，采用膝關(guān)節(jié) X 線(xiàn)、印度墨水染色、番紅 O染色、RT-PCR ( 檢測(cè) MMP-13 和 COL X mRNA 表達(dá)水平 ) 分別從大體水平、形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、分子水平多方面反映其受損情況。其中 3 個(gè)月組的 X 線(xiàn)、印度墨水染色、番紅 O 染色結(jié)果均顯示關(guān)節(jié)軟骨破損嚴(yán)重，形成纖維瘢痕修復(fù)，進(jìn)入損傷的不可逆階段，是 OA 的典型表現(xiàn)；MMP-13 和 COL X mRNA表達(dá)水平在 3 個(gè)月組迅速升高，是軟骨肥大化的表現(xiàn)，成年人軟骨的異常肥大化就是 OA 的病理基礎(chǔ)；因此，3 個(gè)月組的關(guān)節(jié)軟骨已經(jīng)形成不可逆損傷，認(rèn)為進(jìn)入 OA 晚期。而術(shù)后 4 周組及更早時(shí)間組別中，關(guān)節(jié)軟骨各指標(biāo)之間對(duì)比并不明顯，因此，認(rèn)為術(shù)后 1 個(gè)月內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨尚未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)及分子水平的變化，這一階段認(rèn)為是 OA 早期。

三、Ihh 在 OA 早期表達(dá)量的升高階段可能是診斷和治療 OA 的合適時(shí)間點(diǎn)

關(guān)節(jié)軟骨中 Ihh 基因的 mRNA 表達(dá)量在早期組出現(xiàn)升高階段 ( 7 天組最高 )，Hh 信號(hào)通路的下游基因 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在這一階段也有升高，支持了這一現(xiàn)象。而免疫組化結(jié)果中 Ihh 蛋白含量的變化在 3 天組和 7 天組最高，這與 Ihh 基因的相對(duì)表達(dá)量的變化相一致。因此可見(jiàn)，Ihh 的表達(dá)水平在OA 早期有階段性升高，這一階段不僅早于軟骨形態(tài)上發(fā)生損傷退變，也早于肥大化標(biāo)志物 MMP-13 和COL X 的表達(dá)上升。有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào) Ihh 能促進(jìn) MMP-13 和 COL X 的表達(dá)，Ihh 可能是激活肥大化途徑的因素之一[3]。故 Ihh 的表達(dá)升高階段可能是大鼠軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程激活的起點(diǎn)，可作為早期預(yù)測(cè) OA 和早期干預(yù) OA 的最佳時(shí)間點(diǎn)。

四、炎癥因子的干擾可忽略

本實(shí)驗(yàn) Ihh 在術(shù)后短期的升高并促進(jìn) OA，筆者并不認(rèn)為炎癥因子發(fā)揮主要作用。Clare Thompson離體研究發(fā)現(xiàn)在白細(xì)胞介素-1 ( IL-1β ) 存在的條件下，軟骨基質(zhì)的分解增加，但加入重組 Ihh( r-Ihh ) 卻能減緩軟骨基質(zhì)分解，抑制基質(zhì)分解酶的表達(dá)[19]。因此 Clare Thompson 得出：Ihh 介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)分解主要是由 Ihh 相關(guān)病理因子所影響，而不是 IL-1β。本實(shí)驗(yàn)中可基本排除手術(shù)后 IL-1β 的影響，因?yàn)椋? 1 ) IL-1β 能夠介導(dǎo)基質(zhì)分解酶的合成，而本實(shí)驗(yàn)中短期內(nèi)基質(zhì)分解酶的合成并沒(méi)有明顯的升高；( 2 ) 偽手術(shù)組作對(duì)照可以排除這一干擾。

五、血清中 Ihh 蛋白預(yù)測(cè) OA 的可能性

大鼠血清中 Ihh 蛋白濃度在早期有明顯升高階段，這與關(guān)節(jié)軟骨中 Ihh 表達(dá)變化一致，可能是前肥大軟骨細(xì)胞分泌的 Ihh 經(jīng)關(guān)節(jié)滑液吸收入血所致，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)對(duì)于滑液中的 Ihh 探究甚多，認(rèn)為其與軟骨損傷具有一定的關(guān)聯(lián)，尚無(wú)血液中的數(shù)據(jù)，因?yàn)?OA 患者早期血液較難獲得，筆者用大鼠模擬人類(lèi) OA，檢測(cè)到血液與關(guān)節(jié)軟骨的一致表現(xiàn)，因此，血液中的 Ihh 含量可以間接反映關(guān)節(jié)軟骨中 Ihh的表達(dá)。而且血樣獲取方式比關(guān)節(jié)液的獲取對(duì)人體損傷小，且取樣量足，作為檢測(cè)手段更加便利，對(duì)于 OA 的預(yù)測(cè)更具有實(shí)用性。

但該實(shí)驗(yàn)尚不能完全解決這一難題，首先，本實(shí)驗(yàn)僅是大鼠模型，血清中 Ihh 真正作為標(biāo)記物被利用，尚需大量人類(lèi)的研究的數(shù)據(jù)。再次，還需進(jìn)一步探究血樣中 Ihh 濃度升高反映 OA 形成的靈敏度和特異性。雖然檢測(cè)血液中 Ihh 濃度有可能成為早期預(yù)測(cè)人類(lèi) OA 的手段，但仍需要更多研究者的努力探索。

六、Ihh 在 OA 治療中的價(jià)值

Ihh 是促進(jìn) OA 的負(fù)性因子，抑制其產(chǎn)生，阻遏其作用才能起到延緩 OA 的作用，但它有復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，現(xiàn)階段相關(guān)研究很多，尚未發(fā)現(xiàn)較好的手段。嘗試敲除小鼠 Ihh 基因?qū)嶒?yàn)，確實(shí)起到了延緩 OA 的作用，但是也抑制了小鼠的骨骼發(fā)育；探究針對(duì) Hh 信號(hào)通路中的 micro RNA 的實(shí)驗(yàn)，想要沉默 Ihh 或其下游基因，通路復(fù)雜交互，結(jié)果較間接，且有雙向性；從藥理方面入手，用其下游基因smo 的抑制劑來(lái)干擾 Hh 號(hào)通路作用，但基于溶劑的強(qiáng)毒性，尚無(wú)活體研究。Ihh 作為治療手段的探究尚為基礎(chǔ)，任重而道遠(yuǎn)。

綜上所述，Ihh 作為關(guān)節(jié)軟骨早期促進(jìn)肥大化進(jìn)程的因子，可能是預(yù)測(cè) OA 進(jìn)程的早期標(biāo)志物，同時(shí)也可能是治療 OA 的潛在靶點(diǎn)[9,13]。本實(shí)驗(yàn)明確了 Ihh 在大鼠 OA 發(fā)病早期有明顯升高階段，且在血液可以檢測(cè)到這種變化，這為 Ihh 成為新型預(yù)防和治療 OA 的手段提供新的依據(jù)。