張克亞 卿人韋 柳科歡 劉倩倩 侯興國(guó) 蘭利瓊

摘 要： 蝦青素具有多種生物學(xué)活性，雨生紅球藻為天然蝦青素的最佳來源，缺氮脅迫會(huì)導(dǎo)致雨生紅球藻積累蝦青素。為了解缺氮條件下雨生紅球藻蝦青素積累的分子機(jī)制，該研究通過對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行缺氮脅迫，結(jié)合MSAP法，研究了雨生紅球藻在缺氮脅迫下蝦青素積累過程中基因組甲基化水平的變化，結(jié)果表明：缺氮脅迫0～72 h期間，雨生紅球藻生長(zhǎng)速度減慢，而蝦青素積累主要發(fā)生在缺氮處理12～24 h期間，隨后積累速度減慢。同時(shí)，對(duì)缺氮脅迫0、24、72 h的雨生紅球藻基因組DNA進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析，共得到了291個(gè)甲基化多態(tài)性位點(diǎn)，其中發(fā)生甲基化變化的位點(diǎn)在0～24 h和24～72 h分別占總位點(diǎn)的29.90%和53.95%。在缺氮脅迫24 h處DNA半甲基化率最大（為12.71%），全甲基化率最低（為26.80%）；缺氮脅迫72 h處DNA全甲基化率最高（為28.52%），半甲基化率最低（為1.72%）。這表明DNA甲基化調(diào)節(jié)方式的改變是蝦青素積累過程中的一種重要調(diào)控模式。

關(guān)鍵詞： 藻類學(xué)， 缺氮脅迫， 雨生紅球藻， 蝦青素， 甲基化變化

中圖分類號(hào)： Q948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1155-09

Abstract： Haematococcus pluvialis is the best resource for natural astaxanthin， which has multiple biological functions. Nitrogen depletion can result in astaxanthin accumulation in H. pluvialis. In order to explore the molecular mechanism of astaxanthin accumulation in H. pluvialis under nitrogen depletion stress， the growth rate of the algae was found to decrease during 0-72 h， the accumulation of astaxanthin mainly occured during 12-24 h， and then slowed down. MSAP analysis of stress time point at 0， 24 and 72 h got 291 methylation polymorphism loci， among which 29.90% of 0-24 h methylation loci and 53.95% of 24-72 h methylation loci changed. After 24 h of nitrogen depletion stress， the DNA semi-methylation rate was the highest （12.71%）， and the full-methylation rate got the lowest （26.80%）. On the contrary， full-methylation rate was the highest （28.52%） and the semi-methylation rate was the lowest （1.72%） after 72 h stress. DNA methylation changes appeared to be a vital regulation for astaxanthin accumulation.

Key words： phycology， nitrogen depletion stress， Haematococcus pluvialis， astaxanthin， methylation change

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水生長(zhǎng)的單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門綠藻綱團(tuán)藻目紅球藻科紅球藻屬。在不利環(huán)境中（如強(qiáng)光、高鹽、高溫、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏），會(huì)形成較大的厚壁孢子積累蝦青素，并失去鞭毛成為不動(dòng)細(xì)胞（段良飛等，2017）。蝦青素（astaxanthin）是一種屬于葉黃素類（xanthophylls）的類胡蘿卜素，呈深粉紅色，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于β-胡蘿卜素（Martinez-Delgado et al，2017），廣泛存在于蝦、蟹、魚以及某些鳥類的羽毛中，除具有著色功能外，還有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基等方面的能力，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。蝦青素有三種立體異構(gòu)體，即3S，3′S；3R，3′R；3R，3′S（分別為左旋、右旋、內(nèi)消旋）（Ambati et al，2014）。雨生紅球藻（H. pluvialis）中多為（3S，3′S）異構(gòu)體（Wan et al，2015）。Liu et al（2016）研究表明，蝦青素三種立體異構(gòu)體的抗氧化活性依次為（3S，3′S）>（3R，3′R）>（3R，3′S）。目前，自然界中天然的蝦青素主要存在于某些藻類、酵母和細(xì)菌中，其中雨生紅球藻是天然蝦青素的最佳來源（趙曉燕等，2016）。蝦青素因其具有高效生物學(xué)活性，而成為近年來國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

基因組DNA甲基化能維持植物基因組功能穩(wěn)定以幫助植物抵抗逆境（馬浪浪等，2013），還能調(diào)節(jié)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育、改變植物春化作用，促進(jìn)開花，引起轉(zhuǎn)基因沉默等（黃祿君等，2009）。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）是在擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）的基礎(chǔ)上發(fā)展而來（Vos et al，1995），利用同裂酶HpaⅡ/Msp I對(duì)識(shí)別序列CCGG的甲基化敏感性不同，產(chǎn)生不同的DNA切割片段來揭示甲基化位點(diǎn)（李娜等，2012）。由于該法成本低、靈敏度高，不受基因組序列的限制，檢測(cè)位點(diǎn)多并能同時(shí)分析多個(gè)樣品（熊肖等，2017），目前已越來越多地應(yīng)用于檢測(cè)植物基因組DNA甲基化水平，在植物表觀遺傳學(xué)的研究中具有良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)今對(duì)雨生紅球藻的研究致力于其高效培養(yǎng)（Jaime Fábregas et al，2001；Zhang et al， 2014；陳興才等，2005），蝦青素的積累和提取條件探究（段良飛等，2017；李小慧等，2015）以及蝦青素積累結(jié)構(gòu)——質(zhì)體球滴的觀察與質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)蛋白的基因克隆等（范勇等，2012），對(duì)缺氮條件下雨生紅球藻蝦青素積累過程中的基因組MSAP分析尚未見報(bào)道，而這些研究對(duì)揭示雨生紅球藻在缺氮條件下蝦青素積累的具體機(jī)制具有重大意義。本研究通過對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行缺氮脅迫，結(jié)合MSAP法，探究雨生紅球藻在缺氮脅迫下蝦青素積累過程中的基因組甲基化水平變化，初步揭示雨生紅球藻對(duì)缺氮脅迫的適應(yīng)機(jī)制，對(duì)深入研究氮脅迫下雨生紅球藻蝦青素積累機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)，并豐富藻類在表觀遺傳學(xué)上的研究?jī)?nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）藻種，由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藻類實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 采用BBM培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式為通氣（V空氣∶VCO2=98∶2），溫度（22±1）℃，光暗周期12 h∶12 h，光照強(qiáng)度900～1 100 lx。正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻按1∶10比例接種，通氣培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)按1∶6的比例轉(zhuǎn)至1 L三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將藻離心收集，藻泥全部轉(zhuǎn)移至等體積新配的BBM缺氮培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫，對(duì)照組用BBM全培養(yǎng)基進(jìn)行正常培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)及顯微觀察 將對(duì)照組和缺氮脅迫組的雨生紅球藻在培養(yǎng)至0、12、24、48、72 h時(shí)分別取樣，用顯微鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)并用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定藻細(xì)胞數(shù)目。

1.2.3 蝦青素含量測(cè)定 將對(duì)照組和缺氮脅迫組的雨生紅球藻在培養(yǎng)至0、12、24、48、72 h時(shí)分別取樣，進(jìn)行蝦青素含量測(cè)定。采用改進(jìn)的美國(guó)Cyanotech公司的方法（陳曉飛和嚴(yán)小軍，2007）：藻泥于15 mL離心管中烘干后，加入1 g石英砂和5 mL DMSO，45～50 ℃水浴30 min，此期間每5 min渦旋振蕩30 s（共6次）。3 500 r·min-1下離心5 min使細(xì)胞物質(zhì)沉淀，上清轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中。往離心管中加入1 mL丙酮，渦旋振蕩30 s。 3 500 r·min-1下離心5 min使細(xì)胞物質(zhì)沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，丙酮至少抽提3次，直到上清液基本無色（吸光值小于0.05）。用丙酮定容至10 mL，將容量瓶上下顛倒混勻，吸取5～10 mL放入離心管，3 500 r·min-1下離心5 min以除去前面步驟中帶入的顆粒物。474 nm波長(zhǎng)下測(cè)定最大吸光值（丙酮作空白對(duì)照）。若吸光值大于1.25，則必須對(duì)樣品用丙酮稀釋后再測(cè)，稀釋倍數(shù)一般為1∶5～1∶10。每組3個(gè)重復(fù)。計(jì)算公式如下：

類胡蘿卜素質(zhì)量（mg）=最大吸光值A(chǔ)250 × 10 mL（丙酮） × 稀釋倍數(shù)；

蝦青素含量=類胡卜素（mg）樣品質(zhì)量（mg） × 80%。

1.2.4 MSAP分析 將缺氮處理0 h（脅迫處理前，作為對(duì)照）、24、72 h的雨生紅球藻用Ezup柱式植物基因組DNA試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]進(jìn)行DNA提取，參照Xiong et al（1999）的方法改進(jìn)后進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增及電泳。MSAP分析所采用的接頭序列、預(yù)擴(kuò)增引物及選擇性擴(kuò)增引物序列見表1。接頭和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司，T4 DNA Ligase購(gòu)自TaKaRa公司，PCR mix購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

對(duì)提取的DNA分別進(jìn)行EcoR I/Hpa Ⅱ和EcoR I/Msp I 2個(gè)組合酶切。酶切總反應(yīng)體系20 μL：EcoR I 10 U，Hpa Ⅱ & Msp I 10 U，10×Tango buffer 4 μL，DNA樣品300 ng，ddH2O補(bǔ)足20 μL。37 ℃酶切10 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。接著進(jìn)行接頭連接，連接體系總共20 μL：酶切產(chǎn)物10 μL，EcoR I 接頭（5 μmol·L-1）與Hpa Ⅱ（Msp I）接頭（50 μmol·L-1）各1 μL，T4 DNA Ligase 350 U，10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。16 ℃連接12 h。連接產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增體系20 μL，包括預(yù)擴(kuò)增引物E0（10 μmol·L-1）1 μL，H/M0（10 μmol·L-1）1 μL，連接產(chǎn)物10倍稀釋液5 μL，2×PCR mix 10 μL，雙蒸水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增體系20 μL，包括EcoR I選擇性擴(kuò)增引物（10 μmol·L-1）1 μL，H/M選擇性擴(kuò)增引物（10 μmol·L-1）1 μL，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物30倍稀釋液5 μL，2×PCR mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，65 ℃（每個(gè)循環(huán)降0.7 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，共12個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后，取2～3 μL進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后按高東等（2009）的方法改進(jìn)后進(jìn)行銀染，拍照并保存結(jié)果。電泳結(jié)果中，將Hpa Ⅱ/Msp I 酶切產(chǎn)物的條帶進(jìn)行標(biāo)記，無條帶記為“0”，有條帶記為“1”。統(tǒng)計(jì)各類型條帶數(shù)目，用Excel 2013進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻在缺氮脅迫下的生長(zhǎng)曲線與顯微觀察

雨生紅球藻在正常BBM和缺氮的BBM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖1所示。整個(gè)過程中，正常培養(yǎng)條件的雨生紅球藻生長(zhǎng)狀態(tài)良好，至72 h時(shí)，細(xì)胞數(shù)量每毫升已達(dá)13.2×105個(gè)； 而缺氮組的紅球藻生長(zhǎng)速度下降，生長(zhǎng)減慢，到末期（72 h），細(xì)胞數(shù)量每毫升為8.7×105個(gè)，為對(duì)照組的0.66倍。

顯微觀察結(jié)果如圖2所示。在缺氮脅迫0～24 h期間，雨生紅球藻外觀變化不顯著，至脅迫72 h時(shí)，顯微鏡下可見藻細(xì)胞內(nèi)部已有少量蝦青素積累。

2.2 蝦青素含量變化

圖3為缺氮過程中蝦青素含量變化情況。由圖3可見，缺氮組的蝦青素含量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一直高于對(duì)照組，且缺氮組在脅迫處理12～24 h階段蝦青素含量急劇增加，為增幅最大的時(shí)段。此后，缺氮組蝦青素含量上升減慢，趨于穩(wěn)定。缺氮組與對(duì)照組在脅迫72 h處差異最大，此時(shí)缺氮組的蝦青素含量為對(duì)照組的2.64倍。

2.3 缺氮脅迫下雨生紅球藻DNA的MSAP分析

將11對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合進(jìn)行雨生紅球藻DNA樣品的全基因組甲基化分析（圖4）。對(duì)上述膠圖進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)后，按Tang et al（2014）的方法進(jìn)行分類，具體分類如表2所示。甲基化一共有四種類型：（I） Hpa Ⅱ 和Msp I 處均有帶（1，1），即沒有發(fā)生甲基化；（Ⅱ） Hpa Ⅱ 無帶， Msp I 有帶（0，1），為內(nèi)部胞嘧啶發(fā)生全甲基化；（Ⅲ） Hpa Ⅱ 有帶， Msp I 無帶（1，0），為外側(cè)胞嘧啶半甲基化；（IV） Hpa Ⅱ和Msp I處均無帶（0，0）， 為超甲基化位點(diǎn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)后，得到各類條帶數(shù)目如圖5 所示。共得到1 265個(gè)條帶，從這些條帶中得到291個(gè)甲基化多態(tài)性位點(diǎn)。I類（未發(fā)生甲基化）數(shù)目最多，在缺氮處理 0、24、72 h 時(shí)分別為194、176、203個(gè)；Ⅱ類在缺氮處理的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)變化不大；Ⅲ類在缺氮脅迫24 h和72 h時(shí)減少了86.49%，變化顯著；IV類較穩(wěn)定，在缺氮處理72 h時(shí)達(dá)64個(gè)，在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中數(shù)目最多。

對(duì)所得條帶進(jìn)行甲基化率分析，統(tǒng)計(jì)時(shí)將Ⅱ與IV類型視作全甲基化，總甲基化率 = [（Ⅱ+Ⅲ+IV）/（I+Ⅱ+Ⅲ+IV）] × 100%，全甲基化率 = [（Ⅱ+IV）/（I+Ⅱ+Ⅲ+IV）] × 100%，半甲基化率 = [（Ⅲ）/（I+Ⅱ+Ⅲ+IV）] × 100%，所得結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，缺氮處理24 h的總甲基化位點(diǎn)數(shù)最多 （115個(gè)）， 總甲基化率最高（39.52%）； 缺氮處理72 h的總甲基化位點(diǎn)最少（88個(gè)），總甲基化率最低（30.24%），顯示在處理24～72 h期間，基因組總甲基化率下調(diào)了23.48%。全甲基化位點(diǎn)數(shù)在缺氮處理0、24、72 h 之間差異不大，全甲基化率在 26%～28%。半甲基化位點(diǎn)數(shù)在缺氮處理0、24、72 h分別為16、37、5個(gè)，顯示在缺氮24 h處半甲基化率最大（12.71%），比0 h處上升了131.25%，而比72 h處下降了86.47%，變化顯著。

對(duì)胞嘧啶發(fā)生甲基化和去甲基化變化的位點(diǎn)模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表4）。通過表4分析發(fā)現(xiàn)，缺氮脅迫下的胞嘧啶甲基化和去甲基化變化共包括三種模式：（1）甲基化位點(diǎn)無變化。在缺氮處理0～24 h和24～72 h期間，甲基化位點(diǎn)無變化的數(shù)目分別為204和134個(gè)，各占總甲基化位點(diǎn)的70.10%和46.05%。（2）位點(diǎn)發(fā)生甲基化。缺氮處理0～24 h 期間發(fā)生甲基化的位點(diǎn)有46個(gè)，占總甲基化位點(diǎn)的15.81%；缺氮處理24～72 h期間發(fā)生甲基化的位點(diǎn)有73個(gè)，占25.09%。（3）位點(diǎn)發(fā)生去甲基化。缺氮處理0～24 h 期間發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)有41個(gè)，占14.09%；缺氮處理24～72 h期間發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)有84個(gè)，占28.87%。結(jié)果顯示，291個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在0～24 h期間有87個(gè)發(fā)生了甲基化或去甲基化變化，占29.90%；24～72 h期間發(fā)生甲基化或去甲基化變化的位點(diǎn)有157個(gè)，占53.95%?？梢?，在缺氮處理過程中基因組DNA同時(shí)發(fā)生甲基化和去甲基化，且在后期（24～72 h）發(fā)生該變化的位點(diǎn)數(shù)更多。

3 討論

氮元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育和發(fā)育過程中必不可少且需求量最大的元素，對(duì)細(xì)胞的構(gòu)成、分裂、生長(zhǎng)都有著重要作用，被稱為“生命元素”（陳雅君等，2013）。氮元素是影響多種微藻生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累最重要的元素（Griffiths & Harrison，2009）。本研究中，缺氮條件下的紅球藻生長(zhǎng)速度減慢， 這與莊惠如等（2000）研究中“在接種后3 d，缺氮處理組生長(zhǎng)明顯延緩”的現(xiàn)象一致。黃水英等 （2009）發(fā)現(xiàn)，缺氮條件下雨生紅球藻積累蝦青素的同時(shí)并未大量形成孢子，而是在游動(dòng)細(xì)胞階段積累蝦青素，這與本研究缺氮處理72 h時(shí)顯微觀察到的雨生紅球藻細(xì)胞并未形成厚壁孢子吻合。

缺氮脅迫下，雨生紅球藻生長(zhǎng)減慢，但蝦青素含量卻一直增加，表明缺氮有助于蝦青素的合成，這與莊惠如等（2000）和Borowitzka et al（1991）研究結(jié)果一致，其機(jī)制可能是因?yàn)槿钡{迫引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加（Mendesferreira et al，2010），形成氧化脅迫，藻細(xì)胞快速、大量合成蝦青素等抗氧化物質(zhì)清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（王潮崗等，2012），維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡。此外，缺氮還會(huì)增加某些綠藻的脂質(zhì)體含量（Hirooka et al，2014），而脂質(zhì)體正是蝦青素在雨生紅球藻細(xì)胞質(zhì)中儲(chǔ)存的場(chǎng)所（Makio，2003），這也是缺氮脅迫導(dǎo)致蝦青素積累的原因之一。

MSAP結(jié)果顯示，四種甲基化類型中，I類（未發(fā)生甲基化）條帶數(shù)最多，其次為IV類（超甲基化）。分析發(fā)現(xiàn)，在缺氮處理24 h處半甲基化率最高（達(dá)12.71%），全甲基化率最低（為26.80%），而缺氮12～24 h期間蝦青素含量急劇增加，表明缺氮初期，蝦青素積累可能主要以基因組 DNA半甲基化調(diào)節(jié)為主。缺氮處理72 h時(shí)，蝦青素仍在積累，但積累速度緩慢，此時(shí)基因組DNA全甲基化率最高，推測(cè)此時(shí)主要以全甲基化調(diào)節(jié)為主。

DNA甲基化與去甲基化可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，此過程中可能將外源DNA沉默，以保持基因組的完整，使植物體正常生長(zhǎng)代謝，更好地適應(yīng)外界環(huán)境（劉冰，2013）。通常，基因發(fā)生甲基化會(huì)抑制表達(dá)，發(fā)生去甲基化會(huì)增加轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)基因表達(dá)（Ik et al，1997）。本研究中，為適應(yīng)缺氮脅迫，藻細(xì)胞DNA在0～24 h期間發(fā)生甲基化的位點(diǎn)多于去甲基化位點(diǎn)，表明激活表達(dá)的基因（如蝦青素合成途徑中相關(guān)基因）少于被抑制的基因，缺氮脅迫更多地抑制了基因的表達(dá)。王小利等（2015）發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺氮處理后高羊茅甲基化率高于去甲基化率，表明高羊茅適應(yīng)缺氮脅迫時(shí)，除激活抗逆基因的表達(dá)外，更涉及沉默部分基因的表達(dá)。本研究缺氮脅迫24～72 h期間，發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)多于甲基化位點(diǎn)，以去甲基化為主，此時(shí)蝦青素積累速度緩慢，可能隨蝦青素不斷積累，相關(guān)基因陸續(xù)啟動(dòng)，發(fā)生去甲基化而被激活?？梢?，缺氮脅迫下的蝦青素積累與基因組DNA甲基化相關(guān)，通過甲基化和去甲基化的方式調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響蝦青素的合成。

參考文獻(xiàn)：

AMBATI RR， PHANG SM， RAVI S， et al， 2014. Astaxanthin： sources， extraction， stability， biological activities and its commercial applications—a review [J]. Mar Drugs， 12（1）： 128-52.

BOROWITZKA MA， HUISMAN JM， OSBORN A， 1991. Culture of the astaxanthin-producing green alga Haematococcus pluvialis. 1. Effects of nutrients on growth and cell type [J]. J Appl Phycol， 3（4）： 295-304.

CHEN XC， HUANG WG， OUYANG Q， 2005. The study of culture conditions of Haematoccus pluvialis and its astaxanthin accumulation [J]. J Fuzhou Univ （Nat Sci Ed）， 33（2）：259-263. [陳興才， 黃偉光， 歐陽(yáng)琴， 2005. 雨生紅球藻的培養(yǎng)及蝦青素累積條件的探討 [J]. 福州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 33（2）：259-263.]

CHEN XF， YAN XJ， 2007. Comparative analysis of quantitation of astaxathin in Haematococcus pluvialis [J]. J Ningbo Univ （Nat Sci Eng）， 20（4）： 441-445. [陳曉飛， 嚴(yán)小軍， 2007. 紅球藻蝦青素含量測(cè)定方法的探討 [J]. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版）， 20（4）： 441-445.]

CHEN YJ， YAN QW， ZHANG L， et al， 2013. Research progress on nitrogen and plant growth [J]. J NE Agric Univ， 44（4）：144-148. [陳雅君， 閆慶偉， 張璐， 等， 2013. 氮素與植物生長(zhǎng)相關(guān)研究進(jìn)展 [J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 44（4）：144-148.]

DUAN LF， GUAN B， KONG Q， et al， 2017. Effects of different culture modes oc green growth and astaxanthin accumulation by Haematococcus pluvialis [J]. Trans Oceanol Limnol， 1：73-79. [段良飛， 管斌， 孔青， 等， 2017. 不同培養(yǎng)模式對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞綠色生長(zhǎng)以及蝦青素積累的影響 [J]. 海洋湖沼通報(bào)， 1：73-79.]

FAN Y， YU GX， WANG LN， et al， 2012. Cloning and prokaryotic expression of the plastoglobules protein gene from Haematoccus pluvialis [J]. Acta Hydrobiol Sin， 36（4）：640-645. [范勇， 于廣欣， 汪樂霓， 等， 2012. 雨生紅球藻質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆與原核表達(dá) [J]. 水生生物學(xué)報(bào)， 36（4）：640-645.]

GAO D， DU F， ZHU YY， 2009. Low-background and high-resolution contracted silver-stained method in polyacrylamide gels electrophoresis [J]. Hereditas， 31（6）：668-673. [高東， 杜飛， 朱有勇， 2009. 低背景、高分辨率PAGE簡(jiǎn)易銀染法 [J]. 遺傳， 31（6）：668-673.]

GRIFFITHS MJ， HARRISON STL， 2009. Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production [J]. J Appl Phycol， 21（5）： 493-507.

HIROOKA S， HIGUCHI S， UZUKA A， et al， 2014. Acidophilic green alga Pseudochlorella sp. YKT1 accumulates high amount of lipid droplets under a nitrogen-depleted condition at a low-pH [J]. PLoS ONE， 9（9）： e107702.

HUANG LJ， LI Y， FU Y， 2009. Advance in plant DNA methylation and its biological significance [J]. J Baoding Univ， 22（4）：70-72. [黃祿君， 李云， 付毓， 2009. DNA甲基化及其植物生物學(xué)意義研究進(jìn)展 [J]. 保定學(xué)院學(xué)報(bào)， 22（4）：70-72.]

HUANG SY， QI AX， LI Z， et al， 2009. Initial studies on the effects of stress conditions on astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis [J]. Stud Mar Sin， 49：144-150. [黃水英， 齊安翔， 李哲， 等， 2009. 幾種脅迫方式對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素影響的初步研究 [J]. 海洋科學(xué)集刊， 49：144-150.]

IK AK， KOUKALOVA B， OPATRN Z， 1997. Hypermethylation of tobacco heterochromatic loci in response to osmotic stress [J]. Theor Appl Genet， 95（1-2）： 301-306.

JAIME FBREGAS， ANA OTERO， ANA MASEDA， et al， 2001. Two-stage cultures for the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis [J]. J Biotechnol， 89： 65-71.

LI N， ZHANG Y， XIE LN， et al， 2012. Research progress in DNA methylation in plants [J]. Plant Physiol J， 48（11）：1027-1036. [李娜， 張旸， 解莉楠， 等， 2012. 植物DNA甲基化研究進(jìn)展 [J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 48（11）：1027-1036.]

LI XH， ZOU N， SUN DH， et al， 2015. Optimization of productional astaxanthin extraction process from Haematococcus pluvialis [J]. J Anhui Agric， 43（15）：23-24. [李小慧， 鄒寧， 孫東紅， 等， 2015. 雨生紅球藻中蝦青素的提取工藝優(yōu)化 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 43（15）：23-24.]

LIU B， 2013. Methylation sensitive amplification polymorphism （MSAP） analysis of mainly cultivated oyster mushsoom [D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University. [劉冰， 2013. 平菇主栽品種DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）分析 [D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué).]

LIU X， LUO Q， RAKARIYATHAM K， et al， 2016. Antioxidation and anti-ageing activities of different stereoisomeric astaxanthin in vitro and in vivo [J]. J Funct Foods， 25： 50-61.

MA LL， JIANG Z， HUANG XB， et al， 2013. Research progress of DNA methylation on plant regulation [J]. Chin Biotechnol， 33（9）：101-110. [馬浪浪， 江舟， 黃小波， 等， 2013. 植物DNA甲基化調(diào)控研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)生物工程雜志， 33（9）：101-110.]

MAKIO KOBAYASHI， 2003. Astaxanthin biosynthesis enhanced by reactive oxygen species in the green alga Haematococcus pluvialis [J]. Biotechnol Bioproc E， 8： 322-330.

MARTINEZ-DELGADO AA， KHANDUAL S， VILLANUEVA-RODRIGUEZ SJ， 2017. Chemical stability of astaxanthin integrated into a food matrix： effects of food processing and methods for preservation [J]. Food Chem， 225： 23-30.

MENDESFERREIRA A， SAMPAIOMARQUES B， BARBOSA C， et al， 2010. Accumulation of non-superoxide anion reactive oxygen species mediates nitrogen-limited alcoholic fermentation by saccharomyces cerevisiae [J]. Appl Environ Microbiol， 76（24）： 7918-7924.

TANG XM， TAO X， WANG Y， et al， 2014. Analysis of DNA methylation of perennial ryegrass under drought using the methylation-sensitive amplification polymorphism （MSAP） technique [J]. Mol Genet Genom， 289（6）： 1075-1084.

VOS P， HONGERS R， BLEEKER M， et al， 1995. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting [J]. Nucl Acid Res， 23（21）： 4407-4414.

WAN M， ZHANG Z， WANG J， et al， 2015. Sequential heterotrophy-dilution-photoinduction cultivation of Haematococcus pluvialis for efficient production of astaxanthin [J]. Bioresour Technol， 198： 557.

WANG CG， HAN S， CHEN ZQ， et al， 2012. The scavenging of reactive oxygen species with antioxidant systems in Haematococcus pluvialis [J]. Acta Hydrobiol Sin， 36（4）：804-808. [王潮崗， 韓燊， 陳甄倩， 等， 2012. 雨生紅球藻抗氧化系統(tǒng)對(duì)活性氧的清除機(jī)制 [J]. 水生生物學(xué)報(bào)， 36（4）：804-808.]

WANG XL， WANG Q， SHU JH， et al， 2015. Analysis of nitrogen stress on DNA methylation by MSAP in tall fescue [J]. Genom Appl Biol， 34（11）： 2362-2371. [王小利， 王茜， 舒鍵虹， 等， 2015. 氮脅迫下高羊茅基因組DNA甲基化的MSAP分析 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 34（11）：2362-2371.]

XIONG LZ， XU CG， SAGHAI MAROOF MA， et al， 1999. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines， detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique [J]. Mol Gen Genet， 261（3）： 439-446.

XIONG X， LI B， GONG Q， et al， 2017. Analysis of methylation sensitive amplification polymorphsim genome DNA methylation in different barely tissues during development [J]. J Yangtze Univ （Nat Sci Ed）， 14（10）：29-42. [熊肖， 李博， 龔強(qiáng)， 等， 2017. 大麥不同組織成熟過程中DNA甲基化的MSAP分析 [J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 14（10）：29-42.]

ZHAO XY， ZHU HT， BI YP， et al， 2016. Research of astaxanthin in the Haematococcus pluvialis [J]. Food Res Dev， 37（4）：191-194. [趙曉燕， 朱海濤， 畢玉平， 等， 2016. 雨生紅球藻中蝦青素的研究進(jìn)展 [J]. 食品研究與開發(fā)， 37（4）：191-194.]

ZHUANG HR， SHI QQ， LU HS， et al， 2000. The effect of nutritional stresses on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis [J]. Acta Hydrobiol Sin， 24（3）：208-212. [莊惠如， 施巧琴， 盧海聲， 等， 2000. 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響 [J]. 水生生物學(xué)報(bào)， 24（3）：208-212.]