朱 原，高素萍，*，羅良旭，胡 菊，雷 霆，付曉鳳

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園林研究所，成都 611130；3.廣西大學(xué)林學(xué)院，南寧 530004）

藍(lán)花丹（Plumbago auriculata Lam.）作為一種原產(chǎn)南非的新型木本花卉，已被許多國家引進(jìn)并廣泛認(rèn)可。除具備優(yōu)秀的觀賞價(jià)值外，其次生代謝產(chǎn)物白花丹素的藥用價(jià)值也尤為突出。白花丹素在白花丹科（Plumbaginaceae）植物的根部分布最為廣泛，如藍(lán)花丹、白花丹（Plumbago zeylanica Linn.），故而得名[1]。根器官是用于獲取白花丹素的最佳藥源。目前，藍(lán)花丹獲得根的方法仍是全株挖取，雖然組培苗繁殖系數(shù)比播種苗高，但通常組培生根要經(jīng)歷“外植體-單芽-叢芽生根”的過程，培養(yǎng)周期較長[2]。本研究試圖尋求一種由葉片直接繁殖不定根的新方法，不僅具備了組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，更明顯的優(yōu)點(diǎn)是不經(jīng)過單芽、叢芽誘導(dǎo)過程，大大縮短了培養(yǎng)周期。

白花丹素（plumbagin，5-hydroxy-2-methy-1,4-naphthoquinone，5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌）為萘醌衍生物，是藍(lán)花丹的一種次生代謝產(chǎn)物。常規(guī)條件下植物次生代謝產(chǎn)物的積累是有限的，如何增加目標(biāo)產(chǎn)物的單位含量仍然是當(dāng)今研究熱點(diǎn)和難題。次生代謝產(chǎn)物是植物應(yīng)對逆境壓力發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)所形成的產(chǎn)物。已有研究表明，光質(zhì)除影響植物的光合作用及生長發(fā)育外，還影響著植物的次生代謝過程[3]。那么，光質(zhì)的脅迫是否能促進(jìn)白花丹素含量增加，目前國內(nèi)外還未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究的首要工作是探究用葉片直接誘導(dǎo)不定根的方法，成功獲得根后，再探究不同光質(zhì)及其配比對不定根中白花丹素積累影響，尋求最佳光質(zhì)配比，以期對白花丹素的生物藥源獲取提供新的途徑和方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)環(huán)境

試驗(yàn)材料為藍(lán)花丹無菌葉片，取自已建藍(lán)花丹組織培養(yǎng)快繁體系的無菌苗[6]。剪取大小基本相同，繼代次數(shù)一致的同批次葉片為外植體，以含蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=5.8±0.1，置入121℃高壓滅菌持續(xù)17min。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光周期12 h，光照強(qiáng)度2 000 lux。每瓶接種3個(gè)外植體。

1.2 藍(lán)花丹葉片直接誘導(dǎo)不定根方法

在 MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 0、0.5、1.0、1.5 mg/L的 NAA 和 0、0.1、0.2、0.3 mg/L KT，進(jìn)行 2 因素 4水平的完全隨機(jī)試驗(yàn)（見表1），重復(fù)3次。持續(xù)培養(yǎng)30 d后，每處理隨機(jī)選5個(gè)外植體，洗凈、吸除表面水分后，測量有效根數(shù)、有效根長、有效生根率（根長≥3 cm）。稱取外植體鮮重后，置入60℃烘箱持續(xù)48 h至恒重并稱取干重。上述指標(biāo)皆取均值。根據(jù)上述結(jié)果，篩選出葉片直接誘導(dǎo)不定根的最佳激素及配比。

表1 藍(lán)花丹葉片直接誘導(dǎo)不定根的激素設(shè)計(jì)Table1 Design of hormones inducing leaves explants to produce adventitious roots mg·L-1

1.3 不同光質(zhì)及配比處理葉片不定根試驗(yàn)

為避免外源激素可能對結(jié)果造成的影響和誤差，根據(jù)1.2的結(jié)果選擇最佳激素配比處理后的生根材料為外植體，先于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d以釋放其體內(nèi)激素，而后試驗(yàn)均在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行。切取生長均勻一致的葉片不定根，在不同光質(zhì)條件下持續(xù)培養(yǎng)50 d，共6個(gè)處理（見表2），每處理5次重復(fù)。以LED為光源，選用飛利浦GreenPower LED專用組培燈，外層用遮光材料覆蓋和遮蔽。每10 d取一次樣，測得樣品鮮重后，放入80℃烘箱干燥至恒重后稱取干重。烘干后的不定根輔以液氮研磨成粉供后續(xù)白花丹素含量測定使用。

表2 處理葉片不定根的不同光質(zhì)及配比Table2 Design of different light quality combination for cultivating adventitious roots

1.4 HPLC法分析葉片不定根中白花丹素含量

目前尚無HPLC檢測藍(lán)花丹中白花丹素的具體條件，故參考已發(fā)表同屬植物白花丹[4]的白花丹素測定方法，針對藍(lán)花丹不定根材料的特點(diǎn)，對樣品液和色譜條件加以調(diào)整，形成如下測定方法。

1.4.1 儀器與色譜條件

儀器平臺(tái)為安捷倫HPLC-1260 Infinity二元液相色譜系統(tǒng)。優(yōu)化的色譜條件為：Diamonsil C18，5 μm,4.6 mm×150 mm 色譜柱；流動(dòng)相乙腈∶超純水（37∶63）；洗脫時(shí)間 30 min；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL；柱溫40℃；檢測波長203 nm；靈敏度0.16 AUFS。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

白花丹素進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：481-42-5,HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。圖1為標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，白花丹素的出峰時(shí)間在21.176 min附近。精確稱取白花丹素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，甲醇溶解并定容到25 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液1 mL，再用甲醇定容稀釋至50 mL，在上述選定的色譜條件下分別進(jìn)樣2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL。以白花丹素濃度為橫坐標(biāo)，測得峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2所示），得白花丹素的線性回歸方程為Y=150.3X-126.3，R2=0.999 9（n=6）。

1.4.3 樣品液制備及白花丹素含量測定

將制得的不定根粉末過粗篩，準(zhǔn)確稱重后加25mL甲醇，超聲波10 min助溶，然后于70℃回流提取1 h，放冷至室溫后補(bǔ)足失重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，制得樣品溶液用于HPLC分析，以外標(biāo)法計(jì)算白花丹素含量。

圖1 白花丹素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure1 Standard chromatogram of HPLC plumbagin

圖2 白花丹素標(biāo)準(zhǔn)品曲線Figure2 Standard curve of HPLC plumbagin

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算各重復(fù)各指標(biāo)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行方差分析、多重比較及差異顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)計(jì)算和繪制圖表工作借助SPSS和Excel軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)花丹葉片不定根的誘導(dǎo)

本實(shí)驗(yàn)觀察到，藍(lán)花丹葉片不定根的形成有兩種誘導(dǎo)途徑。一是從葉片切口處直接發(fā)生不定根，二是先形成愈傷組織再從其上長出不定根。由表3和表4可知，不添加NAA的處理，未能誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生不定根，也無愈傷組織形成隨著時(shí)間推移，葉片開始大量發(fā)黃、后成褐色直至死亡。5號(hào)配方0.5 mg/L NAA+0 mg/L KT的處理，最早開始生根，發(fā)生在第8天，其次是6號(hào)配方0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT處理，在第9天，其他處理在第11～14天間開始產(chǎn)生不定根。

表3 不同處理對開始生根時(shí)間的影響Table3 The first rooted day of different treatments from leaves explants d

由表4可知，在添加有NAA的處理中，有效生根率和平均有效根長隨激素濃度的增加大致呈現(xiàn)先升后降的規(guī)律。5號(hào)和6號(hào)處理有效生根率最高，可達(dá)（100.00±0.00）%。6號(hào)和10號(hào)處理（1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L KT）的平均有效根長最長，分別為（6.42±0.95）cm、（7.84±1.03）cm，顯著高于其他處理，且根系長勢良好。不定根生物量積累（干鮮比）與不定根的形態(tài)變化有相似趨勢，隨著處理激素濃度的增加，干鮮比先增后減，在6號(hào)和10號(hào)處理中達(dá)峰值，分別為0.17±0.010和0.16±0.017，兩者間差異不顯著。

表4 不同處理對藍(lán)花丹葉片不定根生成的影響Table4 The formation of adventitious roots from leaves explants under different hormone environment

綜合權(quán)衡各指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為選擇MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT培養(yǎng)基配方，在溫度（25±2）℃，光周期12 h，光照強(qiáng)度2 000 lux環(huán)境下，能成功誘導(dǎo)藍(lán)花丹葉片直接發(fā)生不定根。

2.2 不同光質(zhì)對葉片不定根干物質(zhì)積累的影響

由圖3可知，培養(yǎng)50 d后，在單紅光（R）處理下，干鮮比與白光對照處理（即CK）差異不顯著。紅藍(lán)復(fù)合光處理中，藍(lán)光占比為25%和50%時(shí)（即R∶B=3∶1 和 R∶B=1∶1），相比對照表現(xiàn)出有利于不定根的物質(zhì)積累，隨著處理時(shí)間的延長干鮮比逐漸增加，差異拉大且顯著；藍(lán)光占比為 75%時(shí)（即 R∶B=1∶3），不定根干鮮比逐漸下降，且顯著低于前兩個(gè)處理，甚至在培養(yǎng)的后期（如40 d和50 d）顯著低于對照處理。單藍(lán)光（B）處理時(shí)，不定根干鮮比亦顯著低于對照，且與紅藍(lán)復(fù)合藍(lán)光占比為75%處理時(shí)相同，其不定根干物質(zhì)積累隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長并未表現(xiàn)出明顯的增長。結(jié)果表明，單藍(lán)光抑制藍(lán)花丹葉片不定根干物質(zhì)的積累，單紅光對其沒有顯著影響，而兩種光復(fù)合作用后，藍(lán)光占比25%和50%時(shí)對干物質(zhì)積累呈現(xiàn)促進(jìn)作用，而隨后藍(lán)光比例的增加逐步顯現(xiàn)出抑制作用。

圖3 不同光質(zhì)對藍(lán)花丹葉片不定根干鮮比的影響Figure3 Effects of different light qualities on the DW/FW in adventitious root of P.auriculata

2.3 不同光質(zhì)對葉片不定根中白花丹素含量的影響

由表5可知，與對照相比，單藍(lán)光（B）以及紅光占比 25%和 50%（即 R∶B=1∶3，R∶B=1∶1）的紅藍(lán)復(fù)合光處理相同天數(shù)時(shí)，不定根中白花丹素的含量明顯更高，但處理之間無顯著差異；紅光占比75%的紅藍(lán)復(fù)合光（R∶B=3∶1）和單紅光（R）處理組的白花丹素含量則顯著低于對照組。所有處理的不定根均在培養(yǎng)30 d時(shí)白花丹素含量顯著高于其他處理天數(shù)，且在藍(lán)光占比大于等于50%的光質(zhì)處理中，獲得顯著最大的白花丹素含量，即（580.80±11.15）μg/g（復(fù)合光 R∶B=1∶1），（605.14±10.64）μg/g（復(fù)合光 R∶B=1∶3）μg/g 和（582.02±15.69）μg/g（單藍(lán)光 B）。這說明一定比例的紅藍(lán)復(fù)合光有利于藍(lán)花丹葉片不定根中白花丹素的積累，其中以單藍(lán)光和紅藍(lán)復(fù)合光（其中藍(lán)光占比為75%和50%）促進(jìn)作用較強(qiáng)，但紅光比例超過50%的紅藍(lán)復(fù)合光處理則不利于不定根中白花丹素的積累，單紅光也有同樣不利的作用。隨著一定范圍內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間的延長，所有光質(zhì)處理下白花丹素含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

3 討論與結(jié)論

本文是在不破壞藍(lán)花丹野生種群及全株植物前提下，尋求一種獲取白花丹素的新途徑，即以無菌葉片為外植體直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根。實(shí)驗(yàn)表明，此過程中適宜的外源激素是必要的，其中最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L。當(dāng)成功誘導(dǎo)不定根后，必要的光質(zhì)脅迫對不定根中白花丹素積累是有利的。綜合干物質(zhì)積累和白花丹素含量情況，本文以紅、藍(lán)光質(zhì)比1∶1連續(xù)處理30 d為最佳收獲方案，而此時(shí)單位白花丹素產(chǎn)量為（580.80±11.15）μg/g（即0.058%±0.001%）。這一結(jié)果優(yōu)于J.Deshpande等[5]通過組培藍(lán)花丹愈傷組織獲取組培苗植株的單位白花丹素含量（0.032%），說明本研究用葉片直接誘導(dǎo)不定根的方法是有效的，同時(shí)也比誘導(dǎo)愈傷組織再生出植株的周期更短。

表5 不同光質(zhì)對藍(lán)花丹葉片不定根中白花丹素含量的影響Table5 Effect of different light quality on the contents of plumbagin in adventitious root of leaves of P.auriculata μg·g-1

藍(lán)花丹葉片能直接誘導(dǎo)不定根，說明該植物具有營養(yǎng)繁殖作用。此外，實(shí)驗(yàn)觀察到其生根的兩種途徑反映了該植物的營養(yǎng)生殖途徑并非單一，其機(jī)制機(jī)理還需進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)還觀察到一個(gè)有趣現(xiàn)象，NAA均能成功誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生不定根，而未添加NAA的處理無一生根，說明NAA是主導(dǎo)藍(lán)花丹葉片生根的外源激素。這與前人所說生長素在不定根發(fā)生過程中占據(jù)主要地位的結(jié)論[6]相符。林士杰等[7]對“黑林1號(hào)”楊葉片研究指出ZR（玉米素核苷，trans-Zeatin-riboside）對根原基的發(fā)生沒有顯著影響，但在隨后不定根生長過程中仍有著不可忽視的作用。在5-8和9-12號(hào)處理中，隨著KT濃度的提高，有效根長和根數(shù)起初升高而后下降，也就是說低濃度KT雖然會(huì)延遲不定根發(fā)生的時(shí)點(diǎn)，卻有利于不定根生長和發(fā)育，由此可見KT雖然延緩了不定根發(fā)生的啟動(dòng)，但對不定根的增加起著促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)榧尤隟T引起葉片體內(nèi)各內(nèi)源激素發(fā)生變化，進(jìn)而影響了不定根的分化生長發(fā)育。

干鮮比是用以衡量單位鮮重中生物量的積累程度。在本研究中，紅、藍(lán)復(fù)合光3∶1與1∶1對藍(lán)花丹葉片不定根的生物量積累具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而隨著藍(lán)光比例的逐步增加，干鮮比明顯開始下降，這說明短波光對生長量有一定的抑制。生物量的積累與光合產(chǎn)物的積累分布有著密不可分的聯(lián)系[8]，紅、藍(lán)復(fù)合光可能是促進(jìn)了藍(lán)花丹葉片某些光合產(chǎn)物的生成，從而提高了不定根生物量的積累。長波光（如紅光）有利于根系的生長，可能是因?yàn)槠鋮⑴c了碳代謝，刺激了光合產(chǎn)物的合成（如可溶性糖等），進(jìn)而促進(jìn)了根系生長[9-10]。

光質(zhì)對植物的次生代謝物含量有較大影響[11-13]，不同光質(zhì)對次生代謝物的影響不同，同一光質(zhì)對不同次生代謝物的影響也不盡相同[14]。王麗娟等[15]對草莓進(jìn)行光質(zhì)處理研究中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)膜處理下果實(shí)的類黃酮類和酚類含量積累量最大，而紅膜處理最小。王紅星[16-17]等發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光能顯著提高庫拉索蘆薈和木立蘆薈中總蒽醌含量。這些與本文紅、藍(lán)復(fù)合光中藍(lán)光占比越高越利于不定根中白花丹素積累的結(jié)果類似。張坤曉等[18]發(fā)現(xiàn)擬南芥根的避光性是藍(lán)光特異的，僅在藍(lán)光照射下根才具有避光生長的特性，這種特性也可能是導(dǎo)致本文中單藍(lán)光處理下不定根干鮮比與白花丹素含量與對照差異不顯著的原因。

外界環(huán)境脅迫對植物造成最終傷害均表現(xiàn)為ROS（植物體內(nèi)活性氧類物質(zhì)，reactive oxygen species）爆發(fā)而引起的氧化脅迫[19]。植物體內(nèi)氧化還原平衡是由抗氧化酶組成的酶促反應(yīng)系統(tǒng)和還原態(tài)物質(zhì)組成的非酶促反應(yīng)系統(tǒng)共同維持的[20]。其中，酚類物質(zhì)處于非酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，具有一定的還原能力。白花丹素為醌類化合物，隸屬酚類物質(zhì)，同樣也有相應(yīng)的還原能力。在受到某些光質(zhì)脅迫時(shí)白花丹素含量增加，說明光質(zhì)調(diào)控的白花丹素積累可能是控制不定根氧化還原能力的關(guān)鍵點(diǎn)，導(dǎo)致白花丹素與ROS或其他氧化物質(zhì)發(fā)生非酶促反應(yīng)，保護(hù)植物細(xì)胞抵御或免受侵害[21]。

前人報(bào)道，紫花丹不定根培養(yǎng)至34 d時(shí)白花丹素含量最高[22]，本文對藍(lán)花丹的研究也得到相似結(jié)論。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，在40 d、50 d時(shí)白花丹素含量規(guī)律性降低，其原因可能與初生代謝有關(guān)。初生代謝過程中產(chǎn)生的初生代謝產(chǎn)物多為次生代謝的初始物或重要參與物質(zhì)，能夠引發(fā)次生代謝中某些酶促反應(yīng)，經(jīng)過一系列的變化次生代謝產(chǎn)物開始產(chǎn)生并積累。因此，所有次生代謝物積累均具有一定的規(guī)律[11]。進(jìn)而本文推測第30 d后含量下降可能有以下4個(gè)方面原因：一是初生代謝進(jìn)行到一定時(shí)間形成的初生代謝物含量降低，影響了下游的次生代謝的有效進(jìn)行；二是藍(lán)花丹葉片在受到脅迫后，不僅激發(fā)了次生代謝產(chǎn)物這一保護(hù)機(jī)制，而同時(shí)引發(fā)了另外幾種保護(hù)機(jī)制，彼此之間相互協(xié)調(diào)共同保護(hù)，脅迫一段時(shí)間后，藍(lán)花丹葉片自我適應(yīng)及自我保護(hù)能力上升，不再需要次生代謝產(chǎn)物這一保護(hù)機(jī)制，故減少了該途徑的能量供給，從而導(dǎo)致白花丹素含量的降低；三是不定根中白花丹素發(fā)生降解，轉(zhuǎn)化為其他化合物，且降解率大于合成率；四是白花丹素從外植體中釋放到了培養(yǎng)基中，且釋放量大于自身合成量。總之，導(dǎo)致白花丹素含量下降這一現(xiàn)象的原因還尚未明確，仍待下一步的研究。