陳顯兵，楊清煜，覃曉莉，趙方毓，唐鮮娥，王子禮，陳宗海，向家鵬

（1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施 445000；湖北民族學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)院，3.附屬民大醫(yī)院，湖北恩施 445000）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的危險(xiǎn)因素，是多種代謝性疾病的前期表現(xiàn)和主要組成部分［1-2］。高脂飲食是導(dǎo)致IR和T2DM發(fā)病的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)的IR模型與人肥胖時(shí)的IR狀態(tài)及糖耐量受損相似，高脂飲食可影響胰島素分泌［3-4］。肝是利用葡萄糖、產(chǎn)生葡萄糖的重要器官，肝功能紊亂對(duì)IR的發(fā)生具有重要意義。過(guò)多的脂肪沉積在肝中會(huì)改變肝功能，出現(xiàn)甘油三酯（triglycerides，TG）升高，高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）降低，高胰島素血癥和低脂聯(lián)素血癥［5］。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）在脂代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控脂肪儲(chǔ)存和釋放，在維持機(jī)體能量平衡和改善IR等方面均有正向調(diào)節(jié)作用。鳶尾素（irisin）是一種肌肉因子，通過(guò)增加體內(nèi)能量消耗來(lái)改善糖、脂肪及氨基酸代謝，逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性，提高胰島素敏感性的作用被認(rèn)為可能是肥胖、糖尿病等疾病治療的突破點(diǎn)［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病的發(fā)生與氧化應(yīng)激調(diào)控密切相關(guān)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多可以促進(jìn)糖尿病的發(fā)生［9］，大量攝取高脂飲食能顯著增加體內(nèi)氧化應(yīng)激的水平［10］，同時(shí)氧化應(yīng)激對(duì)胰島素信號(hào)通路有抑制作用［11］。提示氧化應(yīng)激可能對(duì)這類(lèi)疾病的發(fā)生及發(fā)展有著重要的影響［12］。

筒鞘蛇菰（Balanophora involucrateHook.f.）又名文王一枝筆、借母懷胎或雞心七。民間醫(yī)生用其治療肝炎、消化道出血和醉酒等病癥。研究表明，蛇菰含有多糖和黃酮類(lèi)等成分，具有提高人體免疫功能、清除自由基、抗腫瘤、降血壓和降血脂藥理活性［13-15］。但蛇菰多糖（Balanophorapolysac?charide，BPS）對(duì)T2DM的療效觀察及機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬制備高脂飲食和STZ誘導(dǎo)的IR大鼠模型，探討B(tài)PS對(duì)其血糖、血脂和肝組織中自由基的影響，并檢測(cè)血清鳶尾素和肝組織中PPARγ的變化，探討B(tài)PS抗IR的可能機(jī)制，為糖脂代謝性疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

大鼠鳶尾素ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科Cat.CKE93640R）；PPARγ抗體、β肌動(dòng)蛋白抗體（一抗）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗）（美國(guó)Santa Cruz公司）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美國(guó) Sigma 公司）；總膽固醇（total choles?terol，TC）、TG、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和 HDL-C試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondi?aldehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；膽固醇（湖北中料化工有限公司）。Leica 1850冰凍切片機(jī)，Nikon80i正置顯微鏡（日本），LAS4000mini成像儀，日立7600全自動(dòng)生化分析儀（日本）。

1.2 蛇菰多糖的提取

筒鞘蛇菰全株于2015年夏季采自湖北省恩施市望城坡，經(jīng)湖北民族大學(xué)藥用植物分類(lèi)與鑒定實(shí)驗(yàn)室李厚聰博士鑒定為蛇菰科（Balanophoraceae）蛇菰屬（Balanophora）植物，主要分布于湖北、云南和四川等地。洗凈后50℃烘干，搗碎成粗粉后稱(chēng)取500 g，加入5 L去離子水，浸泡4 h，加熱煮沸提取60 min，過(guò)濾，濾渣再分別加去離子水5 L和4 L，同法加熱煮沸提取2次，過(guò)濾，合并濾液，并于40℃減壓濃縮至1 L。濃縮液加入無(wú)水乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)90%，4℃靜置過(guò)夜。離心分離沉淀，沉淀部分加水0.5 L攪拌，離心，沉淀部分再同法操作2次。合并上清液，將3次沉淀合并加水溶解后，離心除去不溶物，濾液減壓濃縮，攪拌后離心收集沉淀，無(wú)水乙醇洗滌3次，50℃烘干，得蛇菰粗多糖。Sevage法脫蛋白［16］，將所得蛇菰粗多糖配成5%水溶液，加入1/4體積的氯仿-正丁醇混合溶液（氯仿∶正丁醇=4∶1），振搖30 min，離心15 min（5000×g），棄下層沉淀，收集上清，反復(fù)3次?；旌仙锨逡貉b入即用型透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量：1000；級(jí)別：RC膜 S/P 6），蒸餾水透析48 h，凍干，得BPS。苯酚-硫酸法［17］測(cè)定其中多糖含量為61.3%。

1.3 糖尿病大鼠模型制備及分組

成年健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)（許可證號(hào)SCXK（鄂）2015-0018），本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖北民族學(xué)院倫理委員會(huì)倫理審查。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10），普通飼料喂養(yǎng)；模型組（n=20）高脂飼料喂養(yǎng)（在普通飼料中添加豬油10%、雞蛋5%和膽固醇2.5%）4周后，一次性ip給予STZ 40 mg·kg-1，1周后測(cè)定空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG≥7.8 mmol·L-1作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)［18］。將模型大鼠分成2組，分別為模型組和模型+BPSG組，每組10只。模型組ig給予等體積生理鹽水；模型+BPS組ig給予BPS 200 mg·kg-1，共4周。所有大鼠最后1次給藥后禁食12 h，稱(chēng)取空腹體質(zhì)量，麻醉后取心臟血，制備血清；然后將肝組織完整取出，預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干肝表面水分，稱(chēng)肝濕重，然后在相同部位取材固定，新鮮肝組織-80℃凍存。肝指數(shù)=肝濕重（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.4 蘇丹Ⅲ染色觀察肝形態(tài)變化

觀察各組大鼠肝大體顏色、形態(tài)及質(zhì)地的變化。在同一部位取材冰凍切片，切片厚5 μm，自然干燥5 min，70%乙醇稍洗，蘇丹Ⅲ染色5 min；70%乙醇洗去多余染液，蘇木素常規(guī)染核，甘油封片后顯微鏡下觀察。

1.5 血糖和血脂檢測(cè)

將采集的心臟血在室濕下靜置60 min后，離心，分離血清，分裝。各組大鼠FBG，TC，TG，LDL-C和HDL-C指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。

1.6 肝組織中SOD活性和MDA含量的檢測(cè)

取肝組織約1 g，在冰浴中勻漿，離心，取上清。肝組織上清MDA含量和SOD活性的測(cè)定方法分別采用硫代巴比妥酸法（TBA法）和亞硝酸鹽法。檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。

1.7 ELISA法檢測(cè)血清鳶尾素水平

按該試劑盒的要求取樣和保存待測(cè)樣品，遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔，首先在板孔中加入工作液，再分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，搖勻，用膜覆蓋酶標(biāo)板，37°C孵育1 h，洗滌5次，加入底物，37°C孵育30 min，洗滌5次，TMB顯色30 min，加終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按公式計(jì)算樣品濃度。

1.8 Western蛋白印跡法檢測(cè)PPAR γ蛋白表達(dá)

取大鼠肝組織，PBS清洗2次，棄PBS，加入1 mL RIPA裂解液，冰浴勻漿；4℃ 10000×g，離心10 min，去沉淀，留取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取10 μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加1∶500稀釋的PPARγ一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜3次，每次15 min，再加入二抗（HRP標(biāo)記的IgG，1∶7500）37℃孵育 60 min，PBS 洗膜 3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，LAS4000 mini凝膠成像系統(tǒng)顯影并分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)標(biāo)蛋白積分吸光度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行分析處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇菰多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

圖1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型照組和模型+BPS組體質(zhì)量增加幅度明顯降低（P＜0.01）；模型+BPS組體質(zhì)量增加幅度比模型組較高（P＜0.05）。正常對(duì)照組肝指數(shù)為3.21±0.21，模型組肝指數(shù)4.43±0.33，顯著升高（P＜0.01）；模型+BPS組肝指數(shù)為3.83±0.28，相比模型組顯著降低（P＜0.01），但仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 蛇菰多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝組織形態(tài)的影響

正常組肝顏色暗紅，不油膩。模型組肝較正常組大，顏色棕黃，質(zhì)軟，油膩感強(qiáng)。模型+BPS組肝較模型組有較大改善（圖2A）。

正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉規(guī)則，呈放射狀分布，肝細(xì)胞質(zhì)中無(wú)或僅少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積大，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂滴，且呈彌漫性分布，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。BPS組肝細(xì)胞脂肪變性比模型組明顯好轉(zhuǎn)（圖2B）

2.3 蛇菰多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠FBG和血脂的影響

Fig.1Effect of Balanophora polysaccharide(BPS)on body mass of experimental diabetic rats.Male SD rats were fed with high fat feed（add 10%lard，5%eggs and 2.5%cholesterol to normal feed）for 4 weeks，injected into the abdominal cavity using streptozocin（STZ）40 mg·kg-1one time and fasting blood glucose（FBG）was measured one week later.The model group was identified when the level of FBG ≥7.8 mmol·L-1.Then the experimental group was intragastrically administered BPS 200 mg·kg-1for 4 weeks.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

Fig.2 Effect of BPS on liver histopathological changes of experimental diabetic rats.See Fig.1 for the treatment.A：the change in liver by the naked eyes；B：the microscopic structure change in the liver.Sections were stained with SudanⅢ.Arrows show lipid droplets.

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠FBG水平顯著升高（P＜0.01）；模型+BPS組FBG明顯低于模型組（P＜0.05），但仍高于正常值，屬于糖尿病狀態(tài)。模型組TC，TG和LDL-C水平比正常對(duì)照組升高（P＜0.01），HDL-C 水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+BPS組TG和LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），而 HDL-C 水平則升高（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of BPS on fasting blood glucose（FBG）and lipid level of experimental diabetic rats

2.4 蛇菰多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝組織中SOD活性和MDA含量的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝中SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+BPS組SOD活性升高（P＜0.05）。與正常對(duì)照組相比，模型組MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+BPS組MDA含量顯著下降（P＜0.05），但仍顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）（表2）。

Tab.2 Effect of BPS on SOD and MDA of experimental diabetic rats

2.5 蛇菰多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血清鳶尾素水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清鳶尾素水平顯著地低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；模型+BPS組大鼠血清鳶尾素水平明顯高于模型組（P＜0.05）（表3）。

Tab.3 Effect of BPS on serum irisin level of experi?mental diabetic rats

2.6 蛇菰多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝組織PPAR γ蛋白的影響

Western蛋白印跡結(jié)果顯示（圖3），模型組PPARγ表達(dá)低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；模型+BPS組大鼠肝組織PPARγ表達(dá)高于模型組（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of BPS on expression of peroxisome prolif?erators-activated receptor γ（PPAR γ）protein in liver of experimental diabetic rats by Western blotting.See Fig.1 for the treatment.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

3 討論

本研究采用高脂飲食方法誘導(dǎo)IR T2DM大鼠模型。模型組大鼠體質(zhì)量減輕，肝指數(shù)升高；蘇丹Ⅲ染色光鏡觀察顯示肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積大，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂滴，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)有不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；血清FBG，TG，TC和LDL-C水平明顯升高，HDL-C降低；肝組織SOD活性降低，MDA含量升高；血清鳶尾素的水平降低，肝組織中PPARγ蛋白表達(dá)降低。表明高脂飲食和STZ方法成功誘導(dǎo)IR T2DM大鼠模型。

本研究結(jié)果顯示，BPS處理可降低模型大鼠升高的FBG，TG和LDL-C水平，升高HDL-C，提高SOD活性，降低MDA含量，提高血清鳶尾素的水平，上調(diào)肝組織中PPARγ蛋白表達(dá)，表明BPS對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有一定的治療效果。在前期實(shí)驗(yàn)中采用BPS 100，200和400 mg·kg-1對(duì)模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)BPS 100 mg·kg-1組FBG呈下降趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；400 mg·kg-1與200 mg·kg-1作用相當(dāng)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在本研究中只采用了BPS 200 mg·kg-1對(duì)模型組進(jìn)行干預(yù)，未對(duì)正常對(duì)照組進(jìn)行單獨(dú)干預(yù)及與陽(yáng)性藥品進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BPS 200 mg·kg-1治療4周，F(xiàn)BG仍高于糖尿病閥值，可能與治療時(shí)間有關(guān)。因此，對(duì)BPS的毒性及有效劑量有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，IR模型大鼠血清鳶尾素水平明顯低于正常對(duì)照組，經(jīng)BPS干預(yù)后鳶尾素水平明顯上升，與FBG及血脂的變化相一致。但是血清鳶尾素水平與糖尿病相關(guān)性的研究還存在爭(zhēng)議，可能是由研究的性別和種族差異引起的［19］。但多數(shù)研究結(jié)果顯示，T2DM患者血清鳶尾素水平低于正常人群［20-21］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，肝中存在鳶尾素的免疫反應(yīng)，提示肝可能是鳶尾素受體活躍的器官［22］。T2DM和肥胖患者胰島素對(duì)肝糖原分解和糖異生的抑制效應(yīng)明顯減弱，血清鳶尾素水平與肝TG呈負(fù)相關(guān)［23-24］。以上結(jié)果表明，鳶尾素參與了IR T2DM的發(fā)病。

本研究結(jié)果顯示，模型組PPARγ的表達(dá)顯著降低，血清鳶尾素水平減少。PPARγ在脂代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用，調(diào)控脂肪儲(chǔ)存和釋放，在維持機(jī)體能量平衡等方面均有正向調(diào)節(jié)作用［25-27］。PPARγ被配體激活后［28-29］，改善IR的可能機(jī)制包括增強(qiáng)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［30］、調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞［31］、參與糖代謝過(guò)程中某些關(guān)鍵酶的表達(dá)及抑制丙酮酸脫氫酶激酶表達(dá)［32］。

綜上所述，BPS具有明顯的降血糖作用，并且能降低MDA的含量，提高SOD活性，改善脂代謝異常。但BPS的降糖作用是與其提升鳶尾素水平和增強(qiáng)肝內(nèi)PPARγ的表達(dá)有關(guān)，還是與提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān)目前無(wú)法確定，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。