程立銳，陳小翠,2，代帥帥，馬 冰，任 民，蔣彩虹，劉 旦，文柳瓔，楊愛國*

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煙草黃瓜花葉病毒抗性位點發(fā)掘

程立銳1，陳小翠1,2，代帥帥1，馬 冰1，任 民1，蔣彩虹1，劉 旦1，文柳瓔1，楊愛國1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.遵義市農(nóng)業(yè)科學院，貴州 遵義 563006）

煙草黃瓜花葉病毒（CMV）是煙草生產(chǎn)中主要病害之一，發(fā)掘其抗性位點，培育抗病品種是最有效的策略之一。本研究利用高抗CMV烤煙品種臺煙8號為輪回親本，優(yōu)質感病烤煙品種NC82為供體親本，配置BC1F1群體。在此基礎上，利用組織快繁技術對200份BC1F1群體進行快繁，苗期人工接種CMV，獲得穩(wěn)定、可靠的表型數(shù)據(jù)。利用SSR標記構建遺傳圖譜，進而利用單向方差分析和完備復合區(qū)間作圖法發(fā)掘CMV抗性位點。結果表明，單向方差分析法分別檢測到5個與發(fā)病率性狀和病情指數(shù)性狀相關的標記；完備復合區(qū)間法共定位到5個QTL，其中2個與發(fā)病率性狀相關，3個與病情指數(shù)性狀相關。相關定位結果對開展分子育種輔助改良煙草CMV抗性具有一定意義。

煙草；黃瓜花葉病毒；數(shù)量性狀位點

黃瓜花葉病毒?。–ucumber mosaic virus, CMV）是煙草最主要的病害之一，在世界各大煙區(qū)均有發(fā)生，嚴重影響煙葉的產(chǎn)量和品質，導致了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。煙草CMV的發(fā)生在一定程度上限制了一些優(yōu)質品種的推廣和利用。目前，煙草病毒病沒有特效的防治措施，對優(yōu)良主栽品種進行抗性改良，是保障煙葉生產(chǎn)安全最為快速有效的策略。

CMV除去侵染煙草外，還可以侵染辣椒、西紅柿等其他作物[3-4]，因此在其他作物上CMV抗性遺傳及定位研究有所報道。在模式植物擬南芥上，一個基因（）被認為與CMV互作產(chǎn)生過敏性壞死，進而產(chǎn)生完全抗性[5]。在其他重要作物中，CMV抗病被認為受單基因和多基因共同控制，多個與CMV抗性相關的遺傳位點被定位[6-7]。

但是，與其他作物相比，煙草CMV抗性遺傳研究基礎相對落后，主要集中在傳統(tǒng)遺傳學范疇。TERNOVSKIJ等[8]研究發(fā)現(xiàn)煙草CMV抗性由隱性單基因控制，但是也有研究表明煙草CMV病毒病抗性性狀遺傳規(guī)律較復雜，既受主效基因控制又表現(xiàn)為多基因影響的復雜數(shù)量性狀遺傳規(guī)律[9-11]。到目前為止沒有找到免疫CMV煙草種質材料，大多數(shù)抗性種質表現(xiàn)為水平抗性，具有明顯的數(shù)量遺傳特征。經(jīng)典的CMV抗性遺傳研究表明，CMV抗性受、、、和等5個基因控制，其中基因來源于野生煙粘煙草（），和來自于煙草種質Ambalema，和來源于煙草種質T.I.245[12]。隨著分子標記技術的發(fā)展，尤其是SSR標記在煙草中的開發(fā)[13-14]，使得開展煙草CMV抗性位點定位成為可能。文軻等[15]利用BC1群體定位到與CMV抗性連鎖的1個SSR標記，位于10號連鎖群上。

目前，對于煙草CMV抗性遺傳機制還缺乏必要的認識，如何有效地將CMV抗性位點導入主栽品種實現(xiàn)抗性改良，對育種家來說是一個極大的挑戰(zhàn)。本研究利用CMV抗源臺煙8號與感病品種NC82組合配置的回交群體為材料，發(fā)掘煙草CMV抗性位點，鑒定與之緊密連鎖的分子標記。相關研究對闡明煙草CMV抗性機理以及培育抗CMV新品種具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由我國培育的烤煙品種臺煙8號高抗黃瓜花葉病毒，是煙草CMV抗性育種中重要的抗源。而由美國引進的烤煙品種NC82品質好但是高感CMV。本研究利用抗源臺煙8號為母本，高感品種NC82為父本，配置雜交F1，進而利用臺煙8號為輪回親本，與F1回交，構建BC1F1群體，群體大小200株。

1.2 表型鑒定

為了獲得穩(wěn)定、可靠的數(shù)據(jù)，將每個BC1F1單株利用組織快繁50株。具體操作步驟參考任建青等[16]的報道。

2013年5月，雙親及200份BC1F1種植在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所即墨（北緯35.4°，東經(jīng)119.3°）溫室中。采用盆栽，盆高10 cm，直徑12 cm，每個盆中栽種1棵，每個株系種10株，兩次重復。13 h/9 h晝夜循環(huán)，溫室溫度24~29 ℃，相對濕度60%~75%。在植株長到六葉期，利用摩擦接種法進行CMV（Fny株系）接種，接種方法參考代帥帥等[2]的報道。在接種后15 d調查發(fā)病情況，調查標準參照煙草病蟲害分級及調查方法GB/T 23222—2008國家標準。利用發(fā)病率（Incidence of Disease, ID）和病情指數(shù)（Disease Index, DI）來衡量發(fā)病情況，其中發(fā)病率和病情指數(shù)計算公式如下：

發(fā)病率=（各級病株數(shù)/總鑒定株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=∑（各級病株×該病級數(shù)）×100/（調查總株×最高級數(shù)）

1.3 遺傳圖譜構建及QTL定位

株系內混取不同單株的嫩葉，放置于液氮中，利用CTAB方法[13]提取DNA。根據(jù)BINDLER等[14]公布的信息合成SSR引物，利用PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定不同株系的基因型，具體DNA提取、SSR引物合成信息及檢測操作步驟參考文獻[13-14]。利用Joinmap4.0軟件[17]構建遺傳圖譜，以LOD值大于3.0進行分組，利用Kosambi函數(shù)計算遺傳距離，具體軟件相關操作步驟參考文獻[15,18]。采用Mapchart 2.2軟件[19]繪制遺傳圖譜。

分別利用單向方差分析和完備復合區(qū)間作圖法（Inclusive Composite Interval Mapping, ICIM）進行性狀QTL定位。單向方差分析采用SAS 8.0軟件開展，<0.01為檢測顯著性標記的閾值。完備復合區(qū)間作圖法利用IciMapping 4.1軟件計算[20]，LOD值大于2.0作為QTL的閾值。

2 結 果

2.1 親本及BC1F1群體表型變異

在本研究中，兩個親本在CMV抗性上存在著顯著性差異（圖1）。

由圖2可見，親本臺煙8號的CMV發(fā)病率為60.24%，病情指數(shù)為14.67%；親本NC82的CMV發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為35.55%。對于BC1F1群體而言，不同株系間的CMV抗病性差異顯著，表現(xiàn)出連續(xù)變異。BC1F1群體內株系間發(fā)病率變幅從0到100%，平均值為82.29%；病情指數(shù)變幅從0到67.04%，平均值為23.74%。這些結果表明煙草CMV抗性受多基因控制，呈現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳特征。

2.2 基因型分析及遺傳圖譜構建

根據(jù)BINDLER等公布的信息，共合成2358對SSR標記，在親本間篩選有多態(tài)性的標記，共獲得76對清晰、易擴增、有多態(tài)性的SSR標記，多態(tài)率3.22%。利用有多態(tài)性的標記對200份BC1F1群體進行基因型分析，進而利用Joinmap 4.0軟件進行遺傳圖譜構建。本研究中構建的遺傳圖譜包含15個連鎖群，53個SSR標記，總的遺傳距離為489.08 cM。

2.3 CMV抗性位點發(fā)掘

本研究利用單標記方差分析和完備復合區(qū)間作圖法兩種方法進行了CMV抗性顯著位點發(fā)掘。如表1所示，利用單標記方差分析共檢測到5個與發(fā)病率顯著相關的標記，其中位于17號染色體32.25 cM的標記PT60665與發(fā)病率性狀極顯著相關（=8.21，=0.004?6）；同樣的，利用單標記方差分析檢測到5個與病情指數(shù)顯著相關的標記，其中標記PT60665和PT50891在發(fā)病率和病情指數(shù)兩種性狀中都可以檢測到顯著性。

注：左、中和右照片分別為臺煙8號、NC82和F1。

圖2 臺煙8號與NC82組合的BC1F1群體CMV抗性表型分布圖

表1 煙草CMV抗性顯著關聯(lián)位點單向方差分析

注：①遺傳位置來源于BINDLER 等公布的SSR遺傳圖譜。

Note：①Genetic position is based on the SSR genetic maps reported by BINDLE et al (2011).

利用完備區(qū)間作圖法，總共鑒定到5個QTL（表2）。其中定位到2個與發(fā)病率性狀相關的QTL，分別命名和。兩個QTL分別解釋了7.22%和5.71%的表型變異，來自于臺煙8號的等位基因型降低了發(fā)病率。定位到3個與病情指數(shù)相關的QTL，分別命名為、和。這3個QTL分別解釋了5.63%、5.36%和6.37%的表型變異，在這3個位點上來源于NC82的等位基因型增加了病情指數(shù)。

對比兩種性狀定位的QTL結果，在2號連鎖群33 cM附近和14號連鎖群端部存在著共同控制發(fā)病率和病情指數(shù)性狀的抗性位點（圖3）。

表2 煙草CMV抗性位點QTL定位結果

圖3 煙草CMV抗性QTL所在連鎖群位置

3 討 論

CMV可以侵染包括煙草在內的1200多種植物，是影響煙葉生產(chǎn)的最主要病毒之一。其抗性遺傳復雜，受多基因控制，易受環(huán)境影響，利用傳統(tǒng)的常規(guī)育種手段較難實現(xiàn)抗性改良。因此，利用分子標記技術發(fā)掘CMV抗性位點，鑒定與之緊密連鎖的分子標記，對于煙草抗CMV改良具有重要意義。在本研究中，利用單向方差分析方法分別定位到5個與發(fā)病率相關的標記和5個與病情指數(shù)相關的標記；利用完備區(qū)間作圖法定位到了2個與發(fā)病率相關的QTL（和）以及3個與病情指數(shù)相關的QTL（、和）。比較不同定位方法發(fā)現(xiàn)，標記PT60665與CMV發(fā)病率和病情指數(shù)顯著相關，用兩種定位方法都可以檢測到，因此該標記與CMV抗性顯著關聯(lián)，在今后的CMV抗性分子標記輔助改良中具有一定利用價值。

另外，植物體在抵抗病原菌侵染時，其抗性分為抗侵入、抗擴展和耐病等不同機制。發(fā)病率性狀反映了植物對病原菌的抗侵入能力，而病情指數(shù)性狀則是植物體對病原菌抗侵入、抗擴展和耐病等抗性機制的綜合體現(xiàn)。對比兩種性狀的定位結果，不同抗性位點表現(xiàn)出不同的抗性機制：在2號連鎖群（和）和14號連鎖群（和）上的抗性位點可能與煙草抗CMV侵入有關，而4號連鎖群體上的位點則表現(xiàn)出抗擴展或者耐病等抗性機制。因此，在今后的CMV抗性育種中，利用分子標記技術，盡可能的將控制相同抗性類型的不同等位基因以及控制不同抗性類型的不同等位基因聚合到主栽煙草品種中去是一個有效的育種策略。

本研究中利用的親本臺煙8號由T.I.245與品種Hicks雜交回交后，結合抗病性篩選出的高抗CMV品種，是重要的烤煙CMV抗源，其CMV抗性應該是來源于種質T.I.245。如前所述，經(jīng)典遺傳學研究表明煙草CMV抗性受5個基因控制，其中和兩個隱性基因來源于煙草種質T.I.245。本研究利用臺煙8號為輪回親本配置BC1F1群體，就是為了更有效的檢測來源于T.I.245的兩個隱性抗病位點。本研究定位結果也表明，在2號連鎖群（和）和14號連鎖群（和）分別定位到兩個與CMV抗性顯著關聯(lián)的位點，因此，在本研究中定位到的兩個QTL可能就是來源于煙草種質T.I.245的兩個經(jīng)典隱性基因和。因此，接下來的工作將會圍繞著這兩個隱性抗性位點開展進一步精細定位和克隆。

普通煙草是典型的異源四倍體，基因組大小4.5 Gb左右，比其他大多數(shù)作物龐大而復雜[21]。同時，普通煙草尤其是烤煙育種歷史較短，育種目標單一，這導致了在不同煙草品種間的遺傳多樣性低，這些因素在很大程度上限制了煙草遺傳圖譜構建和重要性狀遺傳位點定位的研究。本研究合成了2358對SSR標記，但是在臺煙8號和NC82兩個烤煙品種間可用的多態(tài)性標記只有76個，多態(tài)性只有3.22%。因此，目前SSR等二代分子標記很難滿足煙草重要性狀遺傳和全基因組QTL定位研究。隨著測序成本的降低以及檢測平臺的不斷優(yōu)化，三代標記SNP標記已經(jīng)越來越多的在動植物遺傳圖譜構建、重要性狀定位和克隆以及遺傳多樣性分析等領域利用[22-24]。利用由中國煙草總公司鄭州煙草研究院牽頭搭建的煙草430 K SNP芯片平臺或簡化重測序技術，構建高密度遺傳圖譜，在不同環(huán)境條件下全基因組掃描與CMV抗性相關的位點，是今后需要優(yōu)先開展的研究方向。

4 結 論

利用SSR標記和回交群體對煙草CMV的抗性進行了QTL分析，發(fā)掘了5個與煙草CMV抗性相關的QTL。相關定位結果為明確煙草CMV抗性遺傳基礎和開展煙草分子標記輔助改良奠定了一定基礎。

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Identification of QTL Associated with Resistance to Cucumber Mosaic Virus in Tobacco

CHENG Lirui1, CHEN Xiaocui1,2, DAI Shuaishuai1, MA Bing1, REN Min1, JIANG Caihong1, LIU Dan1, WEN Liuying1, YANG Aiguo1*

(1. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Zunyi Academy of Agricultural Sciences, Zunyi, Guizhou 563006, China)

Cucumber mosaic virus (CMV) is one of the most serious diseases affecting tobacco (L.). It is an effective way to prevent CMV by mining, identification and utilization of resistant genes. In this study, a BC1F1 population was constructed from a cross between recurrent parent Taiyan8 and donor parent NC82. Based on this population, 50 plants generated from each BC1F1 individual using tissue culture method were evaluated for resistance to CMV. Furthermore, QTLs associated with resistance to CMV were identified by one-way ANOVA and Inclusive Composite Interval Mapping (ICIM) methods. The results showed that 5 significant markers for incidence of disease (ID) and disease Index (DI) were found using one-way ANOVA analysis. Meanwhile, 5 QTLs were detected by ICIM method. Among them, 2 QTLs were related with ID and 3 were related with DI. These results add to our understanding of the inheritance of resistance to CMV and provide information for marker assisted breeding for improvement of resistance to CMV in tobacco.

tobacco; cucumber mosaic virus; quantitative trait loci

S572.03

1007-5119（2018）04-0001-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2018.04.001

中國煙草總公司煙草基因組計劃重大專項“煙草抗CMV 和赤星病連鎖分子標記開發(fā)及NC82、K326 品種抗性改良”（110201301009（JY-09）；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程“煙草遺傳育種”（ASTIP-TRIC01）；中國煙草總公司煙草科技重點項目“煙草多親本高世代互交系構建及抗真菌性病害烤煙新品種培育”（110201502012）

程立銳（1979-），男，博士，副研究員，研究方向：煙草分子育種。E-mail：chenglirui@caas.cn。

，E-mail：yangaiguo@caas.cn

2018-01-14

2018-05-08