姚丹青,樓堅(jiān)鋒,顧芹芹,劉 建,張 琪,夏建明?

(1上海市種子管理總站,上海201103;2上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海200240)

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR)標(biāo)記是建立在PCR(Polymerase chain reaction)反應(yīng)基礎(chǔ)之上的一種遺傳標(biāo)記,相比其他常用技術(shù)具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于農(nóng)作物品種鑒定中。辛景樹(shù)[1]從DNA快速提取、引物篩選等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)研究,建立了完整的SSR技術(shù)體系,制作了國(guó)內(nèi)192個(gè)玉米主推品種及親本的DNA指紋圖譜,并開(kāi)展了玉米種子純度與品種真實(shí)性鑒定的推廣應(yīng)用。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,鮮食玉米如糯玉米、甜玉米等的遺傳改良及新品種選育工作得到高度重視,新品種不斷涌現(xiàn),種子市場(chǎng)異常活躍。近年來(lái),鮮食玉米遺傳育種及生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)展迅速,但分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用與普通玉米相比仍顯落后。本試驗(yàn)利用DNA指紋圖譜技術(shù),通過(guò)選用一系列鮮食玉米SSR引物,對(duì)上海地區(qū)的32個(gè)鮮食玉米品種進(jìn)行指紋標(biāo)記,以期為當(dāng)?shù)赜衩追N子市場(chǎng)的品種管理提供一種快速、有效的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用上海市2013年、2014年和2015年審定和生產(chǎn)上應(yīng)用的鮮食玉米品種,共計(jì)32份(表1)。

表1 上海市鮮食玉米品種材料及來(lái)源Table 1 The materials and sources of 32 maize varieties in Shanghai

1.2 DNA提取和SSR引物篩選

所有試驗(yàn)材料均采集幼苗或葉片,使用北京天根生化公司植物新型基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,并在1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,檢測(cè)DNA質(zhì)量,電泳緩沖液為1×TAE,電壓100 V;DNA純度和濃度利用NanoDrop2000c紫外可見(jiàn)光譜儀(Thermo公司)進(jìn)行測(cè)定,稀釋至50 ng∕μL的工作液備用,4℃冰箱儲(chǔ)藏。

SSR引物來(lái)源于2個(gè)方面：參考國(guó)內(nèi)外發(fā)表的文獻(xiàn),選擇具有多態(tài)性的引物;自行設(shè)計(jì),根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的SSR位點(diǎn)序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件PRIMER 5.0設(shè)計(jì)。初步確定40對(duì)引物用于初篩分析。所有引物由上海生工有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系：HotStart Mix 2 × 10 μL,Coralload 10 × 2 μL,上下游引物各 0.6 μL,50 ng∕μL 模板1 μL,ddH2O 5.8 μL,總體積為20 μL。 PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,55—60℃退火35 s,72℃延伸45 s,36個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.3 DNA指紋圖譜的采集及數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)分析基于QIAxcel ScreenGel 1.4版軟件,通過(guò)軟件系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)指紋的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,確定每個(gè)位點(diǎn)的等位基因。采用NTSYS-pcv 2.11軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析,構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物初篩

取表型差異較大的20個(gè)玉米品種作為引物初篩材料,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,根據(jù)電泳譜帶分析結(jié)果(圖1),篩選出具有一定多態(tài)性、擴(kuò)增容易、擴(kuò)增帶型清晰且穩(wěn)定的引物進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 引物復(fù)篩

以收集的所有玉米品種為材料,采用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。一是分析產(chǎn)物的峰型,淘汰一些連續(xù)多峰且主峰不穩(wěn)定、高低峰不明、雜峰多等不容易分析的引物,保留較好峰形的引物(圖2);二是統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù),并根據(jù)等位基因的頻率計(jì)算位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC),保留PIC大于0.5的引物;三是考慮引物染色體均勻分布,確保每條染色體上有1個(gè)位點(diǎn)。品種鑒定引物組合須滿足3個(gè)要求：鑒別能力強(qiáng)(滿足海量品種的鑒別),數(shù)量適宜(經(jīng)濟(jì)方便),染色體分布均勻(不連鎖)。按照候選引物的PIC值以及所在的染色體進(jìn)行排序,取每個(gè)染色體上PIC最高的引物作為組合基數(shù),通過(guò)遺傳聚類(lèi)分析組合的鑒別能力,將收集的品種進(jìn)行有效區(qū)分,最終確定適合玉米品種鑒定的候選引物25對(duì)(表2)。

圖1 利用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測(cè)引物多態(tài)性Fig.1 Detection of primer polymorphism by capillary electrophoresis

圖2 復(fù)篩引物P15的峰型和等位基因分析Fig.2 Peak type and allele analysis of rescreened primer P15

表2 適合玉米品種鑒定的候選引物的確定Table 2 Determination of candidate primers suitable for identification of maize varieties

2.3 DNA數(shù)字指紋建立

以多態(tài)性高、重復(fù)性好、帶型易區(qū)分統(tǒng)計(jì)的原則[2],確定了25對(duì)核心引物,將SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特征譜帶進(jìn)行0、1數(shù)字化,建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

表3 上海地區(qū)32個(gè)玉米品種DNA指紋數(shù)據(jù)Table 3 DNA fingerprintdata of 32 maize varieties in Shanghai

2.4 遺傳多樣性分析

圖3 32個(gè)玉米品種25對(duì)引物組合的遺傳聚類(lèi)圖Fig.3 Clustering map of 25 markers on 32 maize varieties

根據(jù)25對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析,32個(gè)玉米品種的相似系數(shù)為0.460—0.900,在遺傳相似系數(shù)為0.53時(shí),可將32個(gè)玉米品種分為三大類(lèi)群(圖3)。其中,8(‘萬(wàn)彩糯3號(hào)’)、12(‘蘇珍花糯2012’)、19(‘蘇科糯3號(hào)’)、21(‘蘇珍甜糯5 號(hào)’)、22(‘滬五彩花甜糯’)聚類(lèi)到第2 類(lèi)群,籽粒顏色都為花色相間。在遺傳相似系數(shù)為0.64時(shí),可將第2聚類(lèi)群分為3組,第2組中的25(‘滬甜1301’)、26(‘先甜5 號(hào)’)、27(‘圣甜1 號(hào)’)、28(‘先甜90’)、29(‘滬甜1 號(hào)’)、32(‘金珠甜脆’)均為黃色籽粒、穗軸白色、花絲綠色;第3組中的10(‘申科糯1號(hào)’)、16(‘華耘黑糯501’)、15(‘天糯一號(hào)’)、20(‘荊恒一號(hào)’)、21(‘蘇珍甜糯5號(hào)’)均為糯玉米。

3 討論

主要農(nóng)作物品種審定登記制度實(shí)施以來(lái),審定品種的數(shù)量呈逐年增多趨勢(shì),截至2013年底,玉米審定品種數(shù)量達(dá)到6 291個(gè)[3],給品種高效管理帶來(lái)了挑戰(zhàn);隨著玉米品種資源遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄及少數(shù)骨干親本被集中應(yīng)用,出現(xiàn)了一批在原品種基礎(chǔ)上僅做細(xì)微改良的派生品種,對(duì)品種鑒定技術(shù)提出了更高的要求;市場(chǎng)上出現(xiàn)標(biāo)簽名稱(chēng)與實(shí)際包裝的種子不符等品種真實(shí)性問(wèn)題,增加了種子市場(chǎng)監(jiān)管的難度[4]。目前,SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米、水稻等農(nóng)作物中已有廣泛運(yùn)用。李新海等[5]利用SSR標(biāo)記研究了21個(gè)玉米自交系的遺傳變異。劉杰等[6]采用SSR標(biāo)記和雜種優(yōu)勢(shì)聚類(lèi)方法分析了中國(guó)15個(gè)玉米自交系的遺傳變異,初步對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群進(jìn)行劃分;劉世建等[7]對(duì)四川地方玉米種質(zhì)資源進(jìn)行SSR聚類(lèi)分析,研究了28個(gè)玉米自交系的遺傳變異。喬志軍等[8]對(duì)180份玉米自交系親緣關(guān)系進(jìn)行了分子評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)育種多由表現(xiàn)型間接對(duì)基因型進(jìn)行選擇和分類(lèi),存在很大的隨機(jī)性和盲目性。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為評(píng)價(jià)玉米種質(zhì)資源基礎(chǔ)及雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了新技術(shù)和手段,同時(shí)也為構(gòu)建玉米品種指紋數(shù)據(jù)庫(kù)提供了良好的基礎(chǔ)。本研究選定2013年、2014年和2015年上海審定和生產(chǎn)應(yīng)用的主要鮮食玉米品種,基于標(biāo)準(zhǔn)化的建庫(kù)程序和毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)的運(yùn)用,利用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行指紋圖譜采集,經(jīng)過(guò)對(duì)引物初篩,最終選用了25對(duì)玉米SSR引物對(duì)32個(gè)玉米品種進(jìn)行了指紋數(shù)據(jù)分析,并構(gòu)建了DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù),為當(dāng)?shù)赜衩灼贩N、真實(shí)性鑒定奠定了快速檢測(cè)的基礎(chǔ),為政府的品種管理、企業(yè)的品種維權(quán)、農(nóng)民的利益維護(hù)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐,有利于保護(hù)新品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)和生產(chǎn)者利益,促進(jìn)鮮食玉米研究及種子市場(chǎng)的健康發(fā)展。