曹?chē)?guó)秀，陸文捷，葉 慧，田 揚(yáng)，郝海平

(中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

銀杏葉(GinkgoBilobaLinn.)提取物成分復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)的有160多種，研究證實(shí)其有效成分主要為銀杏黃酮類(lèi)和銀杏萜內(nèi)酯類(lèi)化合物[1-2]。銀杏黃酮類(lèi)化合物主要是由槲皮素、山柰酚和異鼠李素等黃酮苷元及其與葡萄糖或鼠李糖等單糖連接的糖苷組成，主要表現(xiàn)為清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[3-5]。銀杏萜內(nèi)酯化合物主要包括二萜類(lèi)和倍半萜類(lèi)，其中，二萜類(lèi)主要包括銀杏內(nèi)酯A、B、C等，倍半萜主要為白果內(nèi)酯。銀杏內(nèi)酯是選擇性的血小板活化因子拮抗劑，具有治療阿爾茲海默病的輔助作用，表現(xiàn)出一定的腦保護(hù)作用，而白果內(nèi)酯可以抑制GABA受體[6-8]。

目前關(guān)于銀杏葉提取物的提取方法根據(jù)提取溶劑的不同主要有3種：(1)國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的銀杏提取物系按Schwabe專(zhuān)利工藝生產(chǎn)的銀杏葉提取物，銀杏葉以丙酮/水提取制成提取物，主要制劑是德國(guó)生產(chǎn)的銀杏葉提取物片。(2)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)上的銀杏葉提取物(全提取物)是以乙醇/水加熱回流提取，銀杏葉滴丸制劑則是根據(jù)我國(guó)藥典的提取方法生產(chǎn)制備的。(3)銀杏酮酯是我國(guó)自主研發(fā)的一種新的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物，是將銀杏葉中的主要組成成分(銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮)高度富集的提取物，銀杏酮酯滴丸則是該標(biāo)準(zhǔn)提取物的代表制劑[9-10]。銀杏葉制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)為銀杏黃酮高于24%，銀杏內(nèi)酯高于6%，對(duì)其他可能的有效成分未進(jìn)行含量規(guī)定，上述主要的3種制劑盡管都滿足質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但其他成分的相對(duì)含量則有較大的差別，因此對(duì)其差異成分的研究則尤為重要[11-13]。

代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)于大量樣品組間差異的研究具有極大優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)⒃嫉姆从硺悠沸畔⒌膹?fù)雜數(shù)據(jù)(比如HPLC/MS數(shù)據(jù)，GC/MS數(shù)據(jù)和NMR數(shù)據(jù)等)經(jīng)過(guò)一系列的降維處理，篩選出能夠反映復(fù)雜數(shù)據(jù)主要信息的簡(jiǎn)單維度的成分[14]。常用的的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析技術(shù)有主成分分析(PCA)，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和聚類(lèi)分析等。PLS-DA利用降維的思想，把多指標(biāo)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)(即主成分)可以表征的數(shù)據(jù)。因此，在大量原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生的復(fù)雜模型中無(wú)法直觀發(fā)現(xiàn)樣品組間差異時(shí)，則可以利用PLS-DA分析，通過(guò)一系列的降維分析，利用最小二乘法原理找到樣品間的最大差異。

因此，本研究建立了適用于銀杏葉制劑復(fù)雜成分分析和鑒定的色譜質(zhì)譜條件，通過(guò)高分辨質(zhì)譜進(jìn)行中藥成分的全掃描分析，結(jié)合偏最小二乘判別分析策略進(jìn)行差異化合物的篩選，并且將精確的質(zhì)荷比及二級(jí)質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫(kù)或參考文獻(xiàn)進(jìn)行匹配，完成化合物的鑒定。本研究中一共鑒定了21種銀杏葉提取物片與銀杏葉滴丸的差異成分，其中銀杏葉滴丸中含量大于銀杏葉提取物片的有7種，主要是黃烷醇類(lèi)化合物，銀杏葉提取物片中含量大于銀杏葉滴丸的有14種，多數(shù)是有機(jī)酸類(lèi)化合物。進(jìn)一步鑒定了銀杏葉滴丸與酮酯滴丸的12種差異成分，其中銀杏葉滴丸中含量大于酮酯滴丸的有7種，主要是黃烷醇類(lèi)化合物，酮酯滴丸中含量大于銀杏葉滴丸的有5種，主要是金松雙黃酮和有機(jī)酸類(lèi)。該研究為闡明銀杏葉制劑的差異物質(zhì)組研究提供依據(jù)，為建立更合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及進(jìn)一步闡明各銀杏葉制劑之間的藥效差異提供借鑒。

1 材 料

1.1 儀 器

Triple TOF 5600(美國(guó)AB SCIEX公司)配有島津高效液相儀(日本Shimadzu公司)，Analyst 1.6.1工作站，CBM-20A系統(tǒng)控制器，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AB二元泵，CTO-20AC柱溫箱，DGU-20A5型在線脫氣機(jī)。Milli-Q Gradient A10超純水器(美國(guó)Millipore公司)；IEC低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Savant SPD 2010離心濃縮裝置(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

銀杏葉滴丸(浙江萬(wàn)邦德制藥有限公司)；銀杏酮酯滴丸(浙江九旭藥業(yè)有限公司)；銀杏葉提取物片(德國(guó)威瑪舒培博士藥廠)。東莨菪內(nèi)酯(純度>98%，成都普菲德生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)室用水均由Milli-Q Gradient A10超純水器制備；甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?德國(guó)默克集團(tuán))。

2 方 法

2.1 樣品前處理方法

儲(chǔ)備液的制備：銀杏葉滴丸(每丸相當(dāng)于銀杏葉提取物16 mg)，取10丸，稱重后研磨，計(jì)算滴丸重量的平均值，稱量相當(dāng)于0.625丸的重量(相當(dāng)于銀杏提取物10 mg)，用含10 μg/mL內(nèi)標(biāo)(東莨菪內(nèi)酯)的甲醇稀釋成1 mg/mL的溶液(n=5)；銀杏酮酯滴丸(每丸相當(dāng)于銀杏提取物10 mg)，取10丸，稱重后研磨，計(jì)算平均值，稱量相當(dāng)于一丸的重量(相當(dāng)于銀杏提取物10 mg)，用含10 μg/mL內(nèi)標(biāo)(東莨菪內(nèi)酯)的甲醇稀釋成1 mg/mL的溶液(n=5)；銀杏葉提取物片劑(每片含有銀杏提取物40 mg)，取5片，稱重后研磨，稱量相當(dāng)于0.25片的重量(相當(dāng)于銀杏提取物10 mg)，用含10 μg/mL內(nèi)標(biāo)(東莨菪內(nèi)酯)的甲醇稀釋成1 mg/mL的溶液(n=5)。以上溶液超聲1 h，靜置10 min，18 000 r/min離心10 min后，取上清液于EP管中作為儲(chǔ)備液備用。進(jìn)樣時(shí)，取儲(chǔ)備液50 μL，加入甲醇450 μL，18 000 r/min離心10 min，離心2次后，取上清液準(zhǔn)備進(jìn)樣。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為XSELECT HSS T3柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)，流動(dòng)相：水相為含有0.1%甲酸的水溶液，有機(jī)相為乙腈，流速為0.7 mL/min，柱溫為40 ℃。采用梯度洗脫方式進(jìn)行色譜分離，梯度洗脫的條件：0～3 min,5%B；3～4 min,5%～30% B；4～12 min,30%～60% B；12～13 min,60%～95%B；13～15 min,95%B；15～16 min,95%～5%B；16～20 min,5%B。

質(zhì)譜檢測(cè)方法：ESI離子源，負(fù)離子模式檢測(cè)，質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～1 000，離子噴霧電壓設(shè)定為-4.5 kV，噴霧溫度設(shè)定為550 ℃，霧化氣、輔助氣和氣簾氣均為氮?dú)猓謩e設(shè)定為50，50，30 psi(1 psi=6.895 Pa)。TOF-MS掃描時(shí)去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)分別設(shè)為-100和-10 V。進(jìn)行MS/MS碎裂時(shí)，去簇電壓和碰撞能量分別設(shè)為-100和-30 V。進(jìn)樣過(guò)程中精確相對(duì)分子量的校準(zhǔn)采用EasyMass Accuracy裝置。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將質(zhì)譜分析所得的Wiff格式的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入配套的MarkerView(美國(guó)AB SCIEX公司)工作站中，對(duì)色譜峰進(jìn)行對(duì)齊，將各批次所得數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，軟件將自動(dòng)運(yùn)行并產(chǎn)生一個(gè)包含前體離子(m/z)，保留時(shí)間和峰面積的矩陣。將產(chǎn)生的多元數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P(瑞典Umetrics公司)中進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，選出變量重要性因子(VIP)>1的候選化合物，這些候選化合物都通過(guò)提取其離子色譜峰并手動(dòng)檢查后，剔除掉可能的加合峰、二聚體、同位素峰等假陽(yáng)性結(jié)果。隨后對(duì)其進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，挑選出P<0.05的有顯著性差異的化合物。將化合物的精確質(zhì)荷比導(dǎo)入PeakView(美國(guó)AB SCIEX公司)軟件中計(jì)算出可能的化學(xué)分子式，并且根據(jù)二級(jí)碎片信息與ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.chemspider.com/)以及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)篩選出的差異化合物進(jìn)行鑒定。根據(jù)差異化合物的精確質(zhì)荷比以及保留時(shí)間信息，應(yīng)用MultiQuant(美國(guó)AB SCIEX公司)軟件，對(duì)這些化合物在不同制劑中的含量進(jìn)行相對(duì)定量。

3 結(jié) 果

3.1 銀杏葉制劑色譜質(zhì)譜分析

將3種銀杏產(chǎn)品按照上述樣品處理方法進(jìn)行前處理后，通過(guò)HPLC-Q/TOF-MS分析，所獲取的負(fù)離子模式下總離子流圖見(jiàn)圖1-A，其總離子流圖表明3種銀杏葉制劑中多數(shù)成分是相同的，但是有少數(shù)成分的含量存在顯著差異。將所得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰對(duì)齊，峰面積數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)歸一化后，產(chǎn)生一個(gè)包含前體離子(m/z)，保留時(shí)間和峰面積的矩陣。剔除該矩陣中可能的加合峰、二聚體、同位素峰等假陽(yáng)性結(jié)果。根據(jù)矩陣中的質(zhì)荷比以及保留時(shí)間對(duì)這些化合物在不同制劑中的含量進(jìn)行相對(duì)定量，根據(jù)定量結(jié)果，分析不同制劑組成成分的相對(duì)含量，如圖1-B，同一制劑的組內(nèi)分析結(jié)果表明樣品的重復(fù)性較好，不同制劑間的熱圖分析進(jìn)一步表明3種制劑的組成成分具有顯著差異，對(duì)這些差異成分進(jìn)行鑒定則對(duì)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究具有重要意義。

Figure1 Qualitative and quantitative analysis of threeGinkgobilobapreparations based on HPLC-Q/TOF-MS

A：Total ion chromatograms of threeGinkgobilobapreparations；B：Heatmap illustrates distinct compositions of herbal compounds in threeGinkgobilobapreparations (n=5)

DW：YinxingyeDiwan;JND:Extract of Ginkgo biloba leaves tablets;TZ:YinxingtongzhiDiwan

3.2 基于代謝組學(xué)技術(shù)的銀杏葉制劑差異成分的篩選及鑒定

銀杏葉滴丸是按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定的提取溶劑(醇/水體系)進(jìn)行提取的，但目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)提取物和按照德國(guó)專(zhuān)利生產(chǎn)制備的銀杏葉提取物片劑的成分差異，因此研究首先考察了銀杏葉滴丸和銀杏葉提取物片劑這兩種制劑的差異成分。銀杏酮酯滴丸是在醇/水體系提取的基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的產(chǎn)品，因此比較銀杏酮酯滴丸和銀杏葉滴丸制劑的差異成分，考察同一提取體系，方法改變后對(duì)組成成分含量的影響。

差異成分篩選時(shí)采用了PLS-DA分析策略，利用專(zhuān)門(mén)的軟件將多維的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維成由幾個(gè)簡(jiǎn)單維度組成的數(shù)據(jù)模型，從而快速篩選復(fù)雜樣品組間的最大差異，減少了多指標(biāo)選擇的工作量。組間差異的篩選是根據(jù)少數(shù)幾個(gè)主成分來(lái)判定的，但是這幾個(gè)簡(jiǎn)單的指標(biāo)可以保留絕大部分原始數(shù)據(jù)的信息，在保持信息準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上減少計(jì)算工作量。因此，研究中采用了PLS-DA分析方法，評(píng)價(jià)銀杏葉滴丸和銀杏葉提取物片劑、銀杏葉滴丸和銀杏酮酯滴丸制劑的組間差異成分，客觀而合理地篩選出反映兩種制劑間差異的主成分。

3.2.1 銀杏葉滴丸與銀杏葉提取物片制劑的比較 考察銀杏葉滴丸與銀杏葉提取物片兩種制劑的成分差異，將包含前體離子(m/z)和峰面積的矩陣導(dǎo)入SIMCA-P中進(jìn)行PLS-DA分析(R2X:0.974,R2Y:0.990,Q2:0.986,R2Y接近于1，表明模型擬合可靠)。如圖2-A所示，銀杏葉滴丸與銀杏葉提取物片兩種制劑成分分析的得分圖，從得分圖可以觀察樣品的聚集以及離散程度，即樣品分布點(diǎn)越聚集則說(shuō)明這些樣品中所含有的成分組成及含量越接近，反之樣品點(diǎn)較為離散時(shí)則說(shuō)明組成成分及含量在制劑之間差異較大。該得分圖表明銀杏葉滴丸以及銀杏葉提取物片樣品在第一主成分得分上有明顯差異，在第二主成分上也具有一定的差異(橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)分別表示第一、第二主成分得分)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這兩組樣品分布在不同的區(qū)域，說(shuō)明樣品間具有明顯的組間差異，即這兩種制劑的組成成分以及成分含量具有明顯差異。對(duì)同一組的樣品點(diǎn)分析可以發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物片組內(nèi)的差異大于銀杏葉滴丸的組內(nèi)差異，提示進(jìn)樣的重復(fù)性良好。

Figure2 PLS-DA analysis of threeGinkgobilobapreparations.(A) The score plot of twoGinkgobilobapreparations (YinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets)；(B) The score plot of twoGinkgobilobapreparations (YinxingyeDiwanandYinxingtongzhiDiwan)

按照“2.3”項(xiàng)下的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后，對(duì)篩選出的差異化合物進(jìn)行鑒定。對(duì)篩選出的化合物的鑒定結(jié)果，精確質(zhì)荷比及保留時(shí)間等信息見(jiàn)表1。

Table1 Information of compounds that exhibit different abundance levels inYinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets

No.tR/minm/zFragment ionFormula IdentificationArea ratio (JND/DW)17.94137.02493.035C7H6O3p-Hydroxybenzoic acid74.1522.41173.046137.025C7H10O5Shikimic acid71.7538.05167.035153.026C8H8O4Vanillic acid28.8747.40153.021108.021C7H6O4Protocatechuic acid28.3957.94179.036135.045C9H8O4Caffeic acid11.5567.18204.031160.040C10H7NO46-Hydroxykynurenic acid7.3378.70163.041119.050C9H8O3p-Coumaric acid4.73810.27285.041243.030C15H10O6Luteolin3.8092.41191.05793.033C7H12O6Quinic acid3.35108.34353.085191.057C16H18O9Chlorogenic acid2.92117.85193.050178.026C10H10O4Ferulic acid2.78129.29301.036151.004C15H10O7Quercetin2.541310.86407.136389.126C20H24O9Ginkgolide A2.481411.96537.083375.051C30H18O10Amentoflavone2.451515.80579.130547.101C33H24O10Sciadopitysin0.471614.99565.115533.088C32H22O10Ginkgetin0.38172.43609.126305.066C30H26O14Prodelphinidin0.27187.30305.067219.066C15H14O7Gallocatechin0.251914.50283.062151.004C16H12O5Acactein0.24209.31317.031245.044C15H10O8Myricetin0.21217.59289.072245.081C15H14O6Catechin0.15

為了比較差異化合物在兩種制劑中的含量，對(duì)其代表性的差異化合物進(jìn)行色譜峰提取。比如，圖3-A和圖4-A分別是前體離子是173.046的化合物的提取離子流圖和該化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息，圖3-B和圖4-B分別是前體離子是137.024的化合物的提取離子流圖和該化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息，圖3-C和圖4-C分別是前體離子是289.070的化合物的提取離子流圖和該化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息。兩種制劑中3個(gè)典型差異化合物的提取離子流色譜圖的比較，進(jìn)一步表明了這些差異化合物在兩種制劑的含量是有差異的。進(jìn)一步對(duì)這些差異化合物進(jìn)行定量分析，根據(jù)所鑒定的化合物的質(zhì)荷比以及保留時(shí)間信息對(duì)這些化合物進(jìn)行相對(duì)定量，并計(jì)算這些化合物在兩種制劑中相對(duì)含量的比值，結(jié)果表明一共鑒定了21種差異成分，其中銀杏葉滴丸中含量大于銀杏葉提取物片的有7種化合物(圖5-A)，主要是黃烷醇類(lèi)化合物(包括兒茶素、沒(méi)食子兒茶素和前翠華素)；銀杏葉提取物片中含量大于銀杏葉滴丸的化合物有14個(gè)(圖5-B和5-C)，主要是兒茶素類(lèi)化合物。表1總結(jié)了銀杏葉提取物片與銀杏葉滴丸制劑的差異物質(zhì)及該物質(zhì)在兩種制劑中的相對(duì)定量的比值(“JND/DW”表示化合物在銀杏葉提取物片與銀杏葉滴丸中的相對(duì)含量的比值)。結(jié)果表明了銀杏葉提取物片和銀杏葉滴丸最明顯的差異物質(zhì)是有機(jī)酸類(lèi)化合物，其中對(duì)羥基苯甲酸和莽草酸在銀杏葉提取物片劑中的相對(duì)含量是銀杏葉滴丸制劑中的74倍，而且銀杏葉提取物片劑中含量高于銀杏葉滴丸制劑10倍以上的化合物均是有機(jī)酸類(lèi)化合物，而兒茶素和沒(méi)食子兒茶素在銀杏葉滴丸。

Figure3 Extraction ion chromatogram (XIC) of representative compounds that exhibit different abundance levels inYinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets

A:XIC of the precursor ion atm/z173.04 detected inYinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets;B:XIC of the precursor ion atm/z137.02 inYinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets；C:XIC of the precursor ion atm/z289.07 inYinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets

Figure4 Corresponding MS/MS mass spectrum of representative compounds that exhibit different abundance levels inYinxingyeDiwanand extract ofGinkgobilobaleaves tablets

A：MS/MS mass spectra of the precursor ion atm/z173.04;B:MS/MS mass spectra of the precursor ion atm/z137.02;C:MS/MS mass spectra of the precursor ion atm/z289.07

Figure5 Quantitative analysis of compounds that exhibit different abundance levels inYinxingyeDiwanand the extract ofGinkgobilobaleaves tablets

3.2.2 銀杏葉滴丸與銀杏酮酯滴丸制劑的比較 考察銀杏葉滴丸與酮酯滴丸的差異成分，比較提取方法純化后兩種制劑組成成分的差異，對(duì)兩種制劑進(jìn)行了PLS-DA分析(圖2-B，R2X:0.912，R2Y:0.998；Q2:0.994)，結(jié)果表明銀杏葉滴丸與銀杏酮酯滴丸存在成分含量的差異。篩選出VIP>1的候選化合物，按照上述方法對(duì)候選化合物進(jìn)行鑒定，這些差異化合物的鑒定信息在表2中進(jìn)行了總結(jié)。根據(jù)所鑒定的化合物的質(zhì)荷比以及保留時(shí)間對(duì)這些化合物進(jìn)行相對(duì)定量(“DW/TZ”表示化合物在銀杏葉滴丸與酮酯滴丸中相對(duì)含量的比值)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)鑒定出12種差異成分，其中銀杏葉滴丸中含量大于銀杏酮酯滴丸的有7種化合物(圖6-A)，主要是黃烷醇類(lèi)化合物(兒茶素、沒(méi)食子兒茶素和前翠華素)；銀杏酮酯滴丸中含量大于銀杏葉滴丸的有5種化合物，主要是金松雙黃酮和有機(jī)酸類(lèi)(圖6-B)。研究結(jié)果表明了銀杏酮酯滴丸與銀杏葉滴丸組成成分的相對(duì)含量存在顯著差異，說(shuō)明同樣的提取溶劑，經(jīng)過(guò)對(duì)銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯兩類(lèi)化合物進(jìn)行純化后，其他有效成分的含量也會(huì)發(fā)生改變。因此，為達(dá)到質(zhì)量控制以及統(tǒng)一藥效的目的，需要對(duì)其提取溶劑以及步驟進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)定。表2總結(jié)了銀杏葉滴丸與銀杏酮酯滴丸兩種制劑中的差異物質(zhì)及該物質(zhì)在兩種制劑中的相對(duì)含量的比值，莽草酸在銀杏葉滴丸中的含量是銀杏酮酯滴丸中的5倍左右，方法改變后莽草酸化合物的含量進(jìn)一步下降。上述研究表明了同一種提取溶劑下，其化合物的含量比值最高是5倍，而且差異化合物的種類(lèi)較多，如銀杏葉滴丸高于銀杏酮酯滴丸的化合物有有機(jī)酸類(lèi)、黃烷醇類(lèi)、黃酮醇類(lèi)等，而銀杏酮酯滴丸中含量高于銀杏葉滴丸的化合物有有機(jī)酸類(lèi)、銀杏內(nèi)酯類(lèi)。

(A) represents that compounds content were high inyinxingyeDiwan;(B) represents that compounds content were high inYinxingtongzhiDiwan

Table2Information of compounds that exhibit different abundance levels inYinxingyeDiwanandYinxingtongzhiDiwan

No.tR/minm/zFragment ionFormula IdentificationArea ratio (DW/TZ)12.41173.046137.024C7H10O5Shikimic acid4.9527.59289.072245.081C15H14O6Catechin4.5532.41191.05793.033 3C7H12O6Quinic acid3.6147.30305.067219.066C15H14O7Gallocatechin3.39511.44269.046151.004C15H10O5Apigenin3.30610.28285.042243.030C15H10O6Kaempferol2.7177.18204.031160.040C10H7NO46-Hydroxykynurenic acid2.53810.86407.136389.127C20H24O9Ginkgolide A0.4897.94137.02493.035C7H6O3p-Hydroxybenzoic acid0.32107.40153.021108.021C7H6O4Protocatechuic acid0.251115.80579.130547.101C33H24O10Sciadopitysin0.25127.94179.036135.045C9H8O4Caffeic acid0.16

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)首先建立了基于高分辨質(zhì)譜的銀杏葉制劑復(fù)雜成分的分析方法，結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析技術(shù)對(duì)銀杏葉滴丸、銀杏葉提取物片和銀杏酮酯滴丸制劑進(jìn)行差異化合物的篩選與鑒定。樣品組間差異成分的篩選中，尤其是具有復(fù)雜成分的中藥化合物的分析中，采用經(jīng)典的代謝組學(xué)技術(shù)(PLS-DA)能夠快速找到組間的最大差異。在銀杏葉滴丸與銀杏葉提取物片的差異成分研究中，共鑒定了21種差異化合物，相對(duì)定量分析說(shuō)明了銀杏葉滴丸與銀杏葉提取物片以有機(jī)酸類(lèi)化合物的含量差異最為顯著。

臨床上，銀杏葉制劑主要用于治療心血管疾病，如心絞痛等。盡管針對(duì)不同銀杏葉制劑的藥效差異研究仍是空白，但是有文獻(xiàn)表明咖啡酸等小分子有機(jī)酸類(lèi)化合物在抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的生理作用，黃烷醇類(lèi)化合物具有一定的抗氧化作用。因此，對(duì)于不同銀杏葉制劑的差異成分分析提示不同種類(lèi)產(chǎn)品存在潛在的藥效差異。

不同銀杏葉制劑差異成分可能來(lái)源于其生產(chǎn)工藝的不同。銀杏葉提取物片是根據(jù)德國(guó)專(zhuān)利生產(chǎn)的制劑，作為銀杏提取物的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其提取溶劑是丙酮/水體系，與《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定的醇/水體系不同。研究結(jié)果不同提取溶劑對(duì)有機(jī)酸類(lèi)化合物以及黃烷醇類(lèi)化合物的含量有顯著影響，即丙酮/水體系對(duì)有機(jī)酸類(lèi)化合物的提取效果好，而醇/水溶劑則對(duì)黃烷醇類(lèi)化合物的提取效率高。銀杏葉滴丸與銀杏酮酯滴丸的研究則表明了僅僅對(duì)于主要成分(銀杏黃酮與銀杏內(nèi)酯)進(jìn)行純化雖然會(huì)提高銀杏內(nèi)酯的含量，但是會(huì)影響其他可能的有效成分的相對(duì)含量，如進(jìn)一步降低有機(jī)酸類(lèi)(莽草酸等)化合物的含量。目前關(guān)于銀杏葉制劑的質(zhì)量控制僅僅是遵循“24+6”的原則，即銀杏黃酮的含量為24%，銀杏內(nèi)酯為6%，上述3種主要制劑均符合“24+6”的原則。但本實(shí)驗(yàn)表明，銀杏葉提取物片、銀杏葉滴丸及銀杏酮酯滴丸的其他組成成分的相對(duì)含量具有較大的差異，可通過(guò)加入有機(jī)酸類(lèi)成分來(lái)減少銀杏葉提取物片和銀杏滴丸的差異成分或者在提取劑中加入適量丙酮改善有機(jī)酸類(lèi)化合物的提取效率。因此，本研究為進(jìn)一步建立合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及藥效差異的闡明提供了指導(dǎo)意義。