李茜腴 李綏著 華樹海

（1 廣東省湛江市第二中學 廣東湛江 524022 2 廣西省南寧市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)第一初級中學 廣西南寧 530031）

目前高中階段開展的微生物培養(yǎng)實驗主要來自選修1 的內(nèi)容，但由于實驗條件不足，開展該實驗的學校并不多，即使有條件的學校開展該實驗也是以小組的形式來操作，無法讓每個學生都有動手操作的機會，不能讓學生掌握微生物接種的實驗操作過程，導致學生的探究欲望無法滿足。實驗室微生物培養(yǎng)使用的菌種是大腸桿菌，是一種生活在人和動物腸道中的棲居菌，能夠對水體造成污染，甚至引起人和動物嚴重腹瀉或敗血癥。大腸桿菌的購買需要到國家指定的購買點才可以，廢棄菌種也需要經(jīng)過嚴格的高壓蒸汽滅菌后才能丟棄。 從菌種的購買及廢棄菌種的處理均可以看出大腸桿菌作為實驗材料的繁瑣和危害之處。 培養(yǎng)學生的動手操作能力和探究創(chuàng)新能力，教師可以指導學生利用安全的實驗材料家庭輔助培養(yǎng)，滿足學生的探究欲望和動手能力。 釀酒酵母菌對人和動物無害且容易生長, 人們常利用它制作葡萄酒或面食發(fā)酵。 利用釀酒酵母菌作為微生物培養(yǎng)的菌種有著大腸桿菌所不具備的三大特點：即材料廣泛易得，安全無污染，自身分泌物可抑制雜菌生長。 本實驗主要改變了微生物培養(yǎng)的實驗材料和操作環(huán)境，將微生物的培養(yǎng)操作搬到家庭進行，并改良了釀酒酵母菌培養(yǎng)基的配方，使用簡化的實驗器材，采用簡單易操作的滅菌方法，對微生物培養(yǎng)實驗進行優(yōu)化處理。 本實踐研究成果將給學生或教師提供一個既節(jié)省又簡單安全的微生物培養(yǎng)方法和思路。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料 釀酒酵母菌： 酵母菌在現(xiàn)代分子和細胞生物學中常用作真核模式生物，其作用相當于原核模式生物大腸桿菌［1］。釀酒酵母菌通常用于制作面食及釀酒，活性干酵母可在超市購買，它是用鮮酵母低溫干燥制成的,便于貯藏和運輸?；钚愿山湍甘褂们耙蒙倭康臒o菌水將干酵母活化處理。

1.2 實驗儀器 試管10 支，1 mL 一次性注射器若干支，1 000 mL 規(guī)格的錐形瓶2 個，200 mL 燒杯2 個，100 mL 燒杯2 個，酒精燈2 個，電磁爐1個，2.5 mL 注射器2 個，培養(yǎng)皿8 個，涂布器1個，家用高壓鍋2 個，電子秤1 個。

1.3 黃豆粉培養(yǎng)基的用量和營養(yǎng)成分 經(jīng)過多次實驗摸索出最合適的黃豆粉培養(yǎng)基成分用量，然后配置5 g 和10 g 的黃豆粉培養(yǎng)基進行比較菌落特征和數(shù)目，用量和營養(yǎng)成分如表1 所示。

表1 1 000 mL 黃豆粉培養(yǎng)基配方

2 實驗方法與步驟

2.1 釀酒酵母菌的活化 打開一包15 g 的活性干酵母粉倒入裝有100 mL 的無菌水的小燒杯中活化1 h，直至釀酒酵母溶解。

2.2 黃豆粉培養(yǎng)基的配置

1）計算：一般培養(yǎng)基配方是1 000 mL 含各種成分的含量。

2）稱量：分別用電子秤稱量5 g，10 g 黃豆粉（已磨制），以及5 g 葡萄糖和15 g 瓊脂粉各2 份。

3）溶化：將稱量好的原料分別倒入裝有150 mL 無菌水的錐形瓶中，電磁爐加熱，用玻璃棒攪拌使其溶解完畢（電磁爐不能直接加熱，需要放入電磁爐鍋中加熱）。然后加入稱量好的5 g 葡萄糖和15 g 瓊脂粉，加熱攪拌溶解，當瓊脂完全溶化后，加水配制成1 000 mL 的培養(yǎng)基。

2.3 高壓鍋滅菌 將所有需要滅菌的玻璃儀器和配制好的培養(yǎng)基，用干凈報紙或用保鮮袋包好，小心放入高壓鍋內(nèi)的架子上，鍋底裝著少量水（注意不要過度用力以免壓壞玻璃儀器），裝有清水的試管加棉塞豎直放置，以免制備的無菌水傾倒出來。 利用家用高壓鍋對實驗儀器和培養(yǎng)基進行滅菌，當高壓鍋內(nèi)充滿飽和蒸汽后，關閉放氣閥，適當控制電源，繼續(xù)保持25 min，滅菌完成后關閉高壓鍋電源，等待玻璃儀器冷卻。由于家用高壓鍋太小，可以用2 個或多個高壓鍋進行滅菌處理。家用高壓鍋的內(nèi)部溫度約為120℃，壓強超過100kPa［2］，達到高壓蒸汽滅菌鍋的標準。

2.4 倒平板 首先進行實驗環(huán)境消毒。用脫脂棉球蘸75%的酒精對實驗臺桌面進行消毒。 待酒精揮發(fā)后，點燃酒精燈，再用酒精擦拭實驗者的雙手。實驗操作盡量在干燥的環(huán)境下進行，否則空氣中的水汽攜帶的大量細菌將會影響實驗結果。

將滅菌后的培養(yǎng)皿放在酒精燈火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞［3］。右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約30 mL）倒入培養(yǎng)皿，左手將培養(yǎng)皿蓋蓋上，將倒好的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放入已滅菌冷卻的高壓鍋內(nèi)，避免雜菌污染。因本次選用的黃豆粉培養(yǎng)基本身有些黏稠，故倒平板時要左右搖動培養(yǎng)皿以便培養(yǎng)基流動均勻覆蓋整個培養(yǎng)皿的底部。 待平板冷卻凝固后將培養(yǎng)皿倒扣在高壓鍋內(nèi)防止水珠滴落入培養(yǎng)基造成污染。

2.5 純化釀酒酵母菌 本實驗采用的接種方法是稀釋涂布平板法。

1）釀酒酵母菌菌種的稀釋。 用一次性針筒向5 支試管里各注入4.5 mL 的無菌水，塞上棉塞，貼上標簽，注明稀釋倍數(shù)（10-1稀釋至10-5）并放到試管架上待用。在酒精燈火焰旁搖勻菌液，用一次性注射器從調(diào)配好的釀酒酵母菌菌液中抽出0.5 mL，注入到裝有4.5 mL 無菌水并貼有“10-1”的試管中，搖勻，完成10-1的稀釋。 按梯度重復上述稀釋步驟，使菌液濃度稀釋至10-5。 整個實驗過程需在酒精燈火焰旁完成，防止雜菌污染。

2）釀酒酵母菌接種。 向培養(yǎng)基中滴入一滴稀釋倍數(shù)為10-5的釀酒酵母菌菌液，用灼燒冷卻后的涂布器在平板上涂布均勻，后合上培養(yǎng)皿蓋，涂布器灼燒滅菌，再進行下一個平板的涂布工作，將接種好的培養(yǎng)基倒扣在已滅菌冷卻的高壓鍋內(nèi)。

3）家用高壓鍋培養(yǎng)。 將接種好的6 個培養(yǎng)皿和2 個不接種的培養(yǎng)皿（做空白對照）疊好放置于已經(jīng)滅菌冷卻的2 個高壓鍋內(nèi)蓋上鍋蓋培養(yǎng)，接種的培養(yǎng)基在日平均溫度為28℃的環(huán)境下常溫培養(yǎng)72 h（培養(yǎng)期間的氣溫是24～29℃，滿足培養(yǎng)的條件）。 酵母菌生長的最適溫度是18～25℃，但經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)溫度在28℃時菌落形成更快，菌落更大。由于家庭沒有恒溫箱，學生可以用家用烤箱或微波爐控制培養(yǎng)溫度，或者結合當?shù)氐臍鉁剡M行常溫培養(yǎng)，注意白天和夜晚的溫差不要太大。

3 實驗結果分析與討論

本實驗采用了2 種不同含量的黃豆粉培養(yǎng)基進行對比分析釀酒酵母菌生長所需要的營養(yǎng)條件。 通過對比菌落數(shù)目發(fā)現(xiàn)10 g 黃豆粉的培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)目較5 g 黃豆粉培養(yǎng)基的密集些，而且菌落也大一些，說明10 g 黃豆粉的培養(yǎng)基營養(yǎng)更加充分。 通過實驗組和對照組的對比，2組空白對照組均無任何雜菌，2 組實驗組的菌落數(shù)均在30～300 之間，說明采用家庭高壓鍋滅菌效果好，整個實驗的無菌操作控制恰當，實驗效果明顯。 通過觀察釀酒酵母菌在黃豆粉培養(yǎng)基的生長情況，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌的菌落呈乳白色，球形突起，表面光滑，奶油狀，不透明［4］，說明微生物家庭培養(yǎng)釀酒酵母菌實驗成功。

4 本實驗與教材對比情況

內(nèi)容見下頁表2。

5 小結

本實驗主要改變微生物培養(yǎng)的實驗材料、培養(yǎng)基配方、滅菌方法和培養(yǎng)條件，成功地在家庭里培養(yǎng)了釀酒酵母菌。 明顯的實驗現(xiàn)象可以給學生提供在家里進行微生物培養(yǎng)實驗的參考，同時也培養(yǎng)了學生的核心素養(yǎng)。除了釀酒酵母菌外，還有乳酸菌和曲霉等菌種也可以作為家庭微生物培養(yǎng)的實驗材料。但是為了防止菌種攜帶病原體，學生在選擇菌種時要通過正規(guī)途徑購買，例如超市銷售的釀酒酵母菌是用鮮酵母低溫干燥制成，安全無污染。還有防止菌種的變異和對環(huán)境的污染，實驗結束后需要對稀釋的菌種和接種過的培養(yǎng)基用高壓鍋滅菌后再丟棄。 對于不同菌種的使用要求的溫度不一樣，學生可以根據(jù)當?shù)氐臍鉁剡x擇合適的菌種進行培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)條件的控制。在整個微生物培養(yǎng)實驗的操作過程中，重要的是無菌操作，要求學生對實驗操作工作臺做好滅菌消毒工作，選擇安全性能好，滅菌效果好的高壓鍋，實驗過程做好無菌操作，這樣實驗的成功率將會大大提高，減少對環(huán)境的污染。該實驗的研究還可以讓學生在此基礎上探索開展“微生物的種群密度變化調(diào)查”“微生物豐富度調(diào)查”“飲用水及食品微生物污染的檢測”等實驗。

表2 釀酒酵母家庭培養(yǎng)和實驗室培養(yǎng)對比