冷 懿

（北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083）

研究表明，殼聚糖的抑菌性能受多種因素的影響，分子量、脫乙酰度（脫乙酰度越高，抑菌性能越好）等都會(huì)影響殼聚糖的抑菌性能，其中殼聚糖上氨基對(duì)其抑菌性能有重要影響。一般來(lái)說(shuō)，殼聚糖上正電荷越多，其抑菌性能越好。而堿性氨基酸賴氨酸帶兩個(gè)氨基基團(tuán)，猜想如果殼聚糖上連接賴氨酸可增強(qiáng)其抑菌性能。因此，本實(shí)驗(yàn)擬制備不同分子量全脫乙酰殼聚糖，并連接賴氨酸以探討不同分子量殼聚糖賴氨酸衍生物的抑菌性能，為開發(fā)新型殼聚糖類消毒劑提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料與器材

材料：殼聚糖（需添加藥品試劑）

器材：見表1

表1 實(shí)驗(yàn)器材

2 實(shí)驗(yàn)流程

原材料殼聚糖→不同分子量殼聚糖的制備→殼聚糖賴氨酸衍生物的制備→抑菌實(shí)驗(yàn)→討論與分析

3 實(shí)驗(yàn)具體步驟

3.1 全脫乙酰殼聚糖的制備

稱取400g殼聚糖，加入到20%的NaOH溶液中，攪拌均勻，于高壓滅菌鍋中120℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后于布氏漏斗抽濾，并用蒸餾水多次沖洗濾餅，測(cè)其pH，直至洗至中性，將濾餅轉(zhuǎn)移至烘箱60℃烘干稱重，得全脫乙酰殼聚糖360g。

3.2 不同分子量殼聚糖的制備

微波輔助降解殼聚糖反應(yīng)時(shí)間與殼聚糖分子量關(guān)系的探究

3.2.1 微波輔助法降解殼聚糖

4g全脫乙酰殼聚糖溶于200mL2%（微波反應(yīng)的容器一次最多反應(yīng)200mL）的乙酸中過夜待其溶解完全。

將溶解的殼聚糖置于微波反應(yīng)器中，設(shè)置微波反應(yīng)參數(shù)（600w，70℃），加 2mL 30%過氧化氫，啟動(dòng)反應(yīng)器。 分別于 6min、8min、10min、14min、20min、30min、40min、50min、70min、100min 取樣 1～2mL，置于-20℃冰箱中，備用。

3.2.2 HPLC(高效液相色譜法測(cè)定殼聚糖分子量)

取分子量為 1000Da，5000Da，12000Da，25000Da，80000Da，270000Da，670000Da，用乙酸/乙酸鈉緩沖液配成0.4%溶液，0.22um濾頭過濾，HPLC檢測(cè)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將(1)制備的樣品融化后用乙酸/乙酸鈉緩沖液稀釋成0.4%的溶液，0.22um濾頭過濾，HPLC檢測(cè)，測(cè)定不同降解時(shí)間殼聚糖的分子量。經(jīng)測(cè)定，不同時(shí)間降解所得殼聚糖分子量如表2：

表2 不同時(shí)間降解所得聚糖分子量

3.3 特定分子量殼聚糖的制備

采用微波輔助法降解殼聚糖，降解8min、14min、30min、100min這4個(gè)時(shí)間段的殼聚糖作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)應(yīng)的分子量分別為 270000 Da、36000 Da、9000 Da、5000 Da。

40g全脫乙酰的殼聚糖溶于2L2%的乙酸溶液中，過夜充分溶解。

取200mL溶液加入微波反應(yīng)器中，600w，70℃反應(yīng)8min，待反應(yīng)完全，將溶液倒入燒杯中，并將燒杯置于冷水中冷卻，防止殼聚糖分子量繼續(xù)降解，相同條件反應(yīng)兩次，制得400mL反應(yīng)8min的殼聚糖。反應(yīng)液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50℃旋蒸濃縮至200mL，置于凍干盒中于真空冷凍干燥機(jī)中凍干得淡黃色粉末狀物質(zhì)。

同樣方法制得反應(yīng)14min、30min、100min的殼聚糖，共制得4種不同分子量的全脫乙酰殼聚糖。

3.4 殼聚糖賴氨酸衍生物的制備

2g三苯基膦溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加3mL的DIAD,冰浴中攪拌溶解，溶解完畢加入50mL甲酰胺,加2g殼聚糖，攪拌10min后加入3.6g賴氨酸。冰浴下攪拌2-3h，然后撤去冰浴，室溫反應(yīng)48h。醇沉抽濾，乙醇多次洗滌，冷凍干燥機(jī)中凍干。（按此方法制得4種不同分子量的殼聚糖-賴氨酸衍生物）。

HPLC測(cè)定殼聚糖分子量：

3.4.1 緩沖液配制：稱取13.6g醋酸鈉+11.45mL冰乙酸，1L容量瓶中定容。

3.4.2 0.22um微孔濾膜過濾水和緩沖液

3.4.3 開HPLC,由上往下依次打開儀器各個(gè)模塊。打開電腦，聯(lián)機(jī)software，新建方法。

四元泵→方法(流量：0.8mL/min；用A泵100%；停止時(shí)間 25min；壓力限值：min=0，max=45)；

TCC:溫度左=右=30℃；RID:溫度35℃；四元泵→控制→定期清洗。

3.4.4 A泵接水；打開purge，打開泵，排氣 10min；連色譜柱，關(guān)purge，打開沖洗閥，沖參比30min；關(guān)泵連 buffer，開 purge排氣 10min；關(guān) purge，打開沖洗閥50min，關(guān)閉沖洗閥平衡30min。

3.4.5 進(jìn)樣

配制殼聚糖溶液0.4%

過濾樣品，水相接黃濾頭，有機(jī)相接綠濾頭

加樣：洗上樣針3-5次，吸樣品，無(wú)氣泡，進(jìn)樣20μL。

3.4.6 關(guān)閉關(guān)泵，換水；開purge排氣10min；關(guān)purge，開沖洗閥90min；換 30%乙腈平衡30min。

3.4.7 關(guān)閉software，電腦，儀器。洗凈上樣針放好。

3.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

有關(guān)抑菌實(shí)驗(yàn)所用到的培養(yǎng)皿、試管、塞子、槍頭、棉簽、濾紙片等都須在使用前經(jīng)121℃高壓滅菌15min，所用鑷子、接種環(huán)每次操作前須在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后使用。實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)中完成。所有操作須嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的要求完成，避免實(shí)驗(yàn)過程中污染微生物。所用受試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。

3.5.1 菌種活化

3.5.1.1 培養(yǎng)基配制：

將配置好的培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中（每個(gè)皿倒15～20mL）,冷卻凝固備用。

3.5.1.2 劃線接種：直接用接種環(huán)在酒精燈上燒過之后，等之冷卻，蘸取待活化的菌種，于培養(yǎng)基上進(jìn)行之字形劃線接種。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。同樣方法重復(fù)傳代一次。

表3 營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基配方

3.5.2 菌懸液制備

3.5.2.1 培養(yǎng)基配制 MH培養(yǎng)基 (Mueller-Hinton)成分：牛肉浸粉（牛肉膏）；酪蛋白水解物；淀粉。（本實(shí)驗(yàn)采用商品化的成品MH培養(yǎng)基）；MH液體培養(yǎng)基配制方法：稱取MH瓊脂12.6g，溶解于300mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷卻后，傾入試管中，備用。

3.5.2.2 菌懸液的制備 將活化好的菌種用接種環(huán)挑取少許菌體于裝有MH培養(yǎng)基的試管中，震蕩均勻，制成菌懸液。37℃培養(yǎng)18～24h，備用。

3.5.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

圖1 聚糖賴氨酸衍生物（上）與殼聚糖（下）紅外圖譜對(duì)比

3.5.3.1 受試樣品準(zhǔn)備 制備的4種分子量的殼聚糖-賴氨酸衍生物與殼聚糖原料用2%乙酸分別配成1%、0.1%濃度的溶液，并編號(hào) （CS1～CS4;CS1’～CS4’;CS-L1～CS-L4;CS-L1’～CS-L4’）,共計(jì) 16 組。

3.5.3.2 培養(yǎng)基配制 MHA培養(yǎng)基(Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏）；酪蛋白水解物；淀粉；瓊脂。（本實(shí)驗(yàn)采用商品化的成品MHA培養(yǎng)基）；MHA培養(yǎng)基配制方法：稱取MHA瓊脂12.6g，溶解于300mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中（每個(gè)皿倒15～20mL）,冷卻凝固備用。

3.5.3.3 含樣品濾紙片制備 用移液槍取配好的溶液5μL滴于濾紙片上，待濾紙片晾干后再滴5μL樣品溶液，晾干備用。每種樣品溶液制作6個(gè)含樣品的濾紙片。

3.5.3.4 平板接菌 用滅過菌的棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布于含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌各涂6個(gè)培養(yǎng)皿。

3.5.3.5 放濾紙片 將含 CS1～CS4;CS1’～CS4’樣品與含碘伏的濾紙片各一個(gè)均勻的置于一個(gè)含大腸桿菌培養(yǎng)皿中（濾紙片正面朝下放置），將含CSL1～CS-L4;CS-L1’～CS-L4’樣品與含碘伏的濾紙片各一個(gè)均勻的置于另一個(gè)含大腸桿菌培養(yǎng)皿中。同樣方式將含樣品的濾紙片放于涂布有金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿中。

做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。操作完成，37℃培養(yǎng)24h觀察抑菌圈大小。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

以殼聚糖為對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)殼聚糖衍生物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性比普通殼聚糖的抑菌活性強(qiáng)，對(duì)于金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）來(lái)說(shuō)，降解14min制得的（即分子量為270000 Da）殼聚糖衍生物的抑菌效果最好，抑菌活性最高。

5 結(jié)論

在本次的課題研究中，我們制備了全脫乙酰殼聚糖，并研究了特定條件下殼聚糖分子量與微波輔助降解時(shí)間的關(guān)系，制備了一系列特定分子量的額殼聚糖，并制備了相應(yīng)的殼聚糖賴氨酸衍生物，最后進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)。

表4 對(duì)大腸桿菌的抑制作用(抑菌圈直徑)

圖2 殼聚糖與殼聚糖賴氨酸衍生物對(duì)金黃葡萄球菌的抑制作用

通過對(duì)比殼聚糖賴氨酸衍生物組與殼聚糖組的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈普遍大于殼聚糖對(duì)照組的抑菌圈，說(shuō)明對(duì)殼聚糖進(jìn)行賴氨酸衍生化處理可顯著增高其抑菌活性。

對(duì)大腸桿菌，36000分子量的殼聚糖氨基酸衍生物具有最高的抑菌活性，而對(duì)金黃色葡萄球菌，在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，270000分子量的殼聚糖氨基酸衍生物具有最高的抑菌活性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著分子量的增加，殼聚糖氨基酸對(duì)金黃色葡萄球菌的抑致作用逐漸增加，此時(shí)并不能判斷300000分子量的殼聚糖賴氨酸衍生物具有最高的抑菌活性，其抑菌活性與分子量的關(guān)系還需進(jìn)一步增大分子量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方能驗(yàn)證。

雖然實(shí)驗(yàn)組的抑菌效果對(duì)比碘伏制劑仍然存在較大差距，但對(duì)殼聚糖進(jìn)行賴氨酸衍生化處理后，其抑菌效果已明顯高于殼聚糖，后續(xù)可通過進(jìn)一步的條件優(yōu)化，如溶劑選擇、pH的選擇、濃度的調(diào)整等方式可進(jìn)一步增強(qiáng)其抑菌效果。