劉發(fā)全，宋亞偉，吳 昊，張 莉，丁在亮

(安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽合肥 230091)

金芩芍注射液收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版(中藥卷)[1]，主要有金銀花、黃芩、白芍3味中藥材。金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、涼血止痢、降血降火、消咽利膈之功效，所含有綠原酸為主要藥理活性成分[2]，主治畜禽風(fēng)熱感冒、熱毒血痢、癰疽疔毒，對(duì)多種致病細(xì)菌、病毒有抑制作用，具有增強(qiáng)免疫力、護(hù)肝、消炎、解熱、止血，用于預(yù)防和治療呼吸道感染、肺炎、痢疾、腫潰瘍、丹毒等癥。黃芩性寒，味苦，入心、肺、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、涼血安胎、解毒的功效，所含有黃芩苷為主要藥理活性成分[3]，主治畜禽溫?zé)岵?，具有抗菌、解熱、?zhèn)靜、利膽、抗炎抗變態(tài)反應(yīng)，用于上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎動(dòng)不安、癰腫癤瘡等癥。芍藥性微寒，味微苦，入心、肺、肝經(jīng)，具有養(yǎng)血滋陰、止痛護(hù)肝的功效，所含有芍藥苷為主要藥理活性成分[4]，用于促進(jìn)畜禽新陳代謝，提高肌體免疫力，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用。金芩芍注射液是將15份金銀花、7份黃芩、6份白芍中藥經(jīng)蒸餾、水煎、醇沉制成純中藥獸用制劑，其具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒、抗菌保肝、解熱退燒的功能，主要用于治療動(dòng)物外感風(fēng)熱、溫病初起[5]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要規(guī)定檢測(cè)活性成分綠原酸的含量，而黃芩、白芍主要活性成分黃芩苷和芍藥苷也起很大作用，但標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定其含量檢測(cè)方法。筆者利用高效液相色譜儀(HPLC)，采用梯度洗脫法，同時(shí)測(cè)定了組方中金銀花、黃芩、白芍中的活性成分綠原酸、黃芩苷、芍藥苷含量，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器。美國(guó)Agilent公司高效液相色譜儀，型號(hào)HP 1100，配四聯(lián)梯度泵、在線脫氣機(jī)、二極管陣列紫外檢測(cè)器(DAD)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；十萬(wàn)分之一天平，德國(guó)賽多利斯，感量0.01 mg，型號(hào)BS21S。

1.1.2主要試劑。綠原酸對(duì)照品(批號(hào)Z0261407，含量97.3%)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)Z0261706，含量96.3%)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)Z0271705，含量96.8%)，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；金芩芍注射液(合肥愛(ài)瑞特生物制藥有限公司提供，批號(hào)20171001、20171002、20171003)；乙腈、甲醇均為色譜純，美國(guó)FISHER Chemical公司；磷酸，分析純，上海試劑公司；色譜用水為一級(jí)水，符合GB/T 6682中用水規(guī)定。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱取綠原酸25.91 mg、芍藥苷25.35 mg、黃芩苷24.85 mg對(duì)照品于100 mL容量瓶，加50%甲醇溶解，制成儲(chǔ)備液，分別精密量取綠原酸、芍藥苷、黃芩苷儲(chǔ)備液5 mL于50 mL容量瓶混合，加50%甲醇定溶，制成工作液。

1.2.2供試品溶液的制備。精密量取金芩芍注射液1 mL置50 mL容量瓶，分別加水、乙腈各10 mL混合，涼至室溫，加水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3色譜分析條件。色譜柱：Waters公司Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.025 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相B，四元梯度泵在線配制，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)230 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4.2線性關(guān)系的考察。HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器吸取工作液2、5、10、10、20、40 μL注入HPLC儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.3精密度試驗(yàn)。取對(duì)照品工作液，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品工作液中綠原酸、芍藥苷、黃芩苷的峰面積的RSD值。

1.2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。取供試品溶液，在室溫下放置1、6、12、24、48 h后，按“1.2.3”色譜條件，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算RSD。

1.2.4.5重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)的樣品按“1.2.2”方法制備供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜分析條件，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量和RSD。

1.2.4.6加樣回收試驗(yàn)。取同一批號(hào)樣品6份，精密加入分別與樣品中綠原酸、芍藥苷、黃芩苷含量相等的對(duì)照品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.5樣品測(cè)定。取金芩芍注射液，每批按“1.2.2”方法制備3份平行樣，按“1.2.3”色譜條件注入HPLC，測(cè)定樣品中綠原酸、芍藥苷、黃芩苷的峰面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。

2 結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。圖1、2表明，按“1.2.3”此條件下，綠原酸、芍藥苷、黃芩苷的保留時(shí)間分別為5、10、20 min左右，對(duì)照品溶液色譜主峰保留時(shí)間與供試品保留時(shí)間一致，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000。

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample

2.1.2線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，計(jì)算線性回歸方程，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，綠原酸在2.52～126.05 μg/mL、芍藥苷在1.47～73.78 μg/mL、黃芩苷在4.81～250.55 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

表2 回歸方程和線性范圍

2.1.3精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得出綠原酸、芍藥苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.34%、0.46%、0.53%(n=6)，保留時(shí)間的RSD均小于1%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得出綠原酸、芍藥苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.44%、0.68%、0.86%(n=5)，表明試樣在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算得出樣品中綠原酸、芍藥苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.31%、0.42%、0.50%(n=6)，保留時(shí)間的RSD均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，平均回收率為98.0%～102.8%，RSD為1.00%～1.15%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于金芩芍注射液中綠原酸、芍藥苷、黃芩苷含量測(cè)定。

2.2樣品含量測(cè)定由表3可知，金芩芍注射液中綠原酸、芍藥苷、黃芩苷含量分別為3.51、2.45、3.74 mg/mL。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論與討論

(1)有文獻(xiàn)報(bào)道用甲醇、磷酸溶液作為流動(dòng)相[6-8]，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠原酸、芍藥苷、黃芩苷3種成分分離度達(dá)不到要求，雜質(zhì)有干擾。以乙腈、0.025 mol/L磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫能夠縮短分析周期，增加靈敏度，提高分離度同時(shí)使峰型得到改善，減少拖尾和雜質(zhì)干擾。

(2)經(jīng)二極管陣列紫外檢測(cè)器(DAD)全波長(zhǎng)掃描，綠原酸、黃芩苷分別在327、278 nm有最大的吸收，《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版(中藥卷)規(guī)定采用327 nm測(cè)定金芩芍注射液中綠原酸含量，芍藥苷在此波長(zhǎng)處幾乎沒(méi)有吸收，芍藥苷在230 nm處有最大吸收，黃芩苷、綠原酸在230 nm處有次吸收，根據(jù)處方金銀花和黃芩投料比例較高，所以選擇230 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

(3)該研究建立了HPLC同時(shí)測(cè)定金芩芍注射液中綠原酸、芍藥苷和黃芩苷的含量方法，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法精密度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，適用于金芩芍注射液的質(zhì)量控制，為標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。