張 齊,閻怡竹，劉清清,李 聰,申燁華,鄧建軍

(1.西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710069;2.西北大學(xué) 化工學(xué)院,陜西 西安 710069；3.西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710069)

文冠果(XanthocerasSorbifoliaB.)別名木瓜、文官果、文登閣等[1],系無(wú)患子科文冠果屬[2],是中國(guó)特有的珍稀木本油料植物,分布在山西、陜西、甘肅、吉林、內(nèi)蒙古等14個(gè)省份,有著“北方油茶”的美譽(yù)[3]。文冠果種仁中油(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為59.86%,其中不飽和脂肪酸高達(dá)9.00%(體積分?jǐn)?shù))[4],具有降低膽固醇、軟化血管等藥用價(jià)值[5];蛋白質(zhì)占比25.75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),有18種氨基酸,必需氨基酸種類齊全,且氨基酸評(píng)分較高,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。文冠果種仁主要應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)[2],然而,加工后的種粕除了部分用于飼料加工外,大多數(shù)被丟棄,不僅造成了資源的極大浪費(fèi),也會(huì)造成一定的環(huán)境污染[4]。文冠果蛋白本身具有良好的加工性能,可作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)來(lái)源,添加在食品生產(chǎn)中。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于文冠果種仁蛋白的研究多在蛋白組分相關(guān)方面,對(duì)于其深加工產(chǎn)品的研究十分有限。

高血壓一種全球性的公共健康問(wèn)題,可誘發(fā)很多慢性疾病,如中風(fēng)、心梗、冠心病等[7]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)是一種含鋅二肽羧肽酶,對(duì)人體血壓有重要的調(diào)控作用[8]。ACE抑制肽俗稱降血壓肽,是一類從食源性蛋白質(zhì)中分離得到的具有降高血壓活性的多肽[9],一般只含有2～20個(gè)氨基酸殘基[10],可以快速地通過(guò)消化黏膜進(jìn)入血液循環(huán)[11]。ACE抑制肽可與ACE兩個(gè)活動(dòng)功能區(qū)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,抑制ACE活性,抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II,從而起到降壓作用[9]。從食源蛋白質(zhì)中得到的降血壓肽因其食用安全性高已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[12]。目前已經(jīng)從紅松仁[11]、蘑菇[13]、榛果[14]、高粱[15]、羅非魚[16]、牛乳[17]、大豆[18]、牡蠣[19]等食品的蛋白酶解產(chǎn)物中分離出ACE抑制肽。

本文采用酶解法對(duì)脫脂文冠果蛋白進(jìn)行酶解,以水解度為指標(biāo)優(yōu)化酶解工藝,同時(shí),對(duì)文冠果多肽的體外抗高血壓活性進(jìn)行研究,不僅豐富了文冠果副產(chǎn)品的深加工,也為文冠果功能性多肽的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文冠果購(gòu)于萬(wàn)順?lè)N業(yè)有限公司。

木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶，西安浩天有限公司;ACE、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)，美國(guó)Sigma公司;牛血清蛋白(純度≥99%的分析純)，美國(guó)Ameresco公司;電泳蛋白質(zhì)Marker，重慶科潤(rùn)生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司;電泳試劑，美國(guó)Usbiological公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾杯，美國(guó)Millipore公司;透析袋(3500 Da)，奧豪斯儀器(上海)有限公司;超濾膜(1kDa和5 kDa)，OHAOS儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A、恒溫振蕩器SHA-B，上海亞榮生化儀器廠;冷凍干燥機(jī)LGJ-FD-1，宇輝儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)UV-1780，日本島津;高速低溫冷凍離心機(jī)TGL-206R，上海安亭科學(xué)儀器廠;臺(tái)式電熱恒溫干燥箱WHL-25A，天津市泰斯特儀器有限公司;蛋白質(zhì)電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1 文冠果種仁的基本成分分析 水分的測(cè)定方法參照GB5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》，灰分的測(cè)定方法參照GB5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》，粗脂肪的測(cè)定方法參照GB5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》，蛋白質(zhì)的測(cè)定方法參照GB5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.2 文冠果種仁蛋白的制備 文冠果去殼—粉碎—正己烷旋蒸去油—油渣風(fēng)干后稱取80g溶于800mL磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline, PBS 0.1MpH7.4)—懸濁液過(guò)濾后,得種仁蛋白溶液—分段鹽析(硫酸銨飽和度:0～20%，20～40%，40～60%，60～80%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))—取沉淀,用少量PBS溶解—透析(48 h)—冷凍干燥—蛋白粉。

1.3.3 文冠果多肽的制備 蛋白粉用蒸餾水溶解(底物質(zhì)量濃度為40 g/L)—80℃恒溫震蕩10 min—冷卻到室溫—調(diào)節(jié)pH 9.0—加入適量酶—恒溫震蕩一段時(shí)間(保持pH 9.0)—90℃滅酶10 min,立即冷卻—4000 r/min冷凍離心15 min—取上清液抽濾—超濾(5 kDa和1 kDa)—冷凍干燥—多肽粉。

1.3.4 酶解工藝優(yōu)化 加酶量4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),酶解時(shí)間2 h,其他條件同1.3.3,選用中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶,考察酶的種類對(duì)水解度的影響;堿性蛋白酶,酶解時(shí)間2 h,其他條件同1.3.3,加酶量分別為4%，6%，8%，10%，12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),考察加酶量對(duì)水解度的影響;堿性蛋白酶、加酶量8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),其他條件同1.3.3,酶解時(shí)間分別為25，50，75，100，125，150，175，200 min,考察酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響。

1.3.5 水解度的測(cè)定 參照Adler-Nissen[20]的方法,采用pH-stat法計(jì)算水解度,在水解過(guò)程中,pH值穩(wěn)定在9.0,記錄加入堿液的體積。水解度計(jì)算公式如下:

DH/%=(B×Nb)/(htot×Mp×α)×100

(1)

式中:B為耗堿體積,mL;Nb為堿液濃度,mol/L;α為氨基平均解離度;Mp為蛋白質(zhì)量,g;htot為底物蛋白總肽鍵數(shù),mmol/g。

1.3.6 體外ACE抑制率的測(cè)定 參照Cushman[21]的方法,并稍作修改。HHL在ACE的催化下快速分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽His-Leu。當(dāng)加入酶解液,ACE活性受到抑制,馬尿酸和二肽的生成量減少,而在228nm處,乙酸乙酯對(duì)馬尿酸有特征吸收,可以通過(guò)測(cè)定馬尿酸的生成量評(píng)價(jià)ACE抑制率。取酶解液,對(duì)其ACE抑制活性進(jìn)行測(cè)定。依次于試管中加入5 mmol/L HHL溶液200 μL酶解液100 μL,在37℃恒溫水浴中預(yù)熱10 min,然后加入20 μL ACE(酶活為0.1 U/mL)啟動(dòng)反應(yīng),在37℃恒溫水浴30 min,加入300 μL 鹽酸(1.0 mol/L HCl) 終止反應(yīng),加入1.5 mL乙酸乙酯,混合均勻后離心(4 000 r/min,10 min)取上層乙酸乙酯1.0 mL移于另一個(gè)試管,在120℃烘箱中烘干,取出試管后冷卻到室溫,加入3.0 mL蒸餾水,在228 nm處測(cè)定吸光值,ACE抑制率計(jì)算公式如下:

ACE/%=(A-B)/(A-C)×100

(2)

式中:A為樣品用硼酸;B為樣品酶解液;C為反應(yīng)前加入HCl。

1.3.7 蛋白濃度的測(cè)定 參照Bradford[22]的方法,并稍作修改,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。精確稱取牛血清蛋白10 mg,溶于10 mL蒸餾水中,稀釋為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,取100 μL蛋白溶液,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液,立即旋渦混勻,5 min后,在595nm處測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE) 采用5%的濃縮膠、20%的分離膠,對(duì)0～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分段鹽析出的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,開始選擇恒壓80 V,待條帶跑到分離膠下端,調(diào)節(jié)電壓120 V直至電泳結(jié)束。染色40min后,脫色24 h,凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2015軟件處理數(shù)據(jù)。采用SPSS 20.0軟件(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)進(jìn)行單因素方差分析(p<0.05)所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果種仁的基本成分分析

對(duì)文冠果種仁中水分、灰分、蛋白質(zhì)及粗脂肪含量分析如表1所示,其中粗脂肪和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,分別為60.9%和21.8%。結(jié)果表明:文冠果種仁富含脂肪和蛋白質(zhì),可作為油脂和植物蛋白開發(fā)的理想原料。這與張東[23]在文冠果油脂肪酸、甘油三酯組成及其相關(guān)性分析研究和阮瑜琳[24]在水酶法同時(shí)提取文冠果油及蛋白質(zhì)的研究中的結(jié)果一致。

表1 文冠果種仁的化學(xué)成分Tab.1 The chemical constituents of Xanthocerassorbofolia Bunge seed

2.2 文冠果種仁蛋白的制備

為了得到文冠果蛋白水解肽,首先采用飽和硫酸銨鹽析法制備了蛋白原料,所用的飽和硫酸銨濃度為0～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。對(duì)透析后的4個(gè)區(qū)段的文冠果種仁蛋白電泳行為進(jìn)行分析,SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示。結(jié)果表明:不同區(qū)段的蛋白質(zhì)種類和組成存在較為明顯的差異。在4個(gè)區(qū)段中60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白質(zhì)組成最為豐富,主要由9條譜帶構(gòu)成(Mr分別約為63，55，43，40，36，34，26，22和6～13 kDa);80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白質(zhì)主要由5條譜帶構(gòu)成(Mr分別約為55，40，26，17和1～10kDa);40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白質(zhì)主要由5條譜帶構(gòu)成(Mr分別約為55，40，24，22和8～13kDa);20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白質(zhì)主要由4條譜帶構(gòu)成,相比40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白少了24kDa1條譜帶。比較4個(gè)區(qū)段,還可以看出:3條譜帶(Mr分別約為55，40和10 kDa)是4個(gè)區(qū)段共有的,但同一種蛋白質(zhì)在不同區(qū)段中的含量是不同的(如55 kDa的蛋白質(zhì)在80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))區(qū)段中含量最高)。另外,60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白的22 kDa和80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽析蛋白的10 kDa兩處條帶清晰,未來(lái)可以對(duì)這兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定,確定分離純化的片段。

泳道M:Marker; 泳道1-4:分別為飽和硫酸銨濃度為0～20%,20%～40%,40%～60%，60%～80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蛋白譜帶圖1 文冠果蛋白質(zhì)分子量分布電泳圖Fig.1 The protein molecular weight distribution electrophoresis of Xanthoceras sorbifolia bunge

2.3 酶解工藝優(yōu)化

將上述各區(qū)段飽和硫酸銨濃度下收集的蛋白冷凍干燥后進(jìn)行酶解,以水解度為考察指標(biāo),對(duì)其制備工藝參數(shù)進(jìn)行單因素優(yōu)化,探究酶的種類、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響。pH值改變能影響酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度,同時(shí)影響底物和輔酶的解離程度,從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化作用[25],選取酶解pH為9.0,此時(shí)文冠果蛋白的溶解度良好,而且四種酶都未失活。酶解溫度適當(dāng),可以加快酶促反應(yīng)的進(jìn)行,溫度過(guò)高,會(huì)導(dǎo)致酶活性減弱[26],選取酶解溫度55℃。

2.3.1 酶的種類對(duì)水解度的影響 在底物質(zhì)量濃度40 g/L、加酶量4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酶解pH9.0、溫度55℃和時(shí)間2h的條件下,比較了中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶4種酶對(duì)文冠果蛋白的酶解效率。結(jié)果表明:堿性蛋白酶的水解效果最好,水解度達(dá)到18.21%;復(fù)合蛋白酶次之，水解度為13.79%。相比之下,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度顯著降低,分別為8.34%和6.96%。酶解pH 9.0時(shí)堿性蛋白酶的活性高于其他3種酶,水解更徹底。因此,選擇堿性蛋白酶作為酶解用酶。

圖2 酶的種類對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of different proteases on degree of hydrolysis

2.3.2 加酶量對(duì)水解度的影響 在底物質(zhì)量濃度40 g/L、堿性蛋白酶、酶解pH9.0、溫度55℃和時(shí)間2h的條件下,比較了加酶量對(duì)文冠果蛋白的酶解效率。結(jié)果表明:隨著酶量的增加,水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。加酶量在4%～6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),大量蛋白質(zhì)分子快速地被水解為小分子多肽,水解度由10.04%增加至17.12%;加酶量在6%～8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),反應(yīng)體系中酶濃度增大,底物與酶的結(jié)合達(dá)到飽和,水解度上升極為緩慢,加酶量為8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),水解度達(dá)到最大值為18.26%;繼續(xù)加大酶量,導(dǎo)致酶濃度過(guò)大不利于蛋白的水解,水解度反而下降。因此,加酶量選擇8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖3 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of the enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)水解時(shí)間的影響 在底物質(zhì)量濃度40 g/L、加酶量8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(堿性蛋白酶)、酶解pH9.0和溫度55℃的條件下,比較了酶解時(shí)間對(duì)文冠果蛋白的酶解效率。結(jié)果表明:隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),水解度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在25～100 min內(nèi),水解度上升極為迅速。由于酶可作用的肽鍵逐漸減少,酶催化反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài),175 min后水解度已趨于平穩(wěn)。繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間,浪費(fèi)資源且水解度不會(huì)大幅上升。因此,酶解時(shí)間選擇175 min。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of the enzymatic time on degree of hydrolysis

2.4 文冠果體外ACE抑制肽的活性研究

在底物質(zhì)量濃度40 g/L、酶解pH 9.0、溫度55℃、加酶量8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(堿性蛋白酶)和時(shí)間175 min的條件下,酶解文冠果種仁蛋白,得到的酶解液經(jīng)超濾劃分成3個(gè)肽段:<1 kDa，1～5 kDa和>5kDa,測(cè)定3個(gè)組分肽段的ACE抑制率。結(jié)果表明:3個(gè)組分都具有一定的ACE抑制活性,其中< 1kDa組分的ACE抑制活性最高為83.43%,<1 kDa的多肽存在具有高ACE抑制活性的肽片段,因此,選擇<1 kDa的多肽進(jìn)一步分離純化。

圖5 不同肽段的ACE抑制率Fig.5 ACE inhibitory rate of different peptides

選用< 1kDa的文冠果多肽,探究多肽濃度與ACE抑制率的依賴關(guān)系。結(jié)果表明:多肽濃度在0.2～1.0 mg/mL時(shí),ACE抑制率隨著多肽濃度的增大而升高,二者呈劑量依賴關(guān)系。多肽濃度愈高,存在的具有ACE抑制活性的片段愈多,對(duì)ACE的抑制效果越強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算,文冠果多肽的IC50為0.394mg/mL。

圖6 不同濃度的多肽的ACE抑制率Fig.6 The ACE inhibition rate of different concentration of polypeptide

3 結(jié) 論

本文采用鹽析法提取文冠果蛋白,以水解度為指標(biāo),優(yōu)化酶解工藝,最優(yōu)條件為:底物質(zhì)量濃度為40 g/L、酶解pH 9.0、酶解溫度55℃、加酶量8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(堿性蛋白酶)和酶解時(shí)間175 min,此條件下水解度最佳,可達(dá)22.97%。采用酶解法制備文冠果多肽,<5kDa的多肽回收率可達(dá)75%,其中<1kDa的多肽具有高的體外抗高血壓活性,ACE抑制率可達(dá)83.43%,IC50為0.394 mg/mL?？梢赃M(jìn)一步對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行分離純化,并配合多種光譜學(xué)技術(shù)對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)的表征研究。