錢麗麗，宋雪健，張東杰,*，張麗媛，阮長(zhǎng)青，鹿保鑫

地理標(biāo)志作為一項(xiàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)已經(jīng)得到國(guó)際認(rèn)可并受到保護(hù)[1-2]。素有“貢米”之稱的五常大米及“中國(guó)綠色米都”建三江種植建三江大米因其籽粒飽滿晶瑩剔透，營(yíng)養(yǎng)豐富，清香適口等特點(diǎn)被評(píng)為地理標(biāo)志大米[3]，備受消費(fèi)者青睞，具有廣闊的市場(chǎng)前景。一些不法商販以此為“良機(jī)”開(kāi)始制售假大米，以謀取利益，嚴(yán)重?fù)p壞了地理標(biāo)志大米的品牌效益，并擾亂了市場(chǎng)秩序。因此，為實(shí)現(xiàn)對(duì)地理標(biāo)志大米的產(chǎn)地保護(hù)研究，開(kāi)發(fā)一種快速鑒別地理標(biāo)志大米技術(shù)是亟待解決的問(wèn)題之一。目前，對(duì)大米產(chǎn)地溯源的研究技術(shù)主要有電子鼻技術(shù)[4]、電子舌技術(shù)[5]、礦物元素指紋分析技術(shù)[6]、DNA指紋分析技術(shù)[7]、電感耦合等離子技術(shù)[8]、拉曼光譜技術(shù)[9]、近紅外光譜技術(shù)[10]等。與其他技術(shù)相比較近紅外光譜具有快速、高效、無(wú)損、適用范圍廣等特點(diǎn)。

近紅外光譜分析技術(shù)是利用近紅外譜區(qū)包含的豐富的物質(zhì)信息，同時(shí)吸收帶的吸收強(qiáng)度與分子組成或化學(xué)基團(tuán)的含量有關(guān)可用于測(cè)定化學(xué)物質(zhì)的成分和分析物理性質(zhì)[11]，對(duì)于多組分的復(fù)雜樣品，其近紅外光譜也不是各組分單獨(dú)光譜的簡(jiǎn)單疊加，因此，近紅外光譜技術(shù)需要結(jié)合“化學(xué)計(jì)量法”對(duì)光譜信號(hào)進(jìn)行處理，從而提取食品中的有效信息[12]，其研究結(jié)果較為理想。近紅外光譜的采集方式主要有透射式、漫反射式、透漫射式3 種，在對(duì)固體樣品光譜采集時(shí)多以漫反射為主，而其他兩種方式多用于液體樣品的光譜采集。范積平等[13]研究發(fā)現(xiàn)利用近紅外漫反射光譜技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)來(lái)自甘肅、青海、陜西的大黃藥材進(jìn)行產(chǎn)地鑒別。Sinelli等[14]通過(guò)傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)方法并結(jié)合近紅外漫反射光譜技術(shù)對(duì)112 組初榨橄欖油進(jìn)行了產(chǎn)地溯源研究，發(fā)現(xiàn)采用線性判別式分析和簇獨(dú)立軟模式分類法對(duì)初榨橄欖油產(chǎn)地的判別正確率分別為71.6%、100%。也有學(xué)者將近紅外漫反射技術(shù)用于小米[15]、小麥[16]、茶葉[17]等產(chǎn)地溯源。目前，應(yīng)用近紅外漫反射光譜技術(shù)對(duì)大米研究多集中在品質(zhì)檢測(cè)及少量單一年份產(chǎn)地判別，鮮見(jiàn)應(yīng)用該技術(shù)對(duì)多年際大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源的研究。本研究采用近紅外漫反射光譜技術(shù)對(duì)多年份大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，為地理標(biāo)志大米產(chǎn)地保護(hù)研究提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2013—2015年采集建三江、五常地區(qū)及2015年試驗(yàn)田的樣品，均為田間采樣，采用3 點(diǎn)隨機(jī)取樣的方式進(jìn)行采集，每份樣本采集2 kg裝入尼龍網(wǎng)兜，并記錄采樣信息，所有水稻品種均為粳米。除試驗(yàn)田樣品外，其余均歸為隨機(jī)樣品。樣本詳細(xì)信息見(jiàn)表1、2。

表1 試驗(yàn)田樣品信息Table 1 Information about rice samples from experimental field

表2 隨機(jī)采樣樣品信息Table 2 Information about randomly collected rice samples

1.2 儀器與設(shè)備

FC2K礱谷機(jī) 日本大竹制作所；VP-32實(shí)驗(yàn)?zāi)朊讬C(jī)日本山本公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；TENSORII型傅里葉變換近紅外光譜儀（漫反射鍍金積分球、InGaAs檢測(cè)器） 德國(guó)布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水稻試驗(yàn)田的構(gòu)建

于2015年，以粳稻主產(chǎn)區(qū)黑龍江?。ㄎ宄！⒔ㄈ?、查哈陽(yáng)）為試驗(yàn)點(diǎn)，建立3 塊試驗(yàn)田。每塊試驗(yàn)田種植主栽中晚熟品種9 個(gè)分別為空育131、龍粳31、龍粳26、龍粳29、龍粳39、龍粳40、松粳9、五優(yōu)稻4號(hào)、綏粳4，各試驗(yàn)田育苗移栽、秧田管理、施肥、灌溉均按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)習(xí)慣，所有品種同期播種。采用3 次重復(fù)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積不少于10 m2。四周設(shè)保護(hù)行，保護(hù)行品種與各對(duì)應(yīng)品種相同。

1.3.2 樣品的前處理

采集回來(lái)的樣品經(jīng)過(guò)晾曬、去石、脫粒等前處理后，在實(shí)驗(yàn)室采用統(tǒng)一加工方式對(duì)其進(jìn)行壟谷、碾米、粉碎、過(guò)篩（100 目），待測(cè)。每個(gè)樣品礱谷2 次。碾米的進(jìn)樣量為3 次，碾米3 次，白度為3 次。

1.3.3 樣品原始光譜的采集

將傅里葉變換近紅外光譜儀預(yù)熱30 min，打開(kāi)OPUS 7.5軟件經(jīng)由檢查信號(hào)、保存峰位，掃描背景單通道光譜，每間隔1 h掃描一次背景來(lái)消除外界信息干擾保證光譜的穩(wěn)定性以減少誤差。將樣品粉末倒入玻璃杯中，用壓樣器壓實(shí)，測(cè)量樣品單通道采集樣品光譜。環(huán)境溫度為室溫（25±1）℃，相對(duì)濕度為20%～30%，光譜波數(shù)范圍12 000～4 000 cm－1，分辨率8 cm－1，掃描64 次。

1.3.4 樣品選取

試驗(yàn)田樣品用于與產(chǎn)地因素有關(guān)的特征波段篩選。其余樣品則選擇各地區(qū)樣品總量的2/3作為建模樣品用于模型的建立，1/3作為預(yù)測(cè)樣品集用于模型的驗(yàn)證。各地區(qū)用于建模和預(yù)測(cè)的樣品數(shù)見(jiàn)表3。

表3 建模與預(yù)測(cè)樣品Table 3 Modeling and prediction set samples

1.3.5 試驗(yàn)田近紅外光譜數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用OPUS 7.5軟件分別對(duì)試驗(yàn)田樣品的原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理消除噪聲、基線漂移、光色散等因素的干擾及防止過(guò)擬合現(xiàn)象的出現(xiàn)，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)田樣品進(jìn)行方差分析篩選出與產(chǎn)地有關(guān)的波段，并用于隨機(jī)樣品產(chǎn)地溯源研究。

1.3.6 模型的建立及驗(yàn)證

1.3.6.1 定性分析模型建立

采用OPUS 7.5軟件在特征波段下利用因子化法和歐式距離法對(duì)隨機(jī)樣品進(jìn)行定性分析模型建立研究，預(yù)處理方式分為矢量歸一化（standard normal variate，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)＋平滑（5、9、13、17、21、25 點(diǎn)，下同）、一階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋平滑、二階導(dǎo)數(shù)＋平滑、二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋平滑等，消除無(wú)關(guān)信息的干擾，提高模型的精度。通過(guò)比較選擇性S值最終確定定性分析模型的建立方法，其中S值表征樣品之間的距離，當(dāng)S值小于1時(shí)，表示兩類樣品“相交”，樣品未被均一鑒別；當(dāng)S值為1時(shí)，表示兩類樣品“相切”；當(dāng)S值大于1時(shí)，表示兩類樣品“相離”，樣品被均一鑒別，故S值越大于1，模型的效果越好。同時(shí)利用因子化法和歐式距離法對(duì)隨機(jī)樣品進(jìn)行聚類分析模型建立研究，預(yù)處理方式與上述相同。并通過(guò)比較樣品之間的“距離”大小確定建模方法，其中樣品之間的“距離”越大越好。

1.3.6.2 定量分析模型建立

采用留1交叉檢驗(yàn)的檢驗(yàn)方法以偏最小二乘（partial least squares，PLS）法在特征波段進(jìn)行定量分析模型的建立，分別將建三江大米的組分值賦值為－1、五常大米的組分值賦值為1，以0為衡量標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)值小于0為建三江大米、預(yù)測(cè)值大于0為五常大米[18]。原始光譜的預(yù)處理方式有消除常數(shù)偏移量、減去一條直線、SNV、最小-最大歸一化、多元散射矯正（multiplicative scatter correction，MSC）、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)、一階導(dǎo)數(shù)＋平滑、二階導(dǎo)數(shù)＋平滑、一階導(dǎo)數(shù)＋減去一條直線＋平滑、一階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋平滑、一階導(dǎo)數(shù)＋多元散射校正＋平滑，通過(guò)交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）及定向系數(shù)（R2）來(lái)衡量模型的好壞，其中R2數(shù)值越接近100%則預(yù)測(cè)含量值越接近真值；RMSECV數(shù)值越小越好；同時(shí)RMSECV先隨維數(shù)的增大快速下降后略微逐漸增大，模型效果較好，進(jìn)而確定定量分析模型。

1.3.6.3 模型驗(yàn)證

利用OPUS 7.5軟件分別選擇定性分析、聚類分析、定量分析工具欄，調(diào)入模型，調(diào)入預(yù)測(cè)樣品光譜圖，測(cè)定得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米近紅外原始光譜分析結(jié)果

圖1 試驗(yàn)田樣品（A）和隨機(jī)樣品（B）近紅外原始光譜圖Fig. 1 NIR Spectra of experimental field samples (A) and random samples (B)

大米近紅外原始光譜如圖1所示，在波段為7 500～9 000 cm-1處（I區(qū)）是C—H第3組合頻區(qū)，其中8 321 cm-1附近的吸收峰是由脂肪烴中甲基（—CH）基團(tuán)引起的；5 500～7 500 cm-1處（II區(qū)）是C—H第2組合頻區(qū)，在6 846 cm-1附近的吸收峰是因—CH2二級(jí)振動(dòng)所引起的，因與樣品中氨基酸種類及含量有關(guān)，所以較I區(qū)信息稍微強(qiáng)些；4 000～5 500cm-1處（III區(qū)）是C—H第1組合頻譜區(qū)，是表征蛋白質(zhì)及淀粉物質(zhì)中的N—H、C—H、O—H及C＝O鍵振動(dòng)的要區(qū)間，其中5 173 cm-1處的吸收峰與其有關(guān)[19]。不同產(chǎn)地及不同品種之間的近紅外光譜相似，采用一階導(dǎo)數(shù)對(duì)試驗(yàn)田原始光譜預(yù)處理后進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同地區(qū)來(lái)源的樣品在波段5 136～5 501 cm-1處均有顯著差異，說(shuō)明不同地區(qū)間樣品的近紅外光譜存在顯著性差異。在特征波段對(duì)大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究具有較強(qiáng)的代表性[20]。

2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)定性分析建模效果的影響

近紅外光譜雖然包含了豐富的物質(zhì)信息，但譜峰重疊、信號(hào)較弱、譜帶較寬，難以像中紅外光譜那樣進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析，因此近紅外光譜的定性分析主要用于物質(zhì)的種屬判別，即通過(guò)比較未知樣品與已知樣本或標(biāo)準(zhǔn)樣本的光譜確定未知樣品的歸屬[21]。在特征波段5 136～5 501 cm-1范圍內(nèi)分別采用因子化法和歐式距離法對(duì)隨機(jī)樣品的原始光譜進(jìn)行定性建模分析，如表4所示。結(jié)果表明，采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的模型效果較好，兩地區(qū)的樣品被均一鑒別，其中模型的S值為1.324 005，故選此方法建立定性分析模型，如圖2所示。王夢(mèng)東等[22]利用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合因子化法在特征波段7 400～9 900 cm-1范圍內(nèi)采用二階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋21 點(diǎn)平滑對(duì)白茶、紅茶及烏龍茶進(jìn)行判別研究，研究發(fā)現(xiàn)采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合因子化法在3類茶葉的判別中具有可行性。張敏等[23]研究發(fā)現(xiàn)，利用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合因子化法在特征波段4 482～5 238、5 369.1～6 950.5 cm-1范圍內(nèi)采用一階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋13 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式能實(shí)現(xiàn)對(duì)來(lái)自6 個(gè)地區(qū)的雞血藤的產(chǎn)地溯源判別研究。

表4 不同預(yù)處理方式對(duì)定性分析模型效果影響Table 4 Effects of different pretreatment methods on qualitative analysis model

通過(guò)對(duì)原始光譜進(jìn)行主成分分解，選取特征值較大的幾個(gè)主成分得分特征變量參與模式識(shí)別，在進(jìn)來(lái)保留有用信息的前提下，不僅壓縮了原始光譜，而且這些變量是沿最大方差方向得到的，還起到特征信息提取的作用。而標(biāo)準(zhǔn)算法采用的是歐式距離，直接使用吸光度計(jì)算光譜距離，不能體現(xiàn)特征變量的變化情況。因此，采用因子化法建立的模型精度要優(yōu)于歐式距離法。

圖2 因子化法2D得分圖Fig. 2 2D score plot by factorization method

2.3 不同預(yù)處理方式對(duì)聚類分析建模效果的影響

表5 不同預(yù)處理方式對(duì)聚類分析模型效果影響Table 5 Effects of different pretreatment methods on clustering analysis model

圖3 不同地區(qū)大米樣品的聚類分析結(jié)果Fig. 3 Cluster analysis of different geographical rice samples

聚類分析用于判定一系列近紅外譜圖的相似性，是根據(jù)樣本自身的屬性，用數(shù)學(xué)方法按照某種相似性或差異性指標(biāo)確定樣本之間的親疏關(guān)系，并按這種親疏關(guān)系程度對(duì)樣本進(jìn)行聚類。與定性分析不同，它不需要輸入任何信息，聚類分析只將相似光譜按組分類[24]。在特征波段5 136～5 501 cm-1范圍內(nèi)分別采用因子化法和歐式距離法對(duì)隨機(jī)樣品的原始光譜進(jìn)行聚類建模分析，如表5所示。結(jié)果表明，采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的模型效果較好，兩地區(qū)樣品被正確分類，且“距離”為0.918 00，如圖3所示。故選此方法建立聚類分析模型。龐艷蘋等[25]利用近紅外漫反射光譜技術(shù)因子化法在4 000～8 003.8 cm-1范圍內(nèi)采用二階導(dǎo)數(shù)＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式對(duì)255 份草莓進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，結(jié)果表明，其模型的預(yù)測(cè)正確率高達(dá)96.70%。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在特征波段4 000～7 500 cm-1范圍內(nèi)采用因子化法結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋17 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方法建立的模型能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)久保桃的產(chǎn)地鑒別[26]。

2.4 不同預(yù)處理方式對(duì)定量分析建模效果的影響

建立定量分析模型的目的是對(duì)多組分樣品的相關(guān)組分進(jìn)行定量分析。首先需要選擇能夠代表待測(cè)體系的已知組分的建模樣品，然后用這些樣品的近紅外光譜和組分值來(lái)擬合模型，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)其預(yù)測(cè)的可靠性之后，這個(gè)模型就可用來(lái)分析未知樣品的組分值[27]。PLS法將用來(lái)尋找光譜與濃度數(shù)據(jù)矩陣之間的最佳相關(guān)函數(shù)關(guān)系，具有更易于辨識(shí)系統(tǒng)信息與噪聲的優(yōu)點(diǎn)，使其擬合的模型精度更高[28]。在特征波段5 136～5 501 cm－1范圍內(nèi)采用PLS法結(jié)合交叉檢驗(yàn)法對(duì)原始光譜進(jìn)行處理，如表6所示。結(jié)果表明，采用一階導(dǎo)數(shù)＋MSC＋13 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的模型效果較好，其RMSECV為0.105，R2為98.97%，維數(shù)為4，故選此方法來(lái)建立定量分析模型。如圖4、5所示。汪靜靜等[29]研究發(fā)現(xiàn)利用近紅外漫反射光譜技術(shù)在特征波段7 559～8 531 cm－1范圍內(nèi)采用二階導(dǎo)數(shù)＋MSC＋5 點(diǎn)平滑建立的定量分析模對(duì)來(lái)自3 個(gè)地區(qū)的74 份人參樣品進(jìn)行產(chǎn)地判別，其正確率高達(dá)90%。趙艷麗等[30]在波段4 007.35～7 135.33 cm－1，采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合PLS判別分析法對(duì)3 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的70 份野生藥用植物重樓建立判別模型，其預(yù)測(cè)正確率為100%。

表6 不同預(yù)處理方式對(duì)定量分析模型效果影響Table 6 Effect of different pretreatment methods on quantitative analysis model

圖4 地區(qū)預(yù)測(cè)值與參考值相關(guān)圖Fig. 4 Predicted value versus reference value

圖5 RMSECV與維數(shù)的關(guān)系圖Fig. 5 RMSECV against dimensionality

2.5 大米產(chǎn)地溯源模型驗(yàn)證

將建立好的定性分析模型、聚類分析模型及定量分析模型分別帶入OPUS 7.5軟件中，對(duì)預(yù)測(cè)樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，定性分析模型對(duì)建三江大米及五常大米的正確判別率分別為100%、98%。聚類分析模型對(duì)建三江大米及五常大米的正確判別率分別為97.92%、98.00%。定量分析模型對(duì)建三江大米及五常大米的正確判別率分別為95.83%、94.00%，如表7所示。

表7 模型鑒別結(jié)果Table 7 Results of model validation

3 結(jié) 論

對(duì)大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源判別研究易受到產(chǎn)地、品種、施肥量等因素的影響，故為篩選與產(chǎn)地有關(guān)的因素實(shí)驗(yàn)于2015年在黑龍江五常、佳木斯、齊齊哈爾三地建立試驗(yàn)田，進(jìn)行特殊波段的篩選，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)田樣品進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理得出特征波數(shù)范圍為5 136～5 501 cm-1。在特征波段范圍內(nèi)對(duì)2013年至2015年來(lái)自建三江地區(qū)及五常地區(qū)的291 份大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的定性分析模型對(duì)建三江大米及五常大米的正確判別率分別為100%、98%。采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的聚類分析模型對(duì)建三江大米及五常大米的正確判別率分別為97.92%、98.00%。采用PLS法結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)＋MSC＋13 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的定量分析模型對(duì)建三江大米及五常大米的正確判別率分別為95.83%、94.00%。其中定性分析與聚類分析的最優(yōu)處理方法相一致。故應(yīng)用近紅外漫反射光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)年份大米的產(chǎn)地鑒別。大米產(chǎn)地溯源受多種因素影響，今后可以從土壤、基因型、施肥量等多種因素進(jìn)行研究。