王紅紅 潘云 李艷
【摘要】目的:構(gòu)建針對(duì)人NSD2基因的shRNA慢病毒載體,并觀察其在人腎293T細(xì)胞中沉默效果,從而為進(jìn)一步研究NSD2基因在其他腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及影響莫定基礎(chǔ)。方法:以NSD2基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)并合成2條互補(bǔ)寡核苷酸序列(NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2)克隆至PLKO-βuro重組慢病毒載體中,形成新的重組慢病毒載體PLKO- NSD2-puroe然后與包裝質(zhì)粒PMDL、PV5VG、PREV在 293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒,并進(jìn)一步感染293T細(xì)胞,通過提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)NSD2基因沉默效果。結(jié)果:通過PCR鑒定和DNA測(cè)序鑒定證明NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2重組shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒中插入了目的DNA片段。且通過Western Blot檢測(cè)NSD2基因沉默效果,證明了NSD2 shRNA構(gòu)建效果不錯(cuò),可以進(jìn)一步運(yùn)用于與NSD2相關(guān)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系中。結(jié)論:成功構(gòu)建了人的NSD2基因shRNA真核表達(dá)的慢病毒載體,為進(jìn)一步應(yīng)用于其他與NSD2相關(guān)的癌細(xì)胞系,針對(duì)NSD2基因的腫瘤治療研究莫定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】NSD2:shRNA:慢病毒:載體構(gòu)建:293T細(xì)胞
NSD2又稱MMSET(multiple myelomaSET domain)或者WHSC1(Wolf- Hirschhorn syndrome candidate 1),位于染色體4p16.3上,是NSD蛋白家族的重要成員之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)NSD2基因的表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。比如,最初發(fā)現(xiàn)的因NSD2單倍體計(jì)量不足導(dǎo)致的以腦部發(fā)育過小和智力發(fā)育遲緩為特點(diǎn)的沃爾夫綜合征(Wolf Hirschhornsyndrome)[2]。研究顯示NSD2在多類腫瘤中存在高表達(dá),且與多種腫瘤的發(fā)生及惡性程度有關(guān)[3]如:淋巴系統(tǒng)腫瘤[4],骨肉瘤[5],乳腺癌,胰腺癌等。且研究顯示NSD2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤[6],結(jié)腸癌,肺癌等多種腫瘤中存在過表達(dá)[1],提示NSD2有潛在的致瘤作用,表明NSD2可作為相關(guān)腫瘤診斷的理想標(biāo)志物[1,7]且NSD2的致癌作用首先在MM(Mutiple Myeloma,多發(fā)性骨髓瘤)中證實(shí)的[8],t(4;14)(p16;q32)易位是MM中最常見的易位之一,與MM的不良預(yù)后有直接關(guān)系[8,9]。多項(xiàng)研究報(bào)道,NSD2的過表達(dá)在有t(4;14)(p16;q32)易位的MM病例中普遍存在,并成為這種亞型MM的一個(gè)關(guān)鍵致癌因素[10]。shRNA(shorthairpin RNA)的發(fā)現(xiàn),已成為特異性抑制基因快捷高效表達(dá)的一種技術(shù)手段。且近年來慢病毒載體表達(dá)的shRNA介導(dǎo)的基因沉默被廣泛應(yīng)用于基因研究,藥物靶點(diǎn)的篩選等。因此為更好的研究NSD2蛋白在基因區(qū)分部特點(diǎn),以及NSD2基因與其他基因的相關(guān)性,進(jìn)一步分析NSD2的轉(zhuǎn)錄活性,本研究從shRNA入手,構(gòu)建了針對(duì)NSD2基因的shRNA慢病毒干擾載體,并將該基因的沉默作用侵染到293T細(xì)胞中,并為進(jìn)一步分析NSD2基因在其他腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)機(jī)制提供基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
人腎293T細(xì)胞株,TRC2-βLKO-βuro慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒,大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,慢病毒包裝質(zhì)粒PMDL.PV5VG、PREV全都由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所李國(guó)紅研究員實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。
1.2 方法
1.2.1 人NSD2基因靶向shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成
在NCBI網(wǎng)Gene數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到人NSD2基因mRNA序列(Gene ID:NM-001042424.2-CCDS33940.1)的轉(zhuǎn)錄本,PCR引物設(shè)計(jì)按照shRNA的設(shè)計(jì)原則,參照人NSD2基因序列完整的轉(zhuǎn)錄本1(NM-001042424.2),再根據(jù)TRC2-βLKO-βuro載體的特點(diǎn)(圖1)。酶切位點(diǎn)為Kpn1與ECOR1,設(shè)計(jì)合成2對(duì)shRNA單鏈寡核苷酸片段(表1)。將設(shè)計(jì)的引物發(fā)送至上海生工生物有限公司合成,得到干粉oligoDNA,先用ddH2O配置成100uM的溶液。然后引物退火:shRNA#1/2 F/R(100um)各取10ul,5XGC buffer 8ul,ddH2O 12ul共40ul,
沸水(100℃)域煮5min后,用一個(gè)燒杯連同引物加水一塊取出,室溫下使引物自然冷卻,即可形成雙鏈的shDNA。
1.2.2 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達(dá)載體的構(gòu)建
將TRC2-βLKO-βuro載體分別用Kpn1與ECOR1進(jìn)行雙酶切,體系為TRC2-PLKO-βuro載體質(zhì)粒3ug,限制性內(nèi)切酶Kpn1與ECOR1分別1ul,10X buffer 3ul,ddH20補(bǔ)足至30ul。然后將NSD2-sbDNA片段與PLKO-βuro表達(dá)載體連接。連接體系:T4酶0.5ul,載體V(PLKO)0.5ul,10XT4 buffer 2ul,Insert(退火后引物稀釋10倍用)1ul,ddH2O 16ul共20ul。16℃連接過夜。
1.2.3 重組NSD2-shRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a。取80ul混勻的菌液,均勻涂布于含Amp+100ug/ml的LB固體培養(yǎng)基中,37度培養(yǎng)過夜至長(zhǎng)菌。然后隨機(jī)挑取3個(gè)單克隆菌落,分別接種于4ml含50ug/ml的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中,恒溫37℃搖床,200rpm/min震蕩搖過夜。次日用生工小提中量質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒,并送北京美吉生物測(cè)序。測(cè)序引物為人的U6通用引物。測(cè)序結(jié)果與引物序列比對(duì),比對(duì)結(jié)果(如圖2)。
1.2.4 病毒侵染建立穩(wěn)定細(xì)胞系
1.2.4.1 慢病毒包裝 (1)當(dāng)293T細(xì)胞生長(zhǎng)密度至細(xì)胞基區(qū)的65-70%時(shí),開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 (2)取1.77ug shRNA載體質(zhì)粒、1.152ugpMDL質(zhì)粒、0.62ugpVSVG質(zhì)粒和0.469ug pREV質(zhì)粒到一個(gè)新的1.5ml無(wú)菌EP管中與DMEM共250ul混合均勻,另一管lout的biotool溶液與DMEM共250ul混合均勻,室溫放置5min后,將上述的兩管溶液在室溫下混合均勻,在室溫靜置20min。全部轉(zhuǎn)移至待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)皿中混勻,將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 (3)轉(zhuǎn)染6-7小時(shí)后,用新鮮培養(yǎng)基,給已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換液并繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后將含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)移至新的15ml無(wú)菌離心管,再在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入3ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
(5)24h后再次收取細(xì)胞培養(yǎng)基上清,與前次收取的含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基合并,室溫下2000rpm,離心5min,用濾器過濾上清液到新無(wú)菌管中。
1.2.4.2 用慢病毒侵染細(xì)胞 (1)將待侵染的細(xì)胞傳代至3.5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,當(dāng)細(xì)胞貼壁時(shí),吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基。并將病毒懸液滴加在細(xì)胞表面,加入0.5ul 10mg/ml polybrene后混勻,37℃恒溫箱培養(yǎng)。 (2)侵染8小時(shí)后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)皿中的液體,加入2ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 (3)在細(xì)胞生長(zhǎng)為80%,將細(xì)胞傳代至6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。細(xì)胞生長(zhǎng)到80%細(xì)胞培養(yǎng)皿時(shí),繼續(xù)傳代。
(4)24小時(shí)后,用加相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基換液,大約7天后,存活下來的即為被慢病毒成功侵染的細(xì)胞。
1.2.5 Western Blot檢測(cè)NSD2基因沉默是否構(gòu)建成功。
培養(yǎng)72h后收細(xì)胞。用500ul的RIPI裂解液(50mMTris:150mM Nael,0.5%TrionX-100;0.1 %DOC,1mMEDTA)同時(shí)加入蛋白酶抑制劑終濃度為(1mM PMSF,1000Xleupeptin,1000X Aprotinin)水浴超聲裂解細(xì)胞提取蛋白。加5XSDS loading終濃度為2X,100℃煮樣15min。Westem Blot檢測(cè),先將蛋白定量,10% SDS-βAGE電泳跑膠,濕轉(zhuǎn)(360mA,90min)轉(zhuǎn)移至NC膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1小時(shí)。敷一抗(NSD2 ab75359 1:1000;Tubulin 1:5000),4℃孵育過夜,用1:10000的HRP標(biāo)記的抗鼠二抗室溫孵育1小時(shí)。洗膜TBST洗5次/7mino化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。
2 結(jié)果與分析
2.1 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達(dá)載體的構(gòu)建鑒定
針對(duì)NSD2構(gòu)建的2種shRNA-NSD2-PLKO-βuro表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果表明插入的核苷酸序列完全正確無(wú)突變堿基(圖2),證實(shí)成功構(gòu)建2個(gè)針對(duì)NSD2基因的shRNA干擾表達(dá)載體。將兩個(gè)質(zhì)粒分別命名為shRNA-NSD2-βLKO-1和TshRNA-NSD2-βLKO-2。
2.2 Western Blot檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的人NSD2基因沉默效果
將shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2干擾質(zhì)粒通過慢病毒侵染后建立穩(wěn)定細(xì)胞系,以未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞,以及shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的樣品作為對(duì)照組。Western Blot結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的NSD2表達(dá)抑制有所下降,通過慢病毒侵染建立穩(wěn)定細(xì)胞系的NSD2表達(dá)基本全部沉默。圖3。
3 討論
NSD2(MMSET或WHSC1)是一類組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,能催化H3第36位發(fā)生二甲基化(H3K36rne2)[11],在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5,12]。研究表明NSD2的高表達(dá)對(duì)基因的影響可能涉及:P53通路;NF-KB通路;整合素通路;細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制;c-MYc的表達(dá)等[7,13,14]。并且NSD2與淋巴系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中都存在表達(dá)的異常,與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此研究NSD2在基因區(qū)的表達(dá)水平,對(duì)探究腫瘤的特異性靶點(diǎn)以及相關(guān)抑制劑的研究具有重要臨床意義。
NSD2作為重要的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,在國(guó)內(nèi)研究還比較少。因此為進(jìn)一步闡明人NSD2基因的功能及表達(dá),本研究成功構(gòu)建了2個(gè)人NSD2基因的shRNA干擾表達(dá)載體shRNA-NSD2-βLKO-puro。通過Western Blot檢測(cè)慢病毒侵染的人NSD2基因沉默效果表明,對(duì)照組NSD2蛋白的表達(dá)與shRNA-NSD2-βLKO-Puro慢病毒侵染的NSD2蛋白表達(dá)水平有顯著差異。表明構(gòu)建的2個(gè)shRNA真核表達(dá)載體能有效抑制293T細(xì)胞中NSD2的表達(dá)。表明其下調(diào)人NSD2基因表達(dá)。其中以慢病毒侵染的shRNA NSD2沉默效果最佳??傊狙芯砍晒?gòu)建了2個(gè)針對(duì)人NSD2基因的shRNA干擾表達(dá)載體,可顯著降低293T細(xì)胞中 NSD2基因的表達(dá),為進(jìn)一步研究NSD2基因在其他癌細(xì)胞系中的表達(dá)及影響機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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