巨曉軍，馬尹鵬，楊海明，王志躍

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚州 225125；2.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；3.揚州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚州 225009)

卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin, IgY)是種母雞被免疫后體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，能夠通過母雞的血液循環(huán)沉積在卵黃內(nèi)。當卵黃被雛雞吸收后，IgY隨其它營養(yǎng)物質(zhì)一起進入雛雞體內(nèi)，到7日齡時這部分抗體(IgY)才被雛雞自身產(chǎn)生的IgA取代，雛雞也逐漸建立起自己的免疫力[1]，因此IgY是雛雞主要的母源抗體，卵黃囊中IgY的轉(zhuǎn)移利用情況對雛雞的生長發(fā)育和健康狀況至關(guān)重要[2]。Sun等[3]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋雞對IgY有濃集作用，雞蛋卵黃中的抗體濃度高于血漿。IgY具有許多獨特的優(yōu)點和作用[4-8]，作為飼料添加劑對畜禽生產(chǎn)、免疫及疾病防治方面也有廣泛的應(yīng)用[9-11]，然而有關(guān)雛雞自身攜帶的母源IgY轉(zhuǎn)移和利用研究卻少有報道。以前的試驗研究中，只表明在雛雞卵黃囊和血清中存在IgY，并且僅僅是對雞胚或雛雞初生早期在卵黃囊或血清中IgY的含量變化進行研究[12-13]，雞胚血清中吸收的蛋白含量并不與卵黃中母源抗體下降的蛋白含量相等[13]，其它的母源抗體在機體中的分布情況很少有研究報道。本試驗主要研究了IgY在組織器官中的分布，并對不同日齡雛雞組織器官中IgY濃度和含量進行了比較。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；海蘭白種蛋購自儀征市大巷永康種雞場。

1.2 試驗設(shè)計

選取蛋重、蛋形指數(shù)基本一致的同日產(chǎn)海蘭白種蛋進行人工孵化，出雛后常規(guī)飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度1～3日齡為33～35 ℃、4～6日齡為32～33 ℃，24 h光照，正常飲水、開食。參照美國NRC(1994)營養(yǎng)需要并結(jié)合本品種實際情況配制粉狀開食配合飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。分別在出雛后1、2、3、4、5和6日齡隨機取20只公雛雞采血、屠宰，分離組織器官，稱重，測定IgY含量。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis)

注：①預(yù)混料為每千克飼糧提供:VA 11 000 IU,VD33 000 IU,VE 15 IU,VK320 mg,VB110 mg,VB230 mg,VB620 mg,VB120.2 mg,煙酸600 mg,泛酸180 mg,葉酸10 mg, 生物素 0.8 mg,膽堿7 mg, Fe(FeSO4)1.2 g, Cu (CuSO4)0.2 g, Mn (MnSO4)1.9 g, Zn(ZnSO4)1.8 g, I (KI) 10 mg, Se(Na2SeO3) 6 mg。②營養(yǎng)水平均為計算值。

Note: ①The premix was provided as follows per kg:VA 11 000 IU,VD33 000 IU,VE 15 IU,VK320 mg,VB110 mg,VB230 mg,VB620 mg,VB120.2 mg, nicotinic acid 600 mg, pantothenic acid 180 mg, folic acid 10 mg, biotin 0.8 mg, choline 7 mg, Fe (as ferrous sulfate)1.2 g, Cu (as copper sulfate)0.2 g, Mn (as manganese sulfate)1.9 g, Zn (as zinc sulfate)1.8 g, I (as potassium iodide) 10 mg, Se (as sodium selenium) 6 mg.②Nutrient levels were calculated values.

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 卵黃囊、肌胃、肝臟、腸道(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸)(去除腸道內(nèi)容物)、脾臟、胸腺和法氏囊。

1.3.2 樣品的處理 組織稱重，-20 ℃保存?zhèn)溆谩y定時將樣品按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例勻漿，將制備好的10%勻漿液2 500 r/min離心10～15 min，取上清液立即進行測定(稀釋過的上清液不可冷凍保存后再進行測定)。

心臟采血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測方法 使用雞IgY ELISA試劑盒檢測卵黃IgY水平，空白、標準品及每個樣品分別設(shè)置2個重復(fù)，用OD450吸收值的平均數(shù)作為衡量IgY水平的值。根據(jù)標準品IgY濃度及對應(yīng)OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品IgY濃度。

器官IgY含量=器官IgY濃度×器官重

腸道IgY含量=腸道各段IgY濃度×各段腸道重的和

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行整理，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，單因子方差分析(one-way ANOVA )檢驗組間差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。試驗結(jié)果用“平均數(shù)±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品的測定

由表2、圖1可知，組織器官IgY濃度與OD值的線性回歸方程為：y=154.48x+3.3851，式中x是OD值，y是組織器官IgY濃度，R2=0.997。

2.2 雛雞組織器官內(nèi)IgY的分布

2.2.1 不同日齡雛雞卵黃囊內(nèi)IgY濃度 由表3可知，1～6日齡雛雞卵黃囊內(nèi)IgY的濃度變化差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 不同日齡雛雞血清IgY濃度 由表3可知，血清IgY濃度在雛雞6日齡時顯著低于其它日齡(P<0.05)，其它日齡濃度差異不顯著(P>0.05)。

表2 標準品IgY濃度及對應(yīng)OD值Table 2 Concentration of standard IgY and the OD values

注：原倍標準品IgY濃度為800 μg/mL，采用倍比稀釋。

Notes: Concentration of original standard IgY was 800 μg/mL. Double dilution method was used.

圖1 IgY標準曲線Fig.1 Standard curve of IgY

2.2.3 不同日齡雛雞組織器官內(nèi)IgY濃度 由表4可知，脾臟1、2日齡的IgY濃度顯著高于其它日齡(P<0.05)，其它組織器官內(nèi)IgY濃度從雛雞1日齡到6日齡濃度差異不顯著(P>0.05)。

2.3 雛雞組織器官IgY含量比較

2.3.1 雛雞腸道IgY含量比較 由表5可知，雛雞1日齡時，十二指腸IgY含量顯著高于盲腸IgY含量(P<0.05)。雛雞在2日齡至5日齡時，十二指腸、空腸、回腸IgY含量顯著高于盲腸、直腸IgY含量(P<0.05)。雛雞6日齡時，十二指腸、盲腸、直腸IgY含量顯著低于空腸、回腸IgY含量(P<0.05)，空腸IgY含量顯著高于回腸(P<0.05)。

表3 雛雞不同日齡卵黃囊和血清內(nèi)IgY濃度 Table 3 Concentration of IgY from chicks' yolk sac and serum in various ages

注：同行數(shù)據(jù)肩標為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Notes: In the same row, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same below.

表4 雛雞不同日齡組織器官內(nèi)IgY濃度Table 4 IgY concentration in chicks' organs in various ages

表5 雛雞腸道IgY含量比較Table 5 Content comparison of IgY from chicks' intestines

2.3.2 雛雞內(nèi)臟器官IgY含量比較 由表6可知，雛雞1日齡、2日齡時，腸道、肝臟內(nèi)IgY含量顯著低于肌胃IgY含量(P<0.05)。雛雞在3日齡、4日齡、5日齡、6日齡時，腸道、肝臟、肌胃之間IgY含量差異均顯著(P<0.05)。雛雞1日齡、6日齡時，脾臟、胸腺、法氏囊之間IgY含量差異均顯著(P<0.05)；2～5日齡時，脾臟與法氏囊IgY含量均顯著低于胸腺IgY含量(P<0.05)。在雛雞組織器官中IgY的含量由高到低排列依次是：肌胃、肝臟、腸道、胸腺、法氏囊、脾臟。

表6 雛雞內(nèi)臟器官IgY含量比較Table 5 Comparison of IgY content in chicks' internal organs

注：同列數(shù)據(jù)肩標為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes: In the same collum, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

3.1 IgY在組織器官中的分布

雛雞6日齡前由于免疫器官沒有發(fā)育完全，自身不能產(chǎn)生抗體，其體內(nèi)抗體均來源于母源抗體。IgY是卵黃內(nèi)主要的球蛋白，對雞胚孵育過程中及孵育后起保護作用[14]。在正常情況下，母源抗體并不被消化從而完整地保留下來，在孵化后可完全發(fā)揮功能[2]。在雛雞出殼前，卵黃囊被吸進雛雞體內(nèi)，卵黃囊內(nèi)的物質(zhì)將在出殼后一周被逐漸吸收。有研究表明，IgY在種蛋孵化后的第7天就開始從卵黃囊內(nèi)轉(zhuǎn)移，但開始高水平的轉(zhuǎn)移是在卵黃囊吸入腹腔后開始的[15]，卵黃囊內(nèi)的IgY轉(zhuǎn)移后其分布情況鮮有報道。雛禽出殼后，血液中的IgY可為機體提供強有力的被動免疫，是禽類在長期進化過程中形成的用于提高雛禽抵抗力的物質(zhì)[16-17]。本試驗研究結(jié)果表明，血清IgY在1～5日齡沒有變化，6日齡時有顯著變化，雛雞隨著日齡的增大不斷生長，體內(nèi)血液總量不斷升高，血清中IgY總量是不斷增加的，表明IgY不斷被轉(zhuǎn)運到血清中，后期轉(zhuǎn)運的速度加快，雛雞抵抗疾病及外界應(yīng)激的能力不斷增強。

本試驗測定的組織器官中均檢測到不同濃度的IgY存在，表明除在卵黃囊和血清中存在IgY外，在機體組織器官內(nèi)也存在IgY。在1～6日齡的雛雞生長過程中，除免疫器官脾臟外其它測定組織器官中IgY濃度處于穩(wěn)定的狀態(tài)，變化范圍不大，而雛雞出殼后腹腔的卵黃囊被迅速吸收，重量顯著下降[18-19]，說明IgY同卵黃囊內(nèi)其它營養(yǎng)物質(zhì)一起被機體轉(zhuǎn)移吸收。Danny[20]的研究同樣表明：雛雞出殼前卵黃囊被吸收進入腹腔，卵黃囊中殘存著的IgY轉(zhuǎn)移至血液中，從而分布于機體的各個組織，如肝臟和小腸等。消化道是身體直接和外源物質(zhì)接觸的場所，外源飼料飲水會帶進各種微生物包括有害菌，IgY在消化道沉積應(yīng)該有助于在免疫系統(tǒng)未建立完善時幫助腸道這個天然屏障(或機體)抵抗外源微生物的入侵[21]。由此可估計，與外界接觸的皮膚和肺中IgY含量也較多，但還需進一步研究和探討。脾臟中IgY的濃度在3日齡后顯著升高，可能是因為脾臟連接腹腔內(nèi)最大的分支動脈，從卵黃囊內(nèi)吸收的IgY被卵黃囊上的血管吸收進入血液循環(huán)，隨脾動脈被吸收進入脾臟，在脾臟沉淀下來，并且脾臟體積小，生長緩慢，因此使得脾臟中IgY濃度最高。

3.2 組織器官IgY含量比較

從本試驗研究結(jié)果可以看出，在測定的消化器官中肌胃IgY的含量最高，遠高于腸道和肝臟，3日齡之前雖然肝臟中IgY的含量高于腸道中含量，但并未達到顯著水平，3日齡之后肝臟中IgY的含量顯著高于腸道中含量，說明在3日齡后IgY更快速地進入肝臟。雛雞從1日齡到6日齡腸道內(nèi)IgY含量從總體趨勢看小腸的含量高于大腸，十二指腸、空腸、回腸IgY的含量相近，這可能是與組織優(yōu)先生長發(fā)育的快慢有關(guān)，雛雞肌胃相對增重在4日齡左右就達到峰值，而肝臟和腸道達到峰值時間是在7日齡左右[22]，因此肌胃組織液中優(yōu)先存入較多的IgY。免疫器官IgY含量胸腺最高，其次是法氏囊、脾臟。脾臟中IgY濃度最高，因為其質(zhì)量相對較小，但是其在免疫機能中仍發(fā)揮著重要的作用。

一般認為，IgY在雛雞早期主要是通過腸粘膜與腸道病原微生物結(jié)合達到抗病能力，但IgY在雛雞諸多組織器官中均有存在，且各組織間存在量差異較大，故我們認為IgY可能多途徑發(fā)揮抗病作用。機體內(nèi)的免疫球蛋白對雛雞的免疫機能有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，但由本試驗結(jié)果可以看出免疫器官中IgY的含量相對較低，而肌胃中的IgY含量相對偏高，這可能與組織器官的生長發(fā)育快慢不同有關(guān)。

4 小 結(jié)

卵黃囊、腸道、肝臟、肌胃、胸腺、脾臟、法氏囊等組織器官及血清中均檢測到IgY，1～6日齡除脾臟外其他組織器官IgY濃度未發(fā)生顯著變化。在雛雞組織器官中IgY的含量由高到低排列依次是：肌胃、肝臟、腸道、胸腺、法氏囊、脾臟。