梁永亮，康曉慧*，張 洪，周 俗，劉 勇

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.四川省草原科學(xué)研究院，四川成都 611731)

隨著人工草地的不斷發(fā)展，人工種植牧草病害面積和危害程度日益嚴(yán)重。飼用玉米大斑病(HelminthosporiumturcicumPass.)是由大斑凸臍蠕孢屬病菌引起的病害，是飼用玉米葉部主要病害之一。飼用玉米是目前國內(nèi)普遍種植的牧草。研究結(jié)果顯示，飼用玉米作為青貯飼料具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)[1]，在四川省飼草料生產(chǎn)中具有重要作用[2-4]。隨著四川省飼用玉米種植面積的增大，飼用玉米大斑病呈現(xiàn)逐年加重的趨勢，對飼用玉米生產(chǎn)已經(jīng)造成較大影響[5]。筆者以飼用玉米大斑病菌毒素粗提液和飼用玉米活體種子及胚根為材料，系統(tǒng)研究了飼用玉米大斑病的致病機(jī)理，旨在為飼用玉米大斑病的流行規(guī)律和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試種子。飼用玉米雅玉8號種子，由四川省草原科學(xué)研究院提供。

1.1.2供試病菌。飼用玉米大斑病菌株，由四川省草原科學(xué)研究院提供，經(jīng)常規(guī)分離、純化培養(yǎng)，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1粗毒素的制備與提取。采用馬春紅等[6]方法，選用PD培養(yǎng)液作為飼用玉米大斑病病菌毒素的培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行粗毒素的制備與提取。

1.2.2毒素粗提液對種子的影響試驗(yàn)。

1.2.2.1毒素粗提液處理種子。將“1.2.1”提取的飼用玉米大斑病菌粗毒素配制成體積相同的5個(gè)濃度(50.000%、25.000%、12.500%、6.250%、3.125%)粗提液，-4 ℃保存?zhèn)溆?。采用王桂清等[7-8]方法，分別用5個(gè)濃度的毒素粗提液處理飼用玉米種子，以清水處理作對照，3次重復(fù)，分別于處理后 1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 d 取樣，備用。

1.2.2.2毒素粗提液對種子萌發(fā)的影響。處理后2.0 d，分別統(tǒng)計(jì)經(jīng)不同濃度毒素粗提液處理后種子的萌發(fā)個(gè)數(shù)，根據(jù)劉文萍等[9]方法，按公式計(jì)算毒素粗提液對種子萌發(fā)的抑制率。

1.2.2.3毒素粗提液對胚根伸長抑制率的影響。處理后2.0 d，分別統(tǒng)計(jì)經(jīng)不同濃度毒素粗提液處理后種子的胚根長度，根據(jù)劉文萍等[9]方法，按公式計(jì)算毒素粗提液對胚根伸長的抑制率。

1.2.3毒素粗提取液對胚根細(xì)胞膜通透性的影響試驗(yàn)。毒素粗提液處理的飼用玉米胚根電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量的測定按李靖等[10]方法進(jìn)行。

1.2.4保護(hù)酶活性測定。飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理的飼用玉米胚根SOD、POD、PPO和PAL這4種保護(hù)酶活性測定采用李靖等[10]、楊斌等[11]方法進(jìn)行。

1.3數(shù)據(jù)分析方法數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel97—2003軟件和SPSS 13.0完成；作圖分析采用Origin8.5.0。

2 結(jié)果與分析

2.1毒素粗提液對飼用玉米種子萌發(fā)的抑制作用由圖1可知，飼用玉米大斑病菌毒素粗提液對飼用玉米種子萌發(fā)的抑制作用明顯。處理后2.0 d，毒素粗提液對種子萌發(fā)的抑制率隨粗提液濃度的降低而逐漸減小。經(jīng)50.000%、25.000%、12.500%、6.250%、3.125%毒素粗提液處理后，飼用玉米種子的萌發(fā)抑制率分別為95.83%、75.00%、54.17%、20.83%、8.33%。

圖1 毒素粗提液對飼用玉米種子萌發(fā)的抑制率Fig.1 Inhibition rate of toxin crude extract on seed germination of forage maize

2.2毒素粗提液對飼用玉米胚根伸長的抑制作用由圖2可知，飼用玉米大斑病菌毒素粗提液對飼用玉米種子胚根伸長有顯著抑制作用。處理后2.0 d，隨毒素粗提液濃度的降低胚根伸長抑制率減小。經(jīng)50.000%、25.000%、12.500%、6.250%、3.125%毒素粗提液處理后，飼用玉米種子胚根伸長抑制率分別為92.41%、87.80%、75.61%、35.80%、28.10%。

圖2 毒素粗提液對飼用玉米胚根伸長的抑制率Fig.2 Inhibition rate of toxin crude extract on radicle growth of forage maize

2.3毒素粗提液對飼用玉米胚根電導(dǎo)率的影響

2.3.1毒素粗提液處理時(shí)間對電導(dǎo)率的影響。由圖3可知，飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理時(shí)間的長短對飼用玉米胚根電導(dǎo)率的影響顯著。在25.000%的相同毒素粗提液濃度條件下，隨處理時(shí)間的延長，處理組電導(dǎo)率先降低后升高，而對照組電導(dǎo)率呈先升高后降低趨勢。

圖3 毒素粗提液處理時(shí)間對飼用玉米胚根電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of processing days of toxin crude extract on electric conductivity in forage maize radicle

2.3.2毒素粗提液濃度對電導(dǎo)率的影響。由表1可知，飼用玉米大斑病菌毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根電導(dǎo)率有顯著的影響，且隨毒素粗提液濃度的減小，電導(dǎo)率提高率下降，胚根電導(dǎo)率下降。對照組電導(dǎo)率為72.379 μS/cm,3.125%、6.250%濃度的電導(dǎo)率增加緩慢，電導(dǎo)率提高率分別為6.082%、30.314%，而12.500%、25.000%、50.000%濃度的電導(dǎo)率增加幅度較大，處理后2.0 d，電導(dǎo)率提高率分別為58.292%、96.403%、136.867%。

表1毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根電導(dǎo)率的影響

Table1Effectoftoxincrudeextractconcentrationonelectricconductivityinforagemaizeradicle

濃度Concent-ration∥%電導(dǎo)率Electric conductivityμS/cm提高率Increase rate%50.000171.441±1.718 a136.867±2.38325.000142.154±2.576 b96.403±3.56112.500114.569±0.417 c58.292±0.6546.25094.319±1.123 d30.314±1.6193.12576.781±2.109 e6.082±2.913

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著

Note: Different small letters mean significant differences (P<0.05)

2.4毒素粗提液對飼用玉米胚根MDA含量的影響

2.4.1毒素粗提液處理時(shí)間對MDA含量的影響。由圖4可知，在25.000%毒素粗提液處理?xiàng)l件下，隨著粗提液作用時(shí)間的延長，各時(shí)間點(diǎn)MDA含量及變化幅度存在差異。處理組MDA含量先下降后上升，對照組無明顯變化，處理1.5、2.0 d時(shí)，處理組MDA含量顯著高于對照組；處理3.0、4.0 d時(shí)，處理組MDA含量與對照無顯著差異；處理5.0 d時(shí)，處理組MDA含量大幅度增長，明顯高于對照組。

圖4 毒素粗提液處理時(shí)間對飼用玉米胚根MDA含量的影響Fig.4 Effect of processing days of toxin crude extract on MDA content in forage maize radicle

2.4.2毒素粗提液濃度對MDA含量的影響。由表2可知，處理2.0 d后，不同濃度的飼用玉米大斑病毒素粗提液處理對飼用玉米胚根內(nèi)MDA含量存在顯著影響，與對照(21.145 μmol/g)相比，經(jīng)毒素粗提液處理后胚根MDA含量均明顯提高，且隨毒素粗提液濃度的減小，胚根內(nèi)MDA含量減小，MDA含量提高率下降。提高率下降幅度有差異，濃度為6.250%～50.000%時(shí)，MDA含量提高率下降幅度為27.126百分點(diǎn)～31.919百分點(diǎn)，濃度由6.250%降低至3.125%，MDA含量提高率僅下降11.742百分點(diǎn)。

表2毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根MDA含量的影響

Table2EffectoftoxincrudeextractconcentrationonMDAcontentinforagemaizeradicle

濃度Concentration%MDA含量MDA contentμmol/g提高率Increase rate%50.00047.675±0.201 a125.526±1.11325.00041.806±0.105 b97.761±1.05012.50036.073±0.056 c70.635±1.1276.25029.323±0.174 d38.716±0.7023.12526.853±0.626 e26.974±2.067

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著

Note:Different small letters mean significant differences (P<0.05)

2.5保護(hù)酶活性測定結(jié)果

2.5.1毒素粗提液對飼用玉米胚根 SOD 酶活性的影響。

2.5.1.1毒素粗提液處理時(shí)間對胚根SOD酶活性的影響。由圖5可知，25.000%的飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理后，隨著毒素作用時(shí)間的延長，對照組與處理組的SOD活性在所有時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異，飼用玉米胚根SOD活性在處理1.5～5.0 d內(nèi)均顯著低于對照。對照組與處理組的SOD活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理3.0 d時(shí)出現(xiàn)活性最高峰，對照組與處理組的SOD活性分別達(dá)453.09、297.53 U/(g·min)。

圖5 毒素粗提液處理時(shí)間對飼用玉米胚根內(nèi)SOD酶活性的影響Fig.5 Effect of processing days of toxin crude extract on SOD activity in forage maize radicle

2.5.1.2毒素粗提液濃度對胚根SOD酶活性的影響。由圖6可知，經(jīng)不同濃度飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理后，飼用玉米胚根內(nèi)的SOD酶活性與對照相比均顯著降低，其中以毒素粗提液濃度為50.000%時(shí)降低最多，SOD酶活性為258.03 U/(g·min)。在5個(gè)毒素粗提液濃度梯度內(nèi)，隨著毒素粗提液濃度的降低，SOD酶活性升高，不同濃度處理結(jié)果間差異顯著。其中，CK、50.000%、25.000%、12.500%、6.250%、3.125%處理后SOD酶活分別為441.98、258.03、273.40、290.79、354.55、379.01 U/(g·min)。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note: Different small letters mean significant differences (P<0.05)圖6 毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根內(nèi)SOD酶活性的影響Fig.6 Effect of toxin crude extract concentration on SOD activity in forage maize radicle

2.5.2毒素粗提液對飼用玉米胚根 POD 酶活性的影響。

2.5.2.1毒素粗提液處理時(shí)間對胚根POD酶活性的影響。由圖7可知，25.000%的飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理后，隨著毒素作用時(shí)間的延長，對照組與處理組的POD活性在所有時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異，飼用玉米胚根內(nèi)的POD活性在處理1.5～5.0 d內(nèi)均顯著低于對照。對照組與處理組的POD活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理3.0 d時(shí)出現(xiàn)活性最高峰，對照組與處理組的POD活性分別達(dá)17.65、9.98 U/(g·min)。

圖7 毒素粗提液處理時(shí)間對飼用玉米胚根內(nèi)POD酶活性的影響Fig.7 Effect of processing days of toxin crude extract on POD activity in forage maize radicle

2.5.2.2毒素粗提液濃度對胚根 POD酶活性的影響。由圖8可知，不同濃度飼用玉米大斑病菌粗毒素處理后，飼用玉米胚根內(nèi)的POD酶活性與對照相比均顯著降低，其中以毒素粗提液濃度為50.000%時(shí)降低最多，POD酶活性為3.63 U/(g·min)，隨著毒素粗提液濃度的降低，POD酶活性升高，不同濃度處理結(jié)果間差異顯著。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note: Different small letters mean significant differences (P<0.05)圖8 毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根內(nèi)POD酶活性的影響Fig.8 Effect of toxin crude extract concentration on POD activity in forage maize radicle

2.5.3毒素粗提液對飼用玉米胚根 PPO 酶活性的影響。

2.5.3.1毒素粗提液處理時(shí)間對胚根PPO酶活性的影響。由圖9可知，25.000%的飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理不同時(shí)間后，隨著毒素作用時(shí)間的延長，對照組與處理組的PPO活性在所有時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異，飼用玉米胚根內(nèi)的PPO活性在處理1.5～5.0 d內(nèi)均顯著低于對照。對照組與處理組的PPO活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理3.0 d時(shí)出現(xiàn)活性最高峰，對照組與處理組的PPO活性分別達(dá)2.53、1.50 U/(g·min)。

圖9 毒素粗提液處理時(shí)間對飼用玉米胚根內(nèi)PPO酶活性的影響Fig.9 Effect of processing days of toxin crude extract on PPO activity in forage maize radicle

2.5.3.2毒素粗提液濃度對胚根PPO酶活性的影響。由圖10可知，不同濃度的飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理后，飼用玉米胚根內(nèi)的PPO酶活性與對照相比均明顯降低，其中以毒素粗提液濃度為50.000%時(shí)降低最多，PPO酶活性為0.77 U/(g·min)，隨著毒素粗提液濃度的降低，PPO酶活性主要呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)毒素粗提液濃度為3.125%時(shí)，飼用玉米大斑病的處理組和對照組差異不顯著，說明PPO 酶對于此濃度不敏感，其他濃度處理結(jié)果間差異顯著。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note: Different small letters mean significant differences (P<0.05)圖10 毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根內(nèi)PPO酶活性的影響Fig.10 Effect of toxin crude extract concentration on PPO activity in forage maize radicle

2.5.4毒素粗提液對飼用玉米胚根 PAL 酶活性的影響。

2.5.4.1毒素粗提液處理時(shí)間對胚根PAL酶活性的影響。由圖11可知，25.000%的飼用玉米大斑病菌粗毒素處理不同時(shí)間后，隨著毒素作用時(shí)間的延長，對照組與處理組的PAL活性在所有時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異，飼用玉米胚根內(nèi)的PAL活性在處理1.5～5.0 d內(nèi)均顯著低于對照。對照組與處理組的PAL活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理3.0 d時(shí)出現(xiàn)活性最高峰，對照組與處理組的PAL活性分別達(dá)1.61、1.36 U/(g·min)。

圖11 毒素粗提液處理時(shí)間對飼用玉米胚根內(nèi)PAL酶活性的影響Fig.11 Effect of processing days of toxin crude extract on PAL activity in forage maize radicle

2.5.4.2毒素粗提液濃度對胚根PAL酶活性的影響。由圖12可知，不同濃度處理結(jié)果間差異顯著，不同濃度的飼用玉米大斑病菌毒素粗提液處理后，飼用玉米胚根內(nèi)的PAL酶活性與對照相比均顯著降低，其中以毒素粗提液濃度為50.000%時(shí)降低最多，PAL酶活性為0.64 U/(g·min)，隨著毒素粗提液濃度的降低，PAL酶活性呈現(xiàn)上升趨勢。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note: Different small letters mean significant differences (P<0.05)圖12 毒素粗提液濃度對飼用玉米胚根內(nèi)PAL酶活性的影響Fig.12 Effect of toxin crude extract concentration on PAL activity in forage maize radicle

3 討論

通過對飼用玉米種子生物活性的測定，研究了飼用玉米大斑病菌毒素粗提液對飼用玉米種子萌發(fā)和胚根生長的影響。結(jié)果表明，毒素粗提液處理后的種子萌發(fā)率和胚根長度均低于對照組，且毒素粗提液濃度與種子萌發(fā)和胚根伸長抑制率成正比。

MDA含量可以直接表達(dá)植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度，MDA含量與植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度成正比，MDA含量越高，細(xì)胞膜受到的損傷程度越嚴(yán)重。一般情況下，當(dāng)植物遇到毒害、高溫、高pH以及強(qiáng)光等逆境條件時(shí)，就會(huì)引起植物體內(nèi)產(chǎn)生膜質(zhì)過氧化。許多寄主專化性毒素的最初作用位點(diǎn)是質(zhì)膜，毒素與膜受體的接觸伴隨著電解質(zhì)的滲漏、膜脂過氧化、假質(zhì)壁分離等。該研究結(jié)果表明，飼用玉米大斑病胚根經(jīng)大斑病菌毒素粗提液處理后，其細(xì)胞內(nèi)MDA含量均有所提高，說明飼用玉米大斑病毒素對飼用玉米有一定的毒害作用。

病原菌毒素可誘導(dǎo)植物體內(nèi)防御酶活性的表達(dá)。SOD、PAL、POD和PPO主要參與活性氧清除和抗病有關(guān)物質(zhì)的合成，是植物體內(nèi)重要的防御酶。研究者對不同植物受病原菌侵染后防御酶活性的變化進(jìn)行研究，所得結(jié)論不盡相同。由于不同植物抗病機(jī)制不同，不同病害的生物學(xué)特性和致病機(jī)理也不相同，最終導(dǎo)致二者互作下的防御酶活性變化不同。例如，高粱大斑病菌毒素對高粱葉片細(xì)胞內(nèi)SOD、POD、PAL酶活性均有抑制作用[11]；冬棗黑疔病病原菌毒素處理新鮮棗后，結(jié)果顯示SOD酶活性呈先上升后下降趨勢[12]。

該研究結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的延長，胚根內(nèi)SOD、POD、PPO、PAL活性變化趨勢都呈先上升后下降的趨勢；隨著粗毒素濃度依次減小，胚根內(nèi)SOD、POD、PPO、PAL活性與對照相比均明顯降低，且活性主要呈上升趨勢，不同濃度處理結(jié)果間差異顯著。該研究為進(jìn)一步揭示飼用玉米大斑病菌的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。