王紅紅 潘云 李艷

【摘要】目的：構(gòu)建針對(duì)人NSD2基因的shRNA慢病毒載體，并觀察其在人腎293T細(xì)胞中沉默效果，從而為進(jìn)一步研究NSD2基因在其他腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及影響莫定基礎(chǔ)。方法：以NSD2基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)并合成2條互補(bǔ)寡核苷酸序列（NSD2 shRNA-1，NSD2 shRNA-2）克隆至PLKO-βuro重組慢病毒載體中，形成新的重組慢病毒載體PLKO- NSD2-puroe然后與包裝質(zhì)粒PMDL、PV5VG、PREV在 293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，并進(jìn)一步感染293T細(xì)胞，通過提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)NSD2基因沉默效果。結(jié)果：通過PCR鑒定和DNA測(cè)序鑒定證明NSD2 shRNA-1，NSD2 shRNA-2重組shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒中插入了目的DNA片段。且通過Western Blot檢測(cè)NSD2基因沉默效果，證明了NSD2 shRNA構(gòu)建效果不錯(cuò)，可以進(jìn)一步運(yùn)用于與NSD2相關(guān)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系中。結(jié)論：成功構(gòu)建了人的NSD2基因shRNA真核表達(dá)的慢病毒載體，為進(jìn)一步應(yīng)用于其他與NSD2相關(guān)的癌細(xì)胞系，針對(duì)NSD2基因的腫瘤治療研究莫定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】NSD2：shRNA：慢病毒：載體構(gòu)建：293T細(xì)胞

NSD2又稱MMSET（multiple myelomaSET domain）或者WHSC1（Wolf- Hirschhorn syndrome candidate 1），位于染色體4p16.3上，是NSD蛋白家族的重要成員之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)NSD2基因的表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。比如，最初發(fā)現(xiàn)的因NSD2單倍體計(jì)量不足導(dǎo)致的以腦部發(fā)育過小和智力發(fā)育遲緩為特點(diǎn)的沃爾夫綜合征（Wolf Hirschhornsyndrome）[2]。研究顯示NSD2在多類腫瘤中存在高表達(dá)，且與多種腫瘤的發(fā)生及惡性程度有關(guān)[3]如：淋巴系統(tǒng)腫瘤[4]，骨肉瘤[5]，乳腺癌，胰腺癌等。且研究顯示NSD2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤[6]，結(jié)腸癌，肺癌等多種腫瘤中存在過表達(dá)[1]，提示NSD2有潛在的致瘤作用，表明NSD2可作為相關(guān)腫瘤診斷的理想標(biāo)志物[1，7]且NSD2的致癌作用首先在MM（Mutiple Myeloma，多發(fā)性骨髓瘤）中證實(shí)的[8]，t（4；14）（p16；q32）易位是MM中最常見的易位之一，與MM的不良預(yù)后有直接關(guān)系[8，9]。多項(xiàng)研究報(bào)道，NSD2的過表達(dá)在有t（4；14）（p16；q32）易位的MM病例中普遍存在，并成為這種亞型MM的一個(gè)關(guān)鍵致癌因素[10]。shRNA（shorthairpin RNA）的發(fā)現(xiàn)，已成為特異性抑制基因快捷高效表達(dá)的一種技術(shù)手段。且近年來慢病毒載體表達(dá)的shRNA介導(dǎo)的基因沉默被廣泛應(yīng)用于基因研究，藥物靶點(diǎn)的篩選等。因此為更好的研究NSD2蛋白在基因區(qū)分部特點(diǎn)，以及NSD2基因與其他基因的相關(guān)性，進(jìn)一步分析NSD2的轉(zhuǎn)錄活性，本研究從shRNA入手，構(gòu)建了針對(duì)NSD2基因的shRNA慢病毒干擾載體，并將該基因的沉默作用侵染到293T細(xì)胞中，并為進(jìn)一步分析NSD2基因在其他腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腎293T細(xì)胞株，TRC2-βLKO-βuro慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，慢病毒包裝質(zhì)粒PMDL.PV5VG、PREV全都由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所李國(guó)紅研究員實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 人NSD2基因靶向shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成

在NCBI網(wǎng)Gene數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到人NSD2基因mRNA序列（Gene ID：NM-001042424.2-CCDS33940.1）的轉(zhuǎn)錄本，PCR引物設(shè)計(jì)按照shRNA的設(shè)計(jì)原則，參照人NSD2基因序列完整的轉(zhuǎn)錄本1（NM-001042424.2），再根據(jù)TRC2-βLKO-βuro載體的特點(diǎn)（圖1）。酶切位點(diǎn)為Kpn1與ECOR1，設(shè)計(jì)合成2對(duì)shRNA單鏈寡核苷酸片段（表1）。將設(shè)計(jì)的引物發(fā)送至上海生工生物有限公司合成，得到干粉oligoDNA，先用ddH2O配置成100uM的溶液。然后引物退火：shRNA#1/2 F/R（100um）各取10ul，5XGC buffer 8ul，ddH2O 12ul共40ul，

沸水（100℃）域煮5min后，用一個(gè)燒杯連同引物加水一塊取出，室溫下使引物自然冷卻，即可形成雙鏈的shDNA。

1.2.2 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達(dá)載體的構(gòu)建

將TRC2-βLKO-βuro載體分別用Kpn1與ECOR1進(jìn)行雙酶切，體系為TRC2-PLKO-βuro載體質(zhì)粒3ug，限制性內(nèi)切酶Kpn1與ECOR1分別1ul，10X buffer 3ul，ddH20補(bǔ)足至30ul。然后將NSD2-sbDNA片段與PLKO-βuro表達(dá)載體連接。連接體系：T4酶0.5ul，載體V（PLKO）0.5ul，10XT4 buffer 2ul，Insert（退火后引物稀釋10倍用）1ul，ddH2O 16ul共20ul。16℃連接過夜。

1.2.3 重組NSD2-shRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a。取80ul混勻的菌液，均勻涂布于含Amp+100ug/ml的LB固體培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)過夜至長(zhǎng)菌。然后隨機(jī)挑取3個(gè)單克隆菌落，分別接種于4ml含50ug/ml的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，恒溫37℃搖床，200rpm/min震蕩搖過夜。次日用生工小提中量質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒，并送北京美吉生物測(cè)序。測(cè)序引物為人的U6通用引物。測(cè)序結(jié)果與引物序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果（如圖2）。

1.2.4 病毒侵染建立穩(wěn)定細(xì)胞系

1.2.4.1 慢病毒包裝 （1）當(dāng)293T細(xì)胞生長(zhǎng)密度至細(xì)胞基區(qū)的65-70%時(shí)，開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 （2）取1.77ug shRNA載體質(zhì)粒、1.152ugpMDL質(zhì)粒、0.62ugpVSVG質(zhì)粒和0.469ug pREV質(zhì)粒到一個(gè)新的1.5ml無(wú)菌EP管中與DMEM共250ul混合均勻，另一管lout的biotool溶液與DMEM共250ul混合均勻，室溫放置5min后，將上述的兩管溶液在室溫下混合均勻，在室溫靜置20min。全部轉(zhuǎn)移至待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)皿中混勻，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （3）轉(zhuǎn)染6-7小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基，給已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換液并繼續(xù)培養(yǎng)。

（4）轉(zhuǎn)染48小時(shí)后將含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)移至新的15ml無(wú)菌離心管，再在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入3ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

（5）24h后再次收取細(xì)胞培養(yǎng)基上清，與前次收取的含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基合并，室溫下2000rpm，離心5min，用濾器過濾上清液到新無(wú)菌管中。

1.2.4.2 用慢病毒侵染細(xì)胞 （1）將待侵染的細(xì)胞傳代至3.5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞貼壁時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基。并將病毒懸液滴加在細(xì)胞表面，加入0.5ul 10mg/ml polybrene后混勻，37℃恒溫箱培養(yǎng)。 （2）侵染8小時(shí)后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)皿中的液體，加入2ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 （3）在細(xì)胞生長(zhǎng)為80%，將細(xì)胞傳代至6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。細(xì)胞生長(zhǎng)到80%細(xì)胞培養(yǎng)皿時(shí)，繼續(xù)傳代。

（4）24小時(shí)后，用加相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基換液，大約7天后，存活下來的即為被慢病毒成功侵染的細(xì)胞。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)NSD2基因沉默是否構(gòu)建成功。

培養(yǎng)72h后收細(xì)胞。用500ul的RIPI裂解液（50mMTris：150mM Nael，0.5%TrionX-100；0.1 %DOC，1mMEDTA）同時(shí)加入蛋白酶抑制劑終濃度為（1mM PMSF，1000Xleupeptin，1000X Aprotinin）水浴超聲裂解細(xì)胞提取蛋白。加5XSDS loading終濃度為2X，100℃煮樣15min。Westem Blot檢測(cè)，先將蛋白定量，10% SDS-βAGE電泳跑膠，濕轉(zhuǎn)（360mA，90min）轉(zhuǎn)移至NC膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1小時(shí)。敷一抗（NSD2 ab75359 1：1000；Tubulin 1：5000），4℃孵育過夜，用1：10000的HRP標(biāo)記的抗鼠二抗室溫孵育1小時(shí)。洗膜TBST洗5次/7mino化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達(dá)載體的構(gòu)建鑒定

針對(duì)NSD2構(gòu)建的2種shRNA-NSD2-PLKO-βuro表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明插入的核苷酸序列完全正確無(wú)突變堿基（圖2），證實(shí)成功構(gòu)建2個(gè)針對(duì)NSD2基因的shRNA干擾表達(dá)載體。將兩個(gè)質(zhì)粒分別命名為shRNA-NSD2-βLKO-1和TshRNA-NSD2-βLKO-2。

2.2 Western Blot檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的人NSD2基因沉默效果

將shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2干擾質(zhì)粒通過慢病毒侵染后建立穩(wěn)定細(xì)胞系，以未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，以及shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的樣品作為對(duì)照組。Western Blot結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的NSD2表達(dá)抑制有所下降，通過慢病毒侵染建立穩(wěn)定細(xì)胞系的NSD2表達(dá)基本全部沉默。圖3。

3 討論

NSD2（MMSET或WHSC1）是一類組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能催化H3第36位發(fā)生二甲基化（H3K36rne2）[11]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5，12]。研究表明NSD2的高表達(dá)對(duì)基因的影響可能涉及：P53通路；NF-KB通路；整合素通路；細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制；c-MYc的表達(dá)等[7，13，14]。并且NSD2與淋巴系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中都存在表達(dá)的異常，與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此研究NSD2在基因區(qū)的表達(dá)水平，對(duì)探究腫瘤的特異性靶點(diǎn)以及相關(guān)抑制劑的研究具有重要臨床意義。

NSD2作為重要的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在國(guó)內(nèi)研究還比較少。因此為進(jìn)一步闡明人NSD2基因的功能及表達(dá)，本研究成功構(gòu)建了2個(gè)人NSD2基因的shRNA干擾表達(dá)載體shRNA-NSD2-βLKO-puro。通過Western Blot檢測(cè)慢病毒侵染的人NSD2基因沉默效果表明，對(duì)照組NSD2蛋白的表達(dá)與shRNA-NSD2-βLKO-Puro慢病毒侵染的NSD2蛋白表達(dá)水平有顯著差異。表明構(gòu)建的2個(gè)shRNA真核表達(dá)載體能有效抑制293T細(xì)胞中NSD2的表達(dá)。表明其下調(diào)人NSD2基因表達(dá)。其中以慢病毒侵染的shRNA NSD2沉默效果最佳?？傊狙芯砍晒?gòu)建了2個(gè)針對(duì)人NSD2基因的shRNA干擾表達(dá)載體，可顯著降低293T細(xì)胞中 NSD2基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究NSD2基因在其他癌細(xì)胞系中的表達(dá)及影響機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Theodore Vougiouklakisl，R.H.，Yusuke，Nakamural&Vassiliki;，Saloura*，1，TheNSD family of proteinmethyltransferases in humancancer.Future Medicine，2015.

[2]Toyokawa，G.，et al.，Histone LysineMethyltransferase Wolf-HirschhornSyndrome Candidate 1 Is Involvedin Human Carcinogenesis throughRegulation of the Wnt Pathway.Neoplasia，2011，13（10）：p.887-IN11.

[3]Peri，S.，et al.，NSD1-and NSD2-damaging mutations define asubset of laryngeal tumors withfavorable prognosis.Nat Commun，2017，8（O1）：p.1772.

[4]Iaffe，I.D.，et al.，Globalchromatin profiling reveals NSD2mutations in pediatric acutelymphoblastic leukemia.Nat Genet，2013，45（11）：p.1386-91.

[5]Lu MH，F(xiàn).M.，Yu XD.，NSD2 promotesosteosarcoma cell proliferationand metastasis by inhibitingE-cadherin expression.2017.

[6]Hudlebusch，H.R.，et al.，MMSETis highly expressed andassociated with aggressivenessin neuroblastoma.CancerRes，2011，71（12）：p.4226-35.

[7]Wu，Z.，I.Connolly，and K.K.Biggar，Beyond histones一theexpanding roles of proteinlysine methylation.FEBSJ，2017，284（17）：p.2732-2744.

[8]Stec I，Wright TJ，van Ommen GJ，e.a.，WHSC1，a 90 kb SET domain-containing gene，expressed inearly development and homo10gousto a Drosophila dysmorphy genemaps in the Wolf-Hirschhornsyndrome cri tical region andis fused to IgH in t（4：14）multiple myeloma.Hum Mol Genet.1998：7（07）：1071-1082.，1998.

[9]Huang，Z.，et al.，NSD2 isrecruited through its PHD domainto oncogenic gene loci todrive multiple myeloma.CancerRes，2013，73（20）：p.6277-88.

[10]Xie，Z.，et al.，MMSETregulates expression ofIRF4 in t（4：14）myeloma andits silencing potentiatesthe effect of bortezomib.Leukemia，2015，29（12）：p.2347-54.

[11]Yamada-Okabe，T.，et al.，F(xiàn)unctional characterizationof the zebrafish WHSC1-relatedgene，a homo10g of human NSD2.Biochem Biophys Res Commun，2010，402（02）：p.335-9.

[12]Shah，M.Y.，et al.，MMSET/WHSC1enhances DNA damage repair leadingto an increase in resistance tochemotherapeutic agents.Oncogene，2016，35（45）：p.5905-5915.

[13]Yang，P.，et al.，HistoneMethyltransferase NSD2/MMSETMediates Constitutive NF-BSignaling for Cancer CellProliferation，Survival，and TumorGrowth via a Feed-Forward Loop.Molecular and Cellular Bio10gy，2012，32（15）：p.3121-3131.

[14]Hamamoto，R.，V.Saloura，and Y.Nakamura，Critical roles of non-histone protein lysine methylationin human tumorigenesis.Nat RevCancer，2015，15（02）：p.110-24.