黃博 金國(guó)榮 屈重霄 馬海寧 丁彩云

摘 要 目的：檢測(cè)了Notch信號(hào)通路中各受體及配體在胃癌中的表達(dá)，探討Notch信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了NOTCH1/2/3/4、JAG1/2、DLL1/3/4在12 例正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況及在胃癌組織中的異常表達(dá)情況；應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)了NOTCH1在對(duì)應(yīng)胃癌/癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果：在正常組織中受體NOTCH2和配體JAG1的表達(dá)水平較高，其余表達(dá)水平較低；在胃癌組織中，NOTCH1/3/4和JAG2的表達(dá)水平明顯提高，而其他受體和配體的表達(dá)水平變化不明顯。NOTCH1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯增高。結(jié)論：Notch信號(hào)通路中部分受體及配體在胃癌組織中表達(dá)明顯提高，Notch信號(hào)通路參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞 胃癌 Notch信號(hào)通路 受體 配體

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2； R730.231 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）15-0057-05

Expressions of the receptors and ligands in Notch signaling pathway in gastric cancer tissues*

HUANG Bo1**， JIN Guorong2， QU Chongxiao3， MA Haining1， DING Caiyun2

（1. Department of General Surgery， 2. Central Laboratory， 3. Department of Pathology， Shanxi Provincial Peoples Hospital， Taiyuan 030012， China）

ABSTRACT Objective： To detect the expressions of receptors and ligands in Notch signaling pathway in gastric cancer tissues and to explore the role of Notch signaling pathway in the occurrence and development of gastric cancer. Methods： The expression levels of NOTCH1/2/3/4， JAG1/2 and DLL1/3/4 in normal gastric tissues and the aberrant expression levels in gastric cancer tissues were studied by real-time RT-PCR. The expression of NOTCH1 protein in gastric cancer or adjacent non-tumor tissues was detected using Western Blotting. Results： The expressions of NOTCH2 and JAG1 were relatively high in normal gastric tissues while the others were relatively low. The expressions of NOTCH1/3/4 and JAG2 were significantly increased in gastric cancer tissues as compared with normal gastric tissues while other receptors and ligands showed little differences. The expression of NOTCH1 protein was significantly higher in gastric cancer tissues than adjacent non-tumor tissues. Conclusion： The expressions of a part of receptors and ligands in Notch signaling pathway are significantly increased in gastric cancer tissues， showing that Notch signaling pathway is involved in the occurrence and development of gastric cancer.

KEY WORDS gastric cancer； Notch signaling； receptor； ligand

胃癌是一種發(fā)生于胃黏膜的惡性腫瘤，是消化道常見(jiàn)的癌癥之一，其病死率居常見(jiàn)腫瘤病死率的第3位[1]。世界胃癌患者中有超過(guò)70%來(lái)自發(fā)展中國(guó)家，其中中國(guó)的胃癌發(fā)生率最高[2]。目前外科手術(shù)是胃癌治療的主要方法，隨著化療、放療、免疫治療的進(jìn)步，以及以手術(shù)為主的多學(xué)科團(tuán)隊(duì)（MDT）的綜合治療的發(fā)展，胃癌的治療取得了一定的進(jìn)步，但并沒(méi)有從根本上改變胃癌高死亡率的現(xiàn)狀，其總體生存率和無(wú)瘤生存率仍然很低。因此，迫切需要對(duì)胃癌進(jìn)行更深入的研究，尋找治療胃癌更靈敏的分子生物標(biāo)記物，為胃癌的診斷和治療提供新的突破口。

Notch信號(hào)通路在進(jìn)化上保守，參與許多細(xì)胞進(jìn)程包括增殖、分化、凋亡和干細(xì)胞維持等[3]。在哺乳動(dòng)物中，有四個(gè)Notch受體（NOTCH1/2/3/4）和五個(gè)配體（Jagged（JAG） 1/2，Delta-like ligand （DLL） 1/3/4），這些受體和配體的精確調(diào)控，對(duì)大多數(shù)組織的正常發(fā)育至關(guān)重要，其異常調(diào)控可引起組織發(fā)育異常，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。大量研究表明Notch信號(hào)通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用，但是其在胃癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用尚存在爭(zhēng)議。有研究表明NOTCH1在胃癌中表達(dá)較正常組織明顯上調(diào)，并與腫瘤的大小、分化程度、浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)[5]。NOTCH1配體JAG1表達(dá)上調(diào)的胃癌患者預(yù)后差、生存率低[6]。單因素生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOTCH1陽(yáng)性組預(yù)后較陰性組差，多因素生存分析結(jié)果顯示，NOTCH1表達(dá)是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素[7]。但仍有另外研究表明NOTCH1在胃癌中可能發(fā)揮抑癌作用，NOTCH1在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，NOTCH1的表達(dá)對(duì)胃癌的預(yù)后有積極作用[8]。因此，目前對(duì)Notch信號(hào)通路在胃癌中的作用沒(méi)有得到完全闡明。本研究選擇Notch信號(hào)通路為研究對(duì)象，檢測(cè)了Notch信號(hào)通路各受體及配體在胃癌中的表達(dá)及作用，以期獲得更多Notch信號(hào)通路參與胃癌的證據(jù)，為胃癌的早期診斷和靶向治療提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集山西省人民醫(yī)院2016年6月至2016年10月間胃癌根治術(shù)所獲得的胃癌及癌旁組織標(biāo)本12組。所有胃癌患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)為胃部惡性腫瘤，并排除并發(fā)其他疾病，且術(shù)前均未接受任何形式的放化療及靶向治療，患者均為散發(fā)病例，無(wú)家族史。其中男9例，女3例，平均年齡（57.6±11.6）歲。組織學(xué)分化等級(jí)為低分化5例，中低分化4例，中分化3例。同時(shí)選擇切緣部癌旁組織為對(duì)照，均經(jīng)病理證實(shí)為正常胃黏膜組織。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒（柱式總RNA抽提試劑盒，上海生工工程有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript？ RT Master Mix （Perfect Real Time），寶生物工程（大連）有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYBR？ Premix Ex Taq？ II （Tli RNaseH Plus），寶生物工程（大連）有限公司）；組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE電泳試劑盒、ECL顯影試劑盒（博士德生物）。PCR使用的引物由華大基因合成，引物序列見(jiàn)表1。NOTCH1抗體（ab52627，美國(guó)Abcam公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4 蛋白質(zhì)印跡法

將組織標(biāo)本于液氮中速凍后進(jìn)行研磨，使用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，離心后取上清即為組織蛋白。使用BCA法在多功能讀數(shù)儀上測(cè)定蛋白濃度。制備5%濃縮膠、10%分離膠的SDS-PAGE凝膠，取50 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。然后，使用電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜。使用NOTCH1抗體、GAPDH抗體一抗孵育過(guò)夜，TBS洗滌5 min×3次。使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育1 h，TBS洗滌5 min×6次。最后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，在成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+，美國(guó)BioRad公司）中攝影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Notch信號(hào)通路受體及配體在正常組織及胃癌組織中的表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示：在正常組織中，與β-actin相比，Notch信號(hào)通路各受體及配體的表達(dá)參差不齊，其中4個(gè)受體中NOTCH2的表達(dá)水平較高，其余表達(dá)水平較低；5個(gè)配體中，JAG1的表達(dá)水平較高，JAG2的表達(dá)水平較低，其余居中（圖1）。

在胃癌組織中，與正常組織相比，Notch信號(hào)通路各受體及配體的表達(dá)發(fā)生了不同程度的變化。其中3個(gè)受體（NOTCH1/3/4）的表達(dá)水平明顯提高，而NOTCH2的表達(dá)水平變化不明顯。配體中JAG2的表達(dá)水平明顯提高，而其他配體的表達(dá)水平的變化不明顯（圖2）。在正常胃組織中表達(dá)比較高的基因，在胃癌發(fā)生后，其變化不很明顯；但是在正常胃組織中表達(dá)較低的基因，在胃癌發(fā)生后其表達(dá)卻顯著提高。

2.2 NOTCH1在胃癌/癌旁組織中的表達(dá)

使用蛋白質(zhì)印記法進(jìn)一步驗(yàn)證NOTCH1蛋白在胃癌、癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示：在6對(duì)胃癌/癌旁組織中，NOTCH1在其中4例胃癌組織中的表達(dá)均明顯高于相應(yīng)的癌旁組織（P2、P4、P5、P6），在2例胃癌組織中的表達(dá)與相應(yīng)的癌旁組織沒(méi)有明顯差異（P1、P3）（圖3）。

使用熒光定量PCR法證實(shí)NOTCH1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

3 討論

1991年，NOTCH1在人急性T淋巴細(xì)胞白血病中被鑒定出來(lái)，首次提示Notch信號(hào)通路與腫瘤相關(guān)[10]。越來(lái)越多的證據(jù)表明Notch信號(hào)通路不僅是血液系統(tǒng)惡性腫瘤的原因，其在實(shí)體瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌等中也起著關(guān)鍵作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[11]。來(lái)自不同的研究表明，Notch信號(hào)通路各受體及配體在胃癌的進(jìn)程中發(fā)揮不同的作用。例如，對(duì)876個(gè)胃癌病人長(zhǎng)達(dá)20年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，NOTCH1/2/3/4的高表達(dá)與總生存期存在負(fù)相關(guān)[12]。NOTCH1在胃癌中的表達(dá)越高，其分化程度越低[13]。此外，NOTCH1的高表達(dá)還與胃癌的腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型有關(guān)[5]。JAG1被認(rèn)為是胃癌獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因子，它的陽(yáng)性表達(dá)提示與預(yù)后不良有關(guān)[14]。JAG2和NOTCH3的表達(dá)在腸型胃癌中明顯升高，其表達(dá)升高不僅與胃癌的發(fā)展有關(guān)，還與腸/腺型分化有關(guān)[15]。DLL1在胃癌中出現(xiàn)異常甲基化和高表達(dá)[16]。DLL4的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌干細(xì)胞的自我更新能力同時(shí)還與臨床結(jié)局有關(guān)[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜組織中，Notch信號(hào)通路中的各受體和配體的表達(dá)參差不齊，其中NOTCH2和JAG1表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。但有趣的是，在正常胃組織中表達(dá)比較高的NOTCH2和JAG1，在胃癌組織中的表達(dá)水平相當(dāng)，沒(méi)有發(fā)生明顯變化；反而是在正常胃組織中表達(dá)較低的NOTCH1/3/4和JAG2，在胃癌發(fā)生后其表達(dá)顯著提高，說(shuō)明NOTCH1/3/4和JAG2在胃癌進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。但是Notch信號(hào)通路中各受體及配體之間如何相互調(diào)節(jié)，不同的受體及配體又如何調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展還需要進(jìn)一步的研究。目前關(guān)于NOTCH1在胃癌中的作用研究較多，但仍然存在兩種不同的結(jié)論。大部分研究結(jié)果支持NOTCH1在胃癌發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用，但是仍有部分研究表明NOTCH1在胃癌中表達(dá)降低，認(rèn)為NOTCH1在胃癌中發(fā)揮抑癌基因的作用[8]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了NOTCH1在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)NOTCH1在胃癌組織中表達(dá)明顯提高，提示NOTCH1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路中的配體和受體在正常胃組織中的表達(dá)具有差異性，在胃癌組織中受體NOTCH1/3/4和配體JAG2的表達(dá)明顯提高，提示其參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。對(duì)NOTCH1蛋白的表達(dá)研究進(jìn)一步證實(shí)了NOTCH1在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用。但是Notch信號(hào)通路中受體和配體的相互作用以及Notch信號(hào)通路下游分子如何參與胃癌的發(fā)生發(fā)展需要進(jìn)一步的研究，以期為胃癌的早期診斷和靶向治療提供分子依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Torre LA， Bray F， Siegel RL， et al. Global cancer statistics， 2012[J]. CA Cancer J Clin， 2015， 65（2）： 87-108.

[2] Lin Y， Ueda J， Kikuchi S， et al. Comparative epidemiology of gastric cancer between Japan and China[J]. World J Gastroenterol， 2011， 17（39）： 4421-4428.

[3] Koch U， Radtke F. Notch and cancer： a double-edged sword[J]. Cell Mol Life Sci， 2007， 64（21）： 2746-2762.

[4] Ranganathan P， Weaver KL， Capobianco AJ. Notch signaling in solid tumors： a little bit of everything but not all the time[J]. Nat Rev Cancer， 2011， 11（5）： 338-351.

[5] Luo DH， Zhou Q， Hu SK， et al. Differential expression of Notch1 intracellular domain and p21 proteins， and their clinical significance in gastric cancer[J]. Oncol Lett， 2014， 7（2）： 471-478.

[6] Xiao HJ， Ji Q， Yang L， et al. In vivo and in vitro effects of microRNA-124 on human gastric cancer by targeting JAG1 through the Notch signaling pathway[J]. J Cell Biochem， 2018， 119（3）： 2520-2534.

[7] Zhang H， Wang X， Xu J， et al. Notch1 activation is a poor prognostic factor in patients with gastric cancer[J]. Br J Cancer， 2014， 110（9）： 2283-2290.

[8] Zhou W， Fu XQ， Zhang LL， et al. The AKT1/NF-kappa B/ Notch1/PTEN axis has an important role in chemoresistance of gastric cancer cells[J/OL]. Cell Death Dis， 2013， 4： e847. doi： 10.1038/cddis.2013.375.

[9] Kenneth JL， Thomas DS. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[10] Ellisen LW， Bird J， West DC， et al. TAN-1， the human homolog of the Drosophila notch gene， is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms[J]. Cell， 1991， 66（4）： 649-661.

[11] Yao Y， Ni Y， Zhang J， et al. The role of Notch signaling in gastric carcinoma： molecular pathogenesis and novel therapeutic targets[J]. Oncotarget， 2017， 8（32）： 53839-53853.

[12] Wu X， Liu W， Tang D， et al. Prognostic values of four Notch receptor mRNA expression in gastric cancer[J/OL]. Sci Rep， 2016， 6： 28044. doi： 10.1038/srep28044.

[13] Hu S， Chen Q， Lin T， et al. The function of Notch1 intracellular domain in the differentiation of gastric cancer[J]. Oncol Lett， 2018， 15（5）： 6171-6178.

[14] Du X， Cheng Z， Wang YH， et al. Role of Notch signaling pathway in gastric cancer： a meta-analysis of the literature[J]. World J Gastroenterol， 2014， 20（27）： 9191-9199.

[15] Kang H， An HJ， Song JY， et al. Notch 3 and Jagged 2 contribute to gastric cancer development and to glandular differentiation associated with MUC 2 and MUC5AC expression[J]. Histopathology， 2012， 61（4）： 576-586.

[16] Shen CH， Tung SY， Tseng MJ， et al. Inverse correlation between methylation and expression of the delta-like ligand 1 gene in gastric cancer[J]. Chin J Physiol， 2018， 61（2）： 65-74.

[17] Miao ZF， Xu H， Xu HM， et al. DLL4 overexpression increases gastric cancer stem/progenitor cell self-renewal ability and correlates with poor clinical outcome via Notch-1 signaling pathway activation[J]. Cancer Med， 2017， 6（1）： 245-257.