李明陽(yáng)，馬春霞，吳翰欣，吳小海，俞建昆

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；

2.昆明醫(yī)學(xué)大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，云南 昆明 650118

SOX（SRY-related HMG-box）家族作為一類轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控胚胎的發(fā)育和分化，也參與胚胎發(fā)育中的性別決定、神經(jīng)系統(tǒng)形成和血管系統(tǒng)發(fā)育等過(guò)程。該家族成員含有一段高度保守的HMG-Box序列，具有DNA結(jié)合蛋白的特性。近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)及基因芯片技術(shù)的發(fā)展[1-3]，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)該家族的重要成員之一SOX4表達(dá)異常。目前已有相關(guān)報(bào)道證明SOX4基因與肺癌相關(guān)，對(duì)肺癌的診斷、治療、療效及預(yù)后評(píng)估等均有重要意義[4-5]。該基因在肺癌中受到的調(diào)控機(jī)制尚未完全明晰。因此，我們利用生物信息學(xué)方法對(duì)SOX4基因可能存在的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步證明該基因與肺癌的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

自NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）檢索并下載人類（HOMO）SOX4基因全長(zhǎng)序列及編碼蛋白的氨基酸序列（HOMO ID：6659，NC_000006.12），保存為FASTA格式以便進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

用 Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）工具分析SOX4基因的蛋白產(chǎn)物；用在線分析軟件GCBI（https://www.gcbi.com.cn/）分析SOX4基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用特異性莖環(huán)引物對(duì)目標(biāo)微小RNA（microRNA，miRNA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物見(jiàn)表1。檢測(cè)儀器為Roche Light Cycle 480Ⅱ，試劑為HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis kit和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix。細(xì)胞系樣品為正常人胚肺成纖維細(xì)胞（KMB17）和肺癌細(xì)胞系（A549和H1299），臨床樣本為20對(duì)肺癌病人癌組織與癌旁組織（昆明醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院提供）。

表1 引物及序列

2 結(jié)果

2.1 SOX4蛋白相關(guān)指數(shù)測(cè)定

人類SOX4蛋白分子組成為C14497H24117N4879O6053S1249，相對(duì)分子質(zhì)量403 657.95。共有4879個(gè)氨基酸殘基，其中甘氨酸殘基含量最高為26.9%，等電點(diǎn)4.71。在哺乳動(dòng)物體外，該蛋白的半衰期為4.4 h，不穩(wěn)定指數(shù)為46.53，因此判定為不穩(wěn)定蛋白。溶脂系數(shù)為23.45，親水性的總平均值為0.786。

2.2 SOX4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

如圖1所示，通過(guò)在線預(yù)測(cè)，人SOX4蛋白可與TP53、DICER1和SDCBP2蛋白相互作用。

圖1 人類SOX4蛋白互作圖

2.3 SOX4基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

如圖2、3所示，人SOX4基因受多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和miRNA的調(diào)控，其中miRNA-30家族未有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)其與SOX4存在調(diào)控關(guān)系，因此我們對(duì)miRNA-30s進(jìn)行qPCR測(cè)定。

圖2 可能調(diào)控SOX4基因的lncRNA

圖3 可能調(diào)控SOX4基因的miRNA

2.4 qPCR驗(yàn)證miRNA-30s表達(dá)量

如圖4、5所示，hsa-miR30s在臨床樣本中的表達(dá)模式不完全相同。與癌旁組織相比，hsamiR30c-5p和hsa-miR30d-5p在癌組織中低表達(dá)，而hsa-miR30d-5p則相反；與正常人胚肺成纖維細(xì)胞KMB17相比，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中3個(gè)miRNA-30成員的表達(dá)模式均為高表達(dá)，這也與前期預(yù)測(cè)相反。

圖4 臨床樣本中miRNA-30s的表達(dá)量

圖5 細(xì)胞系中miRNA-30s的表達(dá)量

3 討論

作為胚胎發(fā)育中調(diào)節(jié)增殖和分化的基因，SOX4在肺癌中顯著高表達(dá)，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)?，F(xiàn)有研究證明SOX4基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程，并利用miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)[6-9]。但該基因在肺癌中的具體機(jī)制尚未完全明確，因此我們利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)SOX4基因可能存在的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)。研究結(jié)果顯示，SOX4蛋白可與TP53、DICER1和SDCBP2蛋白發(fā)生相互作用；在基因水平上，SOX4基因受多種lncRNA和miRNA的調(diào)控。miRNA與目標(biāo)基因一般為負(fù)性調(diào)控模式[10-12]，而本研究中qPCR結(jié)果與前期預(yù)測(cè)并不完全一致，由此提示雖然生物信息學(xué)可在前期為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)開(kāi)辟道路，但僅靠生物信息學(xué)的分析結(jié)果并不十分嚴(yán)謹(jǐn)，必須將軟件預(yù)測(cè)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合起來(lái)，方能得到可信度最高的結(jié)果，為進(jìn)一步證明目標(biāo)基因與疾病的關(guān)系提供科學(xué)有效的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。