溫和心，龍英全，蔣榮華，盤(pán)寶進(jìn)，羅廣生 ，陳立軍

(1.貴港出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣西貴港 537100； 2.靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530028；3.玉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣西玉林 530000)

沙門(mén)菌(Salmonella)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患病病原菌，能致人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸炎、傷寒、敗血癥等[1-2]，因此受到世界各國(guó)的高度關(guān)注，該菌與人們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)系密切。流行病學(xué)研究表明，該菌在我國(guó)的分布非常廣，從人群、動(dòng)物、外環(huán)境和食品都可以分離到沙門(mén)菌[3-5]，是實(shí)驗(yàn)猴貿(mào)易必檢項(xiàng)目之一，我國(guó)是實(shí)驗(yàn)猴出口大國(guó)，沙門(mén)菌檢疫工作受到高度重視。對(duì)該細(xì)菌主要以分離培養(yǎng)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，沙門(mén)菌培養(yǎng)過(guò)程中大量雜菌會(huì)把目的菌落覆蓋，較難找出典型菌落，所以檢出率一直較低，無(wú)法滿足檢疫要求?？梢暛h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)體系中加入指示劑，可以直觀地目測(cè)反應(yīng)結(jié)果，既免除了產(chǎn)物電泳步驟，又減少了產(chǎn)物污染，克服了LAMP產(chǎn)物易污染的缺點(diǎn)，更好地發(fā)揮了LAMP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。本研究將可視LAMP技術(shù)應(yīng)用于沙門(mén)菌的快速檢測(cè)，對(duì)解決當(dāng)前檢疫難題，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫技術(shù)水平提升有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)室保存的傷寒沙門(mén)菌CMCC50039、甲型副傷寒沙門(mén)菌CMCC50093、乙型副傷寒沙門(mén)菌CMCC 50094、腸炎沙門(mén)菌CICC21482、鼠傷寒沙門(mén)菌CICC10420、大腸埃希菌ATCC25922、痢疾志賀菌ATCC51252、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌CMCC5220、空腸彎曲菌ATCC33291、溶血性鏈球菌CMCC32121、糞鏈球菌ATCC29212、李斯特菌ATCC19111、糞腸球菌ATCC35667、金黃色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌ATCC12228、銅綠假單胞菌ATCC27853、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124、阪崎腸桿菌ATCC29544、奇異變形桿菌ATCC25933、蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、綠膿桿菌ATCC15442、副溶血性弧菌 ATCC17802、肺炎克雷伯菌CMCC46117。

1.1.2 試劑與設(shè)備 DNA大片段聚合酶Bst試劑盒，NEB公司產(chǎn)品；熒光PCR試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、脫氧核苷酸(dNTP)，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；羥基萘酚藍(lán)(HNB)、甜菜堿(betaine)、硫酸鎂(AR)、礦物油，Sigma公司產(chǎn)品；引物、探針，Life Tec.公司產(chǎn)品。熒光PCR儀(ABI 7500)、PCR儀(ABI) ，Simpli Amp公司產(chǎn)品；水浴鍋(HWS24)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司公司產(chǎn)品；麥?zhǔn)蠞岫葍x，梅里埃Densicheck公司產(chǎn)品；紫外儀(WD-9403D)、電泳儀(DDY-2C)、電泳槽(DYCP-34)，北京市六一儀器廠。

1.1.3 沙門(mén)菌引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)PCR引物；參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)熒光PCR引物和探針；參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)LAMP引物(表1)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌濃度標(biāo)定和DNA提取 從平皿中挑取單個(gè)菌落，接種于3 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，36℃培養(yǎng)過(guò)夜，8 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀用9 g/L生理鹽水洗滌、離心1次，沉淀物用去離子水懸浮，用麥?zhǔn)蠞岫确?biāo)定細(xì)菌濃度， 即1MCF≈3×108CFU/mL[9]。取菌液隔水煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清即為細(xì)菌DNA，冷凍備用。

表1 沙門(mén)菌引物序列信息

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系高溫-低溫前處理試驗(yàn) 設(shè)A和B 2個(gè)試驗(yàn)組，A組將未添加Bst酶的反應(yīng)體系先95℃水浴1 min，移至50℃ 1 min,取出、開(kāi)蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL礦物油，密封管蓋，63℃水浴1.5 h，直接目測(cè)觀察結(jié)果。B組反應(yīng)體系配制好后，直接63℃水浴1.5 h，目測(cè)觀察結(jié)果。A、B 兩個(gè)試驗(yàn)組同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)菌DNA各稀釋度，比較兩個(gè)試驗(yàn)組的靈敏度。

1.2.3 PCR、熒光定量PCR、電泳LAMP、可視LAMP方法靈敏度比較試驗(yàn) PCR反應(yīng)體系：PCR預(yù)混液12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s,54℃ 30 s，72℃ 45 s,共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min,4℃保存。直接取4 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照分析結(jié)果。熒光定量PCR反應(yīng)體系：熒光定量PCR預(yù)混液10 μL，上、下游引物各1 μL，探針1 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序是：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s,60℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)；在延伸后期讀取熒光信號(hào)。

LAMP反應(yīng)體系為：10×Bst緩沖液2.5 μL，(8 U/μL)Bst1 μL，10 mmol/L dNTP 3.5 μL，100 mmol/L MgSO40.8 μL，5 mol/L Betaine 4 μL，20 μmol/L F3 0.1 μL，20 μmol/L B3 0.1 μL，20 μmol/L FIP 0.8 μL，20 μmol/L BIP 0.8 μL，總DNA 2 μL，加ddH2O至 25 μL，加入150 μL液體石臘。LAMP反應(yīng)程序：反應(yīng)體系(不含Bst酶)先95℃水浴1 min，移至50℃水浴1 min，取出、開(kāi)蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL液體石臘，密封管蓋，63℃水浴1.5 h，再煮沸2 min終止反應(yīng)，取4 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照分析結(jié)果。

可視LAMP反應(yīng)體系即是在LAMP反應(yīng)體系基礎(chǔ)上加入2 mmol/L羥基萘酚藍(lán)(HNB)1.8 μL,反應(yīng)體程序與LAMP相同，不進(jìn)行產(chǎn)物電泳，直接目測(cè)觀察結(jié)果。

上述4種方法檢測(cè)沙門(mén)菌DNA各稀釋度，根據(jù)結(jié)果比較各方法的靈敏度。

1.2.4 可視LAMP特異性試驗(yàn) 將傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌等常見(jiàn)致病性沙門(mén)菌和其他18種腸道致病菌如大腸埃希菌、痢疾志賀菌等培養(yǎng)過(guò)夜，按1.2.1法將菌液稀釋至1 MCF后，采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA。用可視LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，檢測(cè)各細(xì)菌DNA，檢驗(yàn)可視LAMP特異性。

1.2.5 樣品基質(zhì)干擾試驗(yàn) 設(shè)置2種采樣方式，取猴肛拭子、猴糞便2 g各1份置于10 mL增菌液中，36℃培養(yǎng)過(guò)夜，分別取上層增菌液3 mL備用。分別用增菌液按10倍遞增法稀釋6×108CFU/mL濃度的沙門(mén)菌，將各個(gè)稀釋度的菌液離心，沉淀用去離子水洗滌1遍，最后用去離子水恢復(fù)至原體積，使沉淀完全懸浮。按1.2.1法熱裂解細(xì)菌提取DNA。用可視LAMP檢測(cè)所提取的DNA，比較樣品基質(zhì)對(duì)試驗(yàn)的干擾情況。

1.2.6 可視LAMP與分離鑒定法比較試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)猴繁育場(chǎng)分別采用可視LAMP和細(xì)菌分離鑒定方法(國(guó)標(biāo)方法)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴沙門(mén)菌[10]，統(tǒng)計(jì)兩種方法的檢驗(yàn)結(jié)果，比較二者的檢出率和符合率。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系高溫-低溫前處理試驗(yàn)

反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)高溫-低溫前處理的A組敏感性是6 CFU/反應(yīng)，未經(jīng)過(guò)高溫-低溫前處理的B組敏感性只有600 CFU/反應(yīng)，A組敏感性顯著高于B組(圖1)，說(shuō)明高溫DNA變性和低溫促使DNA與引物結(jié)合步驟可顯著提高可視LAMP方法的敏感性。

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2A顯示,沙門(mén)菌invA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與目標(biāo)基因331 bp相符，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量隨模板量降低而減少，最低檢出限為60 CFU/反應(yīng)。圖2B顯示沙門(mén)菌Ttr基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，最低檢出限為6 CFU/反應(yīng)。傳統(tǒng)LAMP和可視LAMP都可以對(duì)沙門(mén)菌invA基因有效擴(kuò)增，圖2C 顯示，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶呈典型的梯狀排列，最低檢出限為6 CFU/反應(yīng)。圖2D顯示,可視LAMP，陰性管保持藍(lán)紫色無(wú)變化，陽(yáng)性管變成青藍(lán)色，最低檢出限為6CFU/反應(yīng)，證明指示劑羥基萘酚藍(lán)對(duì)LAMP反應(yīng)無(wú)不良作用。 綜合以上結(jié)果表明，可視LAMP與熒光定量PCR、傳統(tǒng)LAMP檢測(cè)敏感性相當(dāng)，都是6 CFU/反應(yīng)，高于PCR法敏感性60 CFU/反應(yīng)，可視LAMP目測(cè)判定結(jié)果，簡(jiǎn)單明了，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯。

A.處理；B.未處理；1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.6×10-1;N.陰性對(duì)照

A.Pretreatment;B.Non-treatment；1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.6×10-1;N.Negative control

圖1 LAMP反應(yīng)體系高溫-低溫前處理試驗(yàn)結(jié)果

Fig.1 Visual LAMP test results of system pretreatment procedure by rising and dropping temperature

A.PCR；B.熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；C.LAMP;D.可視LAMP;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.6×10-1;7.6×10-2;N.陰性對(duì)照

A.PCR；B.FQ-PCR；C.LAMP;D.Visual LAMP;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100;6.6×10-1;7.6×10-2;N.Negative control

圖2敏感性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.2 Sensitivity test results

2.3 可視LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖3顯示,同屬的傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌呈陽(yáng)性反應(yīng)，其他常見(jiàn)腸道致病菌如大腸埃希菌、痢疾志賀菌等均呈陰性反應(yīng)，表明該可視LAMP對(duì)沙門(mén)菌擴(kuò)增有較強(qiáng)的特異性。

2.4 樣品基質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果

樣品基質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，肛拭子組、猴糞便增菌培養(yǎng)物組可視LAMP敏感性均達(dá)到6 CFU/反應(yīng)，不產(chǎn)生假陽(yáng)性，表明肛拭子、猴糞便增菌培養(yǎng)物對(duì)可視LAMP的敏感度和特異性無(wú)明顯影響。

1.傷寒沙門(mén)菌;2.甲型副傷寒沙門(mén)菌;3.乙型副傷寒沙門(mén)菌;4.鼠傷寒沙門(mén)菌;5.腸炎沙門(mén)菌;6.大腸埃希菌;7.痢疾志賀菌;8.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌;9.空腸彎曲桿菌;10.溶血性鏈球菌;11.糞鏈球菌;12.李斯特菌;13.糞腸球菌;14.金黃色葡萄球菌;15.表皮葡萄球菌;16.銅綠假單胞菌;17.產(chǎn)氣莢膜梭菌;18.阪崎腸桿菌;19.奇異變形桿菌;20.蠟樣芽胞桿菌;21.綠膿桿菌;22.副溶血性弧菌;23.肺炎克雷伯菌;N.陰性對(duì)照

1.Salmonellatyphi;2.SalmonellaparatyphiA;3.SalmonellaparatyphiB;4.Salmonellatyphimurium;5.Salmonellaenteritis;6.Escherichiacoli;7.Shigelladysentery; 8.Yersiniaenterocolitca;9.Campylobacterjejuni;10.Streptococcushemolyticus;11.Streptococcusfaecalis;12.Listeria;13.Enterococcusfaecalis;14.Staphylococcusaureus;15.Staphylococcusepidermidis;16.Pseudomonasaeruginosa;17.Clostridiumperfringens;18.Enterobactersakazaki;19.Proteusmirabilis;20.Bacilluscereus;21.Pseudomonasaeruginosa;22.Vibrioparahaemolyticus;23.Klebsiellapneumoniae;N.Negative control

圖3可視LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 Specificity test result of visual LAMP

A.去離子；B.肛拭子；C.猴糞;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.0.6×10-1;N.陰性對(duì)照

A.Deion; B.Anal swab; C.Monkey faeces;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.0.6×10-1;N.Negative control

圖4樣品基質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果

Fig.4 Sample disturbance test results of visual LAMP

2.5 可視LAMP與細(xì)菌分離鑒定法對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用可視LAMP和細(xì)菌分離鑒定法同時(shí)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)猴肛拭子21批次共3 050頭份，結(jié)果分別檢出28份和17份陽(yáng)性樣品，分離鑒定法17份陽(yáng)性樣品包含于在可視LAMP陽(yáng)性樣品中。表明可視LAMP檢出率顯著高于分離鑒定法。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前述全部陽(yáng)性樣品，結(jié)果均為陽(yáng)性，表明可視LAMP檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高。此外，相對(duì)于細(xì)菌分離鑒定法，可視LAMP法檢驗(yàn)效率高，結(jié)果判定直觀明了，可以大幅提高猴場(chǎng)沙門(mén)菌檢疫技術(shù)水平。

3 討論

本研究在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中引入指示劑羥基萘酚藍(lán)形成可視LAMP，比較試驗(yàn)表明，指示劑不影響LAMP體系的性能，可視LAMP和傳統(tǒng)LAMP敏感性和特異無(wú)顯著差異?？梢昄AMP的優(yōu)點(diǎn)之一是目測(cè)反應(yīng)管顏色變化判斷結(jié)果，不需要電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢昄AMP的優(yōu)點(diǎn)之二是檢測(cè)由始至終不打開(kāi)反應(yīng)管蓋，避免氣溶膠污染，克服傳統(tǒng)LAMP開(kāi)蓋檢測(cè)極易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染的缺點(diǎn)。其三是增加反應(yīng)體系高溫模板變性和低溫促進(jìn)引物和模板結(jié)合前處理步驟，可顯著提高反應(yīng)靈敏度。據(jù)此建立的可視LAMP檢測(cè)沙門(mén)菌方法的靈敏度與傳統(tǒng)LAMP、熒光PCR相當(dāng)，高于PCR 10倍。該方法對(duì)傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、腸炎、鼠傷寒等致病性沙門(mén)菌檢測(cè)均呈陽(yáng)性，對(duì)其他腸道常見(jiàn)菌檢測(cè)呈陰性。反映受肛拭子或糞便樣品基質(zhì)干擾不顯著。對(duì)猴場(chǎng)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，可視LAMP檢出率顯著高于細(xì)菌分離鑒定法，且檢測(cè)效率遠(yuǎn)高于后者?？梢?jiàn)，可視LAMP基于LAMP，繼承了LAMP反應(yīng)效率高、設(shè)備要求低的特點(diǎn)[11]，可視LAMP又高于傳統(tǒng)LAMP，克服了傳統(tǒng)LAMP易污染的同時(shí)操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化，特別適合基層或野外作業(yè)，是非常有推廣應(yīng)用價(jià)值的檢測(cè)技術(shù)。