李軍濤　李金寶　冼健安　陳惠琴　張秀霞　鄭佩華　魯耀鵬　王冬梅

李軍濤1，李金寶2，冼健安1，陳惠琴1，張秀霞1，鄭佩華1，魯耀鵬1，王冬梅1*

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；2山東龍昌動(dòng)物保健品有限公司，山東 齊河 251100）

摘要：【目的】明確杜仲（Eucommia ulmoides）葉提取物在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）餌料中的適宜添加量，為研發(fā)高效、無污染、無殘留的對蝦餌料配方提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳苑布{濱對蝦專用餌料為基礎(chǔ)餌料，分別添加0.1、0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg的杜仲葉提取物，進(jìn)行為期6周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，探究餌料中梯度添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦生長性能、免疫相關(guān)酶活性及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響。【結(jié)果】綜合凡納濱對蝦的增重率、存活率和肥滿度3個(gè)指標(biāo)可知，添加0.3 g/kg杜仲葉提取物可有效改善凡納濱對蝦的生長性能和個(gè)體存活率，同時(shí)降低凡納濱對蝦的餌料系數(shù)；隨杜仲葉提取物添加量的增加，凡納濱對蝦的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和酚氧化酶（PO）活性整體上呈先升高后降低的變化趨勢，而丙二醛（MDA）水平的變化恰好相反，綜合各項(xiàng)指標(biāo)也是以0.3 g/kg添加量的效果最佳；梯度添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦肝胰腺無明顯影響，仍保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但其B細(xì)胞數(shù)量明顯增多?！窘Y(jié)論】餌料中添加杜仲葉提取物能有效提高凡納濱對蝦的生長性能和免疫酶活性，并增加肝胰腺中具分泌功能的消化酶細(xì)胞，具有替代抗生素的潛能，實(shí)際生產(chǎn)中的最適添加量為0.3 g/kg。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對蝦；杜仲葉提取物；生長性能；免疫相關(guān)酶活性；肝胰腺

中圖分類號： S966.12； S963.739 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）09-1858-07

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對蝦，是當(dāng)前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一（熊建華等，2011；姜松等，2018）。我國是凡納濱對蝦的主要養(yǎng)殖國，但一直存在蝦苗易發(fā)病、養(yǎng)殖成功率低、缺乏高效功能型配合餌料等問題，致使生產(chǎn)上曾大量不規(guī)范使用抗生素，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來極大隱患。我國經(jīng)濟(jì)正處在轉(zhuǎn)型升級的關(guān)鍵時(shí)期，加上人民群眾消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)已逐漸禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中使用抗生素，因此尋求抗生素替代品成為養(yǎng)殖業(yè)的研究焦點(diǎn)，各類飼料添加劑也由化工型逐步轉(zhuǎn)向中藥型?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】杜仲（Eucommia ulmoides）是國家二級珍稀樹種，名貴滋補(bǔ)藥材，主要以皮入藥，種質(zhì)資源稀缺（馮風(fēng)和梁志榮，1996）。杜仲皮一般需生長15—20年，而葉的資源相對豐富且易得，在發(fā)現(xiàn)其生理功能之前一直被視為廢棄物。近年來，國內(nèi)外專家對杜仲葉的成分（Leiss et al.，2009）及其藥效（李竹等，2004）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物中富含綠原酸、多糖及黃酮等有益成分（李冉等，2016），與杜仲皮的成分類似。以杜仲葉代替杜仲皮的可行性已在臨床、藥理上得到驗(yàn)證（季春，2017），一致認(rèn)為杜仲葉提取物作為飼料添加劑具有不產(chǎn)生耐藥性、基本無毒副作用、資源豐富等特點(diǎn)，具有替代抗生素的潛能，即杜仲葉提取物是一種非常具有開發(fā)價(jià)值的中藥飼料添加劑。在飼料中適量添加杜仲葉提取物對畜禽及魚類的生產(chǎn)性能均有促進(jìn)作用，具體表現(xiàn)為促進(jìn)生長（呂武興等，2005；胡忠澤等，2006；陳敬佳，2017）、增強(qiáng)非特異性免疫（王軼等，2015；段俊紅等，2016）、提高抗應(yīng)激能力（石英等，2008）和抗氧化能力（林建斌等，2015）、改善肉質(zhì)等（孫文通，2017）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】杜仲葉活性成分具有降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒、提高免疫力、清除自由基、抗衰老等功能作用（李燕舞等，2017），但至今有關(guān)杜仲葉提取物對凡納濱對蝦生長性能、免疫功能及肝胰腺功能的影響鮮見研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究基礎(chǔ)餌料中梯度添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦生長性能、免疫相關(guān)酶活性及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響，確定其在凡納濱對蝦餌料中的適宜添加量，為研發(fā)高效、無污染、無殘留的對蝦餌料配方提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

選擇苗場健康的凡納濱對蝦蝦苗培育至體長2.5 cm左右，隨機(jī)分為6組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾蝦，蝦苗初始體重0.193±0.002 g/尾。杜仲葉提取物由山東龍昌動(dòng)物保健品有限公司提供，凡納濱對蝦基礎(chǔ)餌料購自廣東海大集團(tuán)股份有限公司。在基礎(chǔ)餌料中分別添加0.1、0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg的杜仲葉提取物作為試驗(yàn)餌料，配制前先將杜仲葉提取物充分溶解，采用梯度稀釋的方法配制各試驗(yàn)餌料，制好的餌料自然風(fēng)干，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫曃骨绊殞D料解凍至室溫。

1. 2 養(yǎng)殖管理

2017年5—7月在海南寶萊生物科技有限公司蝦苗場進(jìn)行為期6周的養(yǎng)殖試驗(yàn)。采用長×寬×高為50 cm×40 cm×40 cm的養(yǎng)殖箱進(jìn)行養(yǎng)殖，水深25 cm左右，整個(gè)飼養(yǎng)期間保持水質(zhì)穩(wěn)定，水溫28～33 ℃，溶氧量在6.0 mg/L以上，pH 7.8～8.5，氨氮0.02～0.04 mg/L，亞硝酸鹽0.02～0.04 mg/L，鹽度15‰～18‰。每天投喂4次餌料，日投餌量為蝦總重的5%～8%，根據(jù)蝦的攝食情況和水溫進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。每次投喂后40 min利用虹吸管收集殘餌，經(jīng)烘箱70 ℃烘干后記錄投喂量和殘餌量。每2周稱重1次，用以矯正投餌率。

1. 3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，測定各組對蝦體重，記錄對蝦尾數(shù)。每箱隨機(jī)抽取6尾對蝦，測量其體長和體重，抽取血淋巴，在冰盤上解剖分離肝胰臟和腸道并稱重，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 指標(biāo)測定

1. 4. 1 生長性能指標(biāo)

餌料系數(shù)=每缸投喂飼料總量/每缸對蝦總增重量

肥滿度（%）=體重/體長3×100

肝體比（%）=肝胰臟重/體重×100

增重率（%）=（終末蝦體總重-初始蝦體總重）/

初始蝦體總重×100

存活率（%）=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100

1. 4. 2 免疫相關(guān)酶活性指標(biāo) 參照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明測定免疫相關(guān)酶活性。

1. 4. 3 肝胰腺組織切片制作 肝胰腺組織切片委托基爾頓生物科技（上海）有限公司制作。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，利用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較，并采用Origin 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦生長性能的影響

由表1可知，對蝦存活率隨杜仲葉提取物添加量的增加呈先升后降的變化趨勢，其中0.1、0.2和0.3 g/kg組的對蝦存活率均顯著高于未添加杜仲葉提取物的對照組（P<0.05，下同），并以0.3 g/kg組的對蝦存活率最高，為94.44%。0.7 g/kg組的對蝦增重率最低（496.49%），對應(yīng)的餌料系數(shù)（1.940）顯著高于其他試驗(yàn)組。隨杜仲葉提取物添加量的增加，對蝦肥滿度也呈先升后降的變化趨勢，其中0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg組對蝦的肥滿度顯著高于對照組。綜合各項(xiàng)生長性能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物在基礎(chǔ)餌料中的最適添加量為0.3 g/kg。

2. 2 添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦免疫相關(guān)酶活性的影響

2. 2. 1 對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中SOD活性的影響如圖1所示。無論是肝胰腺SOD活性還是血清SOD活性，對照組與各杜仲葉提取物添加組間的差異均不顯著（P>0.05，下同）；血清SOD活性以0.3 g/kg組最高，肝胰腺SOD活性則以0.2 g/kg組最高。

2. 2. 2 對凡納濱對蝦丙二醛（MDA）水平的影響 餌料添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中MDA水平的影響如圖2所示。在對蝦血清中，0.1 g/kg組的MDA水平顯著高于對照組和0.3 g/kg組，其他杜仲葉提取物添加組與對照組間差異不顯著；在對蝦肝胰腺中，0.7 g/kg組的MDA水平顯著高于對照組和其他杜仲葉提取物添加組。

2. 2. 3 對凡納濱對蝦過氧化氫酶（CAT）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中CAT活性的影響如圖3所示。對照組對蝦的血清CAT活性顯著低于0.1、0.2、0.3和0.5 g/kg組，但各杜仲葉提取物添加組間差異不顯著，其中以0.2、0.3和0.5 g/kg組的CAT活性較高，分別為4.23、4.17和4.22 U/mg；在對蝦肝胰腺中，對照組的CAT活性顯著低于各杜仲葉提取物添加組，以0.2 g/kg組的CAT活性最高，達(dá)6.20 U/mg。

2. 2. 4 對凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中GSH-Px活性的影響如圖4所示。在對蝦血清中，對照組與各杜仲葉提取物添加組間差異不顯著，其中以0.2和0.3 g/kg組的杜仲葉提取物添加組較高，分別為66.43和66.38 U；在對蝦肝胰腺中，0.3、0.5和0.7 g/kg組的GSH-Px活性顯著高于對照組，其中又以0.7 g/kg組的最高，達(dá)56.34 U。

2. 2. 5 對凡納濱對蝦酚氧化酶（PO）活性的影響 餌料添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦血清PO活性的影響見圖5。隨杜仲葉提取物添加量的增加，對蝦血清PO活性呈先增加后降低的變化趨勢，以0.3 g/kg組的PO活性最高，達(dá)3.77 U/mg，顯著高于對照組和0.7 g/kg組。

2. 3 餌料添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可看出，對照組與各杜仲葉提取物添加組對蝦肝胰腺組織細(xì)胞均保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)肝胰腺壞死癥狀，說明各試驗(yàn)組對蝦的肝胰腺組織基本正常。R細(xì)胞：呈高柱狀，細(xì)胞核位于近基部，呈圓形或橢圓形，有1～2個(gè)核仁，主要功能是吸收和儲(chǔ)存能量。F細(xì)胞：呈高柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形或圓形，核仁明顯，有1～3個(gè)核仁，其功能是吸收營養(yǎng)物質(zhì)和合成蛋白質(zhì)。B細(xì)胞：體積最大且形狀不規(guī)則，胞質(zhì)中含有1～2個(gè)大液泡，占細(xì)胞體積的80%～90%，主要功能是分泌消化酶及消化蛋白質(zhì)。E細(xì)胞：細(xì)胞個(gè)體小，呈多邊形，細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形，有l(wèi)～3個(gè)核仁，其生理功能是分裂和分化為其他類型的肝胰腺細(xì)胞。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，0.2、0.3和0.5 g/kg組對蝦肝胰腺組織中的B細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組和0.1、0.7 g/kg組，說明這3組對蝦的消化酶分泌量較多，與生長性能中的增重率變化趨勢一致。其他幾種細(xì)胞增加的數(shù)量不明顯。

3 討論

近年來，已有研究證實(shí)杜仲提取物或鮮杜仲可促進(jìn)水生動(dòng)物生長性能提高的物種有鯉魚（Cyprinus carpio）（王華朗等，2003）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）（Liu et al.，2010）、凡納濱對蝦（劉波等，2013）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis H. Milne-Edwards）（季延濱等，2015）等。本研究結(jié)果表明，餌料中添加杜仲葉提取物對凡納濱對蝦增重率、存活率、肥滿度的影響均呈先上升后下降的變化趨勢，未表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，可能與杜仲葉本身的藥用成分有關(guān)，達(dá)到最適添加劑量后繼續(xù)增加反而產(chǎn)生負(fù)作用。綜合這3個(gè)指標(biāo)可知，添加0.3 g/kg杜仲葉提取物可有效改善凡納濱對蝦的生長性能和個(gè)體存活率。此外，在餌料中添加0.3 g/kg杜仲葉提取物能有效降低凡納濱對蝦的餌料系數(shù)，可能與杜仲本身具有保肝護(hù)膽的功效有關(guān)。相對于高等生物，凡納濱對蝦生理構(gòu)造較簡單，其肝胰腺既是解毒免疫器官又是消化器官，與凡納濱對蝦的生長及免疫密切相關(guān)。本研究初步確定杜仲葉提取物能有效提高凡納濱對蝦的生長性能，且以0.3 g/kg的添加量最優(yōu)，但作為綠色無公害的保健型餌料添加劑還需進(jìn)一步探究驗(yàn)證。

邱果等（2008）研究表明，對小鼠注射40 mg/kg的杜仲葉醇提取物可顯著提高其巨噬細(xì)胞的吞噬能力及血清中的溶血素含量，進(jìn)而提高其免疫力；王新軍等（2013）按2.06 g/kg的劑量以杜仲提取物對運(yùn)動(dòng)大鼠進(jìn)行灌胃，6周后大鼠肝臟的T-AOC、T-SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著高于對照組（灌胃生理鹽水），即杜仲提取物可有效保護(hù)大鼠肝臟組織的抗氧化能力。在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中，杜仲提取物主要作為飼料添加劑使用。如在彭澤鯽（Carassius auratus var. pengze）餌料中添加1500 mg/kg杜仲提取物后其NBT陽性細(xì)胞、溶菌活力和抗菌活力較對照組明顯升高（姚紅梅，2005）；投喂添加杜仲提取物的餌料可有效提高斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）抗白斑病毒的能力（Balaubramanian et al.，2008）；在草魚（Ctenopharyngodon idellus）餌料中添加4%杜仲葉粉和0.10%、0.15%杜仲葉提取物均能極顯著提高SOD活性（P<0.01）（冷向軍等，2008）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨杜仲葉提取物添加量的增加，凡納濱對蝦的SOD、CAT、PO和GSH-Px活性整體上呈先升高后降低的變化趨勢，而MDA水平恰好相反，綜合各項(xiàng)指標(biāo)以0.3 g/kg組的效果最佳，可能是杜仲葉提取物中含有的綠原酸、丁香脂素雙糖苷、地普黃酮等有效成分具有殺菌抑菌和抗氧化作用，能消除動(dòng)物體內(nèi)過多的自由基，從而提高機(jī)體的非特異性免疫。

本研究以添加杜仲葉提取物的餌料投喂凡納濱對蝦，結(jié)果表明，對照組和各杜仲葉提取物添加組對蝦肝胰腺組織細(xì)胞均保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)肝胰腺壞死癥狀，能保證個(gè)體生長發(fā)育的需求。0.2、0.3和0.5 g/kg組對蝦肝胰腺組織中的B細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組和0.1、0.7 g/kg組。B細(xì)胞作為消化酶分泌的功能性細(xì)胞，其數(shù)量增加標(biāo)志著添加杜仲葉提取物后對蝦肝胰腺的消化吸收能力明顯增強(qiáng)。但與免疫和分化相關(guān)的R細(xì)胞、F細(xì)胞、E細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的增加或減少，可能是生理狀態(tài)處于正?；蜻m宜條件下這些細(xì)胞未得到生態(tài)環(huán)境變化的足夠刺激時(shí)無法顯示出來。但在集約化的高密度養(yǎng)殖模式中，養(yǎng)殖環(huán)境通常隨自然環(huán)境和養(yǎng)殖密度的改變而發(fā)生變化，因此對蝦肝胰腺組織中R細(xì)胞、F細(xì)胞和E細(xì)胞的變化規(guī)律還需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

4 結(jié)論

餌料中添加杜仲葉提取物能有效提高凡納濱對蝦的生長性能和免疫酶活性，并增加肝胰腺中具分泌功能的消化酶細(xì)胞，具有替代抗生素的潛能，實(shí)際生產(chǎn)中的最適添加量為0.3 g/kg。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）