阿熱阿依·海依拉提，彭 斌，張曉玲，姚 剛，克然木·托乎提，冷朝升,雷程紅*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.庫(kù)爾勒市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆庫(kù)爾勒 841000)

沙門(mén)菌(Salmonella)是一群存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭陰性桿菌，是一種重要的人獸共患病病原，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生上均十分重要[1]。畜禽感染沙門(mén)菌主要表現(xiàn)為發(fā)熱、胃腸炎、腹瀉、敗血癥及母畜流產(chǎn)等[2]。沙門(mén)菌在動(dòng)物與動(dòng)物、動(dòng)物與人、人與人之間通過(guò)消化道間接或直接傳播[3]。目前由沙門(mén)菌引起的食源性疾病已成為世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在細(xì)菌性食物中毒中，由沙門(mén)菌引起的食物中毒病例居于首位[4]。在引起沙門(mén)菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜禽產(chǎn)品，雞肉、羊肉、牛肉等已被認(rèn)為是人感染沙門(mén)菌的主要來(lái)源。畜禽感染沙門(mén)菌也常會(huì)表現(xiàn)為無(wú)癥狀帶菌，會(huì)降低動(dòng)物的生產(chǎn)繁殖能力，或者可能加重病態(tài)或增加死亡率，呈現(xiàn)出有臨床癥狀的致死性疾病，造成經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)畜牧業(yè)的健康發(fā)展和人類健康構(gòu)成潛在威脅[5]。許多調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期不合理使用抗菌藥物，導(dǎo)致沙門(mén)菌的耐藥性增強(qiáng)和耐藥譜增寬，使得沙門(mén)菌感染的治療難度增加，同時(shí)可能使耐藥菌株從農(nóng)場(chǎng)流向餐桌，使人類感染耐藥沙門(mén)菌株，最終導(dǎo)致使用抗菌藥物治療失敗[6]。目前，沙門(mén)菌對(duì)早期用于該菌治療的青霉素、四環(huán)素、氯霉素及磺胺類等藥物的耐藥性增長(zhǎng)十分嚴(yán)重[7]。肉牛養(yǎng)殖是新疆畜牧業(yè)的重要組成部分，肉牛健康養(yǎng)殖對(duì)于保障牛肉的衛(wèi)生質(zhì)量具有重要意義。目前在新疆地區(qū)表觀健康肉牛沙門(mén)菌帶菌情況及分離株耐藥性尚缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，本研究對(duì)新疆地區(qū)表觀健康肉牛攜帶的沙門(mén)菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)沙門(mén)菌分離株的耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)分析，旨在為肉牛的健康養(yǎng)殖及臨床合理使用抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)，為預(yù)防和控制人感染沙門(mén)菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物及參考菌株 新疆庫(kù)爾勒市周邊某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)各個(gè)生長(zhǎng)階段的肉牛753頭。陽(yáng)性對(duì)照菌株為鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC13311,新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物性食品衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；陰性對(duì)照菌株為大腸埃希菌ATCC25922，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；PCR 儀、高速離心機(jī)、移液器，德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；水平電泳槽、電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，上海博訊有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 蛋白胨緩沖液(buffered peptone water，BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(tetrathionate broth base，TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine broth，SC)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(xylose lysine desoxycholate，XLD)、亞硫酸鉍培養(yǎng)基(bismuth sulfite，BS)、沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；沙門(mén)菌生化鑒定套盒，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)試劑、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000，北京天根生化試劑公司產(chǎn)品；甲氧芐啶(含量98%)、氯霉素(含量98%)、氟苯尼考(含量98%)、鏈霉素(含量77.4%)、氨芐西林(含量86.5%)、諾氟沙星(含量98%)、環(huán)丙沙星(含量98%)，北京索萊寶生物公司產(chǎn)品；四環(huán)素(含量95%)、磺胺異惡唑(含量98%)、阿莫西林(含量98%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 2017年4月在新疆庫(kù)爾勒市周邊某肉牛場(chǎng)采集表觀健康肉牛的肛拭子樣品753份，將采集的肛拭子樣品置于無(wú)菌Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)冷藏，8 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 沙門(mén)菌的分離純化 在無(wú)菌條件下，將運(yùn)送培養(yǎng)基中的肛拭子移置至加有滅菌的1.5 mL BPW前增菌液的離心管中，在37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h；后各取1 mL BPW轉(zhuǎn)種于10 mL TTB增菌液和SC增菌液中并混勻，然后分別在42℃±1℃和36℃±1℃條件下培養(yǎng)18 h～24 h。培養(yǎng)結(jié)束的增菌液同時(shí)劃線接種于XLD、BS選擇性培養(yǎng)基上和沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上，然后在37℃條件下分別培養(yǎng)18 h～24 h和40 h～48 h進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后觀察各平板上有無(wú)典型或可疑沙門(mén)菌。同時(shí)采用沙門(mén)菌參考菌株和大腸埃希菌參考菌株作對(duì)照。

1.2.3 沙門(mén)菌的生化鑒定 參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)菌檢驗(yàn)》[8]中的方法，用沙門(mén)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4 沙門(mén)菌分離株P(guān)CR鑒定

1.2.4.1 引物 根據(jù)文獻(xiàn)[9]針對(duì)沙門(mén)菌invA基因(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 靶基因名稱及引物序列

1.2.4.2 分離株DNA的提取 向已滅菌的2 mL EP管中加入2 000 μL菌液，以13 000 r/min離心10 min后棄去上清液，向其中加入100 mL TE buffer渦旋振蕩30 s，后置于100℃水浴煮沸10 min，取出立即置于冰盒內(nèi)冰浴10 min，再以12 000 r/min離心2 min，取上清液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 invA基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，PCR反應(yīng)體系包括：Mix 10 μL，invA基因上、下引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)ddH2O至終體積為25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 50 s,72℃ 5 min，置4℃保存。

1.2.4.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè) 將產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，能擴(kuò)增出大小為284 bp的invA基因特異性片段的菌株為沙門(mén)菌陽(yáng)性菌株。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，測(cè)定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，進(jìn)行10種臨床常見(jiàn)抗菌藥物耐藥性試驗(yàn)，并分析沙門(mén)菌分離株的耐藥情況。

根據(jù)CLSI(2016)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判讀，統(tǒng)計(jì)出沙門(mén)菌分離菌株的耐藥菌株數(shù)，計(jì)算出對(duì)各種抗菌藥的耐藥率。

耐藥率=(對(duì)該抗菌藥物耐藥的菌株數(shù)目/菌株總數(shù))×100%

2 結(jié)果

2.1 疑似沙門(mén)菌分離結(jié)果

753份樣品通過(guò)選擇性增菌液、選擇性培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基篩選得到疑似沙門(mén)菌分離株90株。部分疑似沙門(mén)菌分離株在XLD培養(yǎng)基和BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)分別見(jiàn)圖1和圖2。

2.2 疑似沙門(mén)菌PCR鑒定結(jié)果

采用參考菌株和空白試驗(yàn)對(duì)所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物進(jìn)行PCR特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明，鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC13311擴(kuò)增出目的片段，其余對(duì)照均未擴(kuò)增出任何目的片段，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物特異性可靠(圖 3 )。

圖1 沙門(mén)菌在XLD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖2 沙門(mén)菌在BS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照；1～6.部分疑似沙門(mén)菌菌株

M.DNA Marker DL 1 000;+.Positive control; -.Negative control;1-6.Some suspectedSalmonellastrains

圖3疑似沙門(mén)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.3 PCR amplified products from suspectedSalmonella

2.3 表觀健康肉牛沙門(mén)菌帶菌檢測(cè)結(jié)果

753份樣品經(jīng)選擇性增菌液、選擇性培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基、革蘭染色、生化鑒定及PCR鑒定后，最終確定得到63株沙門(mén)菌分離株，每株沙門(mén)菌均來(lái)自不同的樣品，故表觀健康肉牛沙門(mén)菌帶菌率為8.37%(63/753)(表2)。

表2 表觀健康肉牛沙門(mén)菌帶菌率

2.4 牛源沙門(mén)菌分離株耐藥性

63株沙門(mén)菌分離株對(duì)10種藥物的耐藥程度明顯不同，63株沙門(mén)菌對(duì)甲氧芐啶的耐藥率最高，達(dá)97.2%；其次為氯霉素，耐藥率為94.7%；對(duì)四環(huán)素的耐藥率為74.7%；對(duì)磺胺異惡唑和鏈霉素的耐藥率分別為61.5%和54.2%；對(duì)氨芐西林、阿莫西林的耐藥率則分別為29.9%和45.5%；其余3種藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氟苯尼考的耐藥率相對(duì)較低，分別為16.6%、14%和11.3%(表3)。整體耐藥率比較情況見(jiàn)圖4。

表3 沙門(mén)菌耐藥率結(jié)果

圖4 沙門(mén)菌耐藥率比較

63株沙門(mén)菌中未出現(xiàn)全敏感性菌株，有4株可抗2種抗菌藥物(6.35%)，有13株可抗3種抗菌藥物，所占耐藥比重最大為20.63%，可抗4種抗菌藥物與5種抗菌藥物的菌株數(shù)均為11株(17.46%)，抗6種及以上的菌株數(shù)達(dá)24株(38.09%)。63株沙門(mén)菌產(chǎn)生了34種耐藥譜，耐藥譜型復(fù)雜，主導(dǎo)耐藥譜為以下3種，分別為T(mén)E-TMP-C、SIZ-S-TE-TMP-C、SIZ-S-AM-AMX-TE-TMP-C。耐藥種數(shù)與耐藥菌株數(shù)見(jiàn)表4。

表4 多重耐藥與耐藥菌株數(shù)

3 討論

在養(yǎng)殖過(guò)程中肉牛隱性攜帶沙門(mén)菌會(huì)通過(guò)排泄物、分泌物持續(xù)向環(huán)境中排放沙門(mén)菌導(dǎo)致環(huán)境污染和其他動(dòng)物的感染，在屠宰、分割、運(yùn)輸及儲(chǔ)存環(huán)節(jié)也會(huì)增加牛肉受沙門(mén)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。目前國(guó)內(nèi)雞源、豬源沙門(mén)菌已有較多研究報(bào)道，但有關(guān)表觀健康肉牛攜帶沙門(mén)菌研究的報(bào)道較少。朱曉霞[10]研究發(fā)現(xiàn)，四川廣漢屠宰場(chǎng)體征健康待宰牦牛沙門(mén)菌攜帶率為50%(13/26)。吳美云[11]對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)健康奶牛直腸糞樣進(jìn)行沙門(mén)菌的分離鑒定，檢出率為10.9%(38/350)?？镄闳A[12]對(duì)湖北省、湖南省及河南省健康奶牛沙門(mén)菌進(jìn)行了分離鑒定，分離率25.12%(105/428)。Perez-Montao J A等[13]的研究結(jié)果顯示，墨西哥哈里斯科州牛源沙門(mén)菌污染率為15.4%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，新疆庫(kù)爾勒市規(guī)模化肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)表觀健康肉牛沙門(mén)菌帶菌率為8.37%(63/753)，其帶菌率低于上述研究報(bào)道的結(jié)果，說(shuō)明該肉牛場(chǎng)沙門(mén)菌帶菌率控制在相對(duì)較好的水平，但依然存在一定程度的污染，所以為降低牛場(chǎng)沙門(mén)菌的感染率及屠宰、分割、運(yùn)輸及儲(chǔ)存環(huán)節(jié)牛肉被沙門(mén)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，仍然需要加強(qiáng)肉牛場(chǎng)健康牛攜帶沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè)及養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生和生物安全措施。

近年來(lái)，世界各地報(bào)道的沙門(mén)菌耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域使用的抗菌藥物種類多、數(shù)量大，在食用動(dòng)物生產(chǎn)中的使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人用量，造成沙門(mén)菌等細(xì)菌的耐藥狀況十分嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅人類及動(dòng)物疾病的治療[14]，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WHO)的報(bào)道顯示，中國(guó)已成為目前世界上抗菌藥物濫用最嚴(yán)重的國(guó)家之一，細(xì)菌耐藥性逐漸普遍增強(qiáng)。耐藥菌株可以直接或間接感染人，也增加了將相同的耐藥性通過(guò)食物鏈傳遞給人體病原菌的風(fēng)險(xiǎn)[15]。尹明遠(yuǎn)[16]對(duì)烏魯木齊肉源沙門(mén)菌對(duì)13種抗菌藥物耐藥的研究結(jié)果顯示，99株沙門(mén)菌對(duì)甲氧芐啶(100%)、氯霉素(88.9%)、四環(huán)素(63.6%)、磺胺異惡唑(57.6%) 4種抗菌藥物的耐藥率均在50%以上，84.8%的菌株三重耐藥。趙俊麗等[17]研究了內(nèi)蒙古奶牛源沙門(mén)菌對(duì)22種抗菌藥物耐藥性，結(jié)果38株沙門(mén)菌對(duì)甲氧芐啶、磺胺異惡唑和氯霉素耐藥率分別高達(dá)97.4%、94.7%和80%，76.3%的菌株對(duì)10種及10種以上抗菌藥物耐藥。葛琨等[18]對(duì)30株牛、羊肉源沙門(mén)菌耐藥性研究的結(jié)果顯示，分離株對(duì)甲氧芐啶、氯霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為100.0%、86.7%和60.0%。綜上所述，沙門(mén)菌的耐藥狀況相當(dāng)嚴(yán)重，多地區(qū)沙門(mén)菌對(duì)甲氧芐啶、氯霉素、四環(huán)素及磺胺異惡唑高度耐藥。原因可能是這些藥物在畜禽疾病治療中使用時(shí)間長(zhǎng)，使用量和使用頻率較大，沙門(mén)菌在藥物的選擇壓力作用下導(dǎo)致耐藥性逐漸增高。為降低沙門(mén)菌耐藥菌株對(duì)健康養(yǎng)殖和人類健康帶來(lái)的安全問(wèn)題，相關(guān)職能機(jī)構(gòu)應(yīng)該加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)抗菌藥物規(guī)范使用的監(jiān)管，合理選擇藥物，精確控制用藥劑量，加強(qiáng)沙門(mén)菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，積極應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性這一全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。