姚宗理　吳清來　 柯健　黃冠　杜曉英　李俊凱

摘要： 為進(jìn)一步研究和開發(fā)新植物源農(nóng)藥，拓寬龍須藤（Bauhinia championii）的生物活性研究，探索其不同組分潛在的殺菌和除草活性，該研究通過常溫冷浸提取法提取、真空濃縮得到甲醇提取物。結(jié)果表明：用硅膠柱層析分離純化，經(jīng)TLC檢識和碘缸顯色后整合得到9個組分。反復(fù)重結(jié)晶7號和8號組分中析出的物質(zhì)，經(jīng)TLC檢識和測熔點(diǎn)，得到1個純化合物，編為33號，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析與molbase庫對照，鑒定該化合物為（1R， 2S， 3S， 4S， 5S， 6S）-6-甲氧基-1， 2， 3， 4， 5-環(huán)己烷五醇，是一種重要的工業(yè)原料。殺菌和除草活性試驗結(jié)果顯示，粗提物在1 000 μg·mL-1時對水稻稻瘟病菌的抑制率為（40.84±1.00）%，對稗草根的抑制率為（49.18±2.33）%；各組分在500 μg·mL-1時，4號組分對水稻稻瘟病菌的抑制率達(dá)到（44.19±0.76）%， 2號和3號組分對稗草根的抑制率分別為（88.92±1.31）%和（90.99±1.45）%，3號和6號組分對馬齒莧根的抑制率分別為（72.06±1.31）%和（89.92±1.73）%。這表明龍須藤葉提取物對水稻稻瘟病菌、稗草根和馬齒莧根有良好的抑制效果，可進(jìn)一步分離2號、3號、4號、6號組分，以獲得高活性的單體化合物。

關(guān)鍵詞： 龍須藤， 生物活性， 甲醇提取物， 分離純化， 單體化合物

中圖分類號： Q946， O629.2， S482.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0886-08

Abstract： Bauhinia championii， a traditional Chinese herbal medicine， has effects on anti-inflammatory， analgesic， eliminate free radicals， anti-bacterial， anti-tumor and so on. In order to further broaden the potential fungicidal and herbicidal activities of different constituents of B. championii， we attempted to dry and smash B. championii leaves and used methanol to extract for three times at the normal temperature. Crude extract was separated and purified on silica gel column chromatography. A bottle of fraction was collected every 200 mL， according to TLC detection and iodine cylinder integration， the crude extract was separated into nine constituents. The precipitated material in constituents No. 7 and No. 8 were recrystallized repeatedly， and melting points were confirmed and measured by pointing GF254 silica gel plate. One pure compound was obtained and named No. 33. Based on data analysis and compared with molbase library， this compound was identified as 1-D-4-O-methyl-myo-insitol， an important industrial raw material. The test results of fungicidal and herbicidal activities showed the crude extract of B. championii leaves to inhibition rate of Pyricularia oryae was （40.84±1.00）% at 1 000 μg·mL-1 ， and inhibition rate of Echinochloa crusgalli roots was （49.18±2.33）%. When the constituents were at 500 μg·mL-1， No. 4 constituent of Pyricularia oryae inhibition rate reached （44.19±0.76）%， inhibition rate of No. 2 and No. 3 constituents on Echinochloa crusgalli roots were （88.92±1.31）% and （90.99±1.45）%， respectively； inhibition rate of No. 3 and No. 6 constituents on Portulaca oleracea roots were （72.06±1.31）% and （89.92±1.73）%， respectively. The results indicate that the extract of Bauhinia championii leaves have a certain amount of inhibitory effects on Pyricularia oryae， Echinochloa crusgalli roots and Portulaca oleracea roots. In order to acquire high activity monomer compounds， the constituents of No. 2， No. 3， No. 4 and No. 6 can be further separated.

Key words： Bauhinia championii， biological activity， methanol extracts， separation and purification， monomer compounds

龍須藤（Bauhinia championii）又稱九龍?zhí)?、梅花入骨丹、羊蹄藤、烏郎藤、過崗圓龍等，系雙子葉植物豆科羊蹄甲屬植物多年生藤（封錫志等，2000），分布于廣東、湖南、湖北、江西、福建、浙江、貴州、廣西等地，生長于海拔200～1 000 m的地區(qū)（全國中草藥匯編編寫組，1996），含黃酮類（Frances & Margaret， 1969； Vecchietti et al， 1979； Nonaka et al ，1982； Chen et al， 1984； 張玉琴等，2013）、芳香酸類（白海云等，2004）、黃烷醇類（徐偉等，2009）、甾醇類（Peng & Chen，2001； 白海云等，2005； 徐偉等，2013）、萜類（葉蕻芝等，2009）、糖類（汪艷娟等，2001； 蔡亮亮，2013）等，具有抗細(xì)菌（洪振豐等，2007）、抗炎鎮(zhèn)痛（易荊麗等，2012； Xu et al， 2013； Cai et al， 2013； 林麗微等，2014）、抗腫瘤（葉蕻芝等，2011）、消除自由基（高杰等，2011； 林煒鑫，2013）、抗血小板凝集（胡娟等，2007）、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（竇錫彬等，2006； 王柏燦，2008； 龐宇舟等，2013）、祛風(fēng)除濕（江蘇新醫(yī)學(xué)院，1986）、治療胃脘痛（黃耀奎等，2005）等功效，可用于治療腸胃疾?。ü诤拖圄旈}，2001）、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腰腿痛（方鼎，1985；魏衡生和祁芝云，1998； 黃兆勝，2003）等，是一種重要的中藥材，但龍須藤周圍極少有真菌和雜草生長，筆者推測可能在龍須藤中還有抑制真菌和雜草生長的活性化合物。因此，本課題組對龍須藤的甲醇提取物進(jìn)行初步的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性測定，初步確定龍須藤葉具有一定的殺菌和除草活性。

1材料與方法

1.1 供試材料、試劑和儀器

1.1.1 供試材料龍須藤葉，于2017年2月采自廣西賀州市信都鎮(zhèn)聯(lián)盟村民黎山西北坡，由中科院武漢植物園江明喜研究員鑒定為豆科羊蹄甲屬植物龍須藤（Bauhinia championii）。

1.1.2 供試菌種和雜草種子水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryae）等病原菌和油菜種子（Brassica napus seed）、稗草種子（Echinochloa crusgalli seed）、馬齒莧種子（Portulaca oleracea seed）等供試植物種子由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)教研組提供。

1.1.3 供試試劑甲醇（AR）、吐溫-80（CP）、石油醚（AR）、氯仿（AR）、乙酸乙酯（AR）、 N，N-二甲基甲酰胺（DMF，AR）、丙酮（AR），均為市售商品。

1.1.4 主要儀器200～300目硅膠（青島譜科分離材料有限公司）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DLF-18型流水式中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；A-1000S型水流抽氣機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）；ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；ES-315型高壓滅菌鍋（TOMY KOGYO CO.，LTD）；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；QT型超聲波清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）； DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；SPX-250型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；BIC-400型人工氣候箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Yanagimoto MFG.熔點(diǎn)測定儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司，溫度計未校正）；核磁共振儀（Bruker Avance DPX400，Bruker公司）；傅立葉變換高分辨質(zhì)譜儀（Bruker APEX IV，Bruker公司）。

1.2方法

1.2.1 粗提物的制備參考凌冰等（2008），在室溫下，將陰干的龍須藤葉片用流水式中藥粉碎機(jī)粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，取300.00 g過篩的葉片粉末用95%甲醇常溫浸提3次，料液比為1∶10，浸提時間依次為5、3、1 d， 合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃減壓濃縮，回收甲醇，獲得甲醇粗提物浸膏。

1.2.2 分離純化取粗提物50.00 g，用少量甲醇熱熔后，與50.00 g硅膠（200～300目）充分拌勻、晾干，裝入硅膠層析柱（6.00 cm×80.00 cm，200～300目硅膠400.00 g），依次用乙酸乙酯∶石油醚（0∶1～1∶0）、100%乙酸乙酯、氯仿∶甲醇（0∶1～1∶0）和100%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，各梯度溶劑為3 000 mL，每200 mL為1個組分收集洗脫液， 50 ℃減壓濃縮，GF254薄層層析硅膠板展開， 254 nm紫外熒光儀下檢識或碘缸顯色，合并Rf值相同的組分，獲得9個組分。對7號和8號組分中析出的物質(zhì)，用少量甲醇熱熔，反復(fù)重結(jié)晶，TLC檢識整合和熔點(diǎn)測定，獲取純化合物，標(biāo)記33號。

1.2.3 藥液的配置分別稱取0.50 g龍須藤葉粗提物和0.25 g各組分于15 mL棕色樣品瓶中，用丙酮并用超聲波清洗器助溶，在超凈工作臺中用含0.1%吐溫-80的無菌去離子水定容至50 mL，粗提物配成10 000 μg·mL-1溶液，各組分配成5 000 μg·mL-1溶液，用于殺菌和除草活性測定。

1.2.4 殺菌活性試驗采用離體平皿培養(yǎng)法（陳小霞等，2007），用PDA培養(yǎng)基，以供試病原菌為對象，對所浸提的粗提物進(jìn)行殺菌活性測定，培養(yǎng)基中供試提取物組分濃度為1 000 μg·mL-1。接上病原菌菌餅后于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以等量的丙酮和含0.1%吐溫-80的無菌去離子水作為對照，每處理重復(fù)3次。當(dāng)對照組的菌落長至培養(yǎng)皿底部3/4面積時用十字交叉法（張建寧，2015）測量菌落直徑，通過以下公式計算抑制率。

對照組菌落生長直徑-處理組菌落生長直徑對照組菌落生長直徑

1.2.5 除草活性試驗用種子生物測定法（徐江艷，2013），將供試種子催芽后挑選發(fā)芽勢相同的種子放于鋪有中速濾紙的90 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15粒，每皿加藥液5 mL。以等量的丙酮和含0.1%吐溫-80的無菌去離子水作為對照，每處理重復(fù)3次，置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)置溫度28 ℃，濕度80%，光照度1 100 lx，光照時間為14 h·d-1，培養(yǎng)4～5 d后測量根長和芽長，計算相對抑制率。

2結(jié)果與分析

2.1 粗提物的提取率與分離純化

采用上述提取方法，300.00 g龍須藤葉浸提得到85.73 g膏狀物，提取率為28.58%。根據(jù)文獻(xiàn)報道（馬力，2010），影響提取率的因素可能與溶劑濃度、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度及植物生長時期有關(guān)。50.00 g經(jīng)硅膠柱層析分離后共回收樣品30.71 g，回收率61.42%，結(jié)果見表1。影響回收率的因素可能跟層析柱的種類、樣品的極性、過柱時間有關(guān)。

2.2 純化合物結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)過反復(fù)重結(jié)晶，獲得的化合物的波譜數(shù)據(jù)如下：

化合物33白色固體；mp 182.5～183.3 ℃； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d）： δ 9.01 （s， 1H）， 7.94 （d， J = 9.6 Hz， 2H）， 7.14 （d， J = 16.8 Hz， 2H）， 6.32 （d， J = 9.6 Hz， 2H）， 5.39 （s， 1H）， 5.15 （dd， J = 4.4， 5.2 Hz， 2H）， 4.93 （d， J = 7.2 Hz， 1H）， 4.67（t = 10.8 Hz， 1H），3.76～3.73（m， 1H）， 3.50～3.44（m， 1H）. 13CNMR （400 MHz， DMSO-d）： 84.24， 73.04， 72.86， 72.41， 71.34， 70.52， 60.13. HRMS計算值 C7H14O6， [M-H]-：193.071 6， 實測值193.071 8。經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析與molbase庫對照，鑒定該化合物為（1R， 2S， 3S， 4S， 5S， 6S）-6-甲氧基-1， 2， 3， 4， 5-環(huán)己烷五醇。該化合物為工業(yè)重要原料。

2.3 殺菌活性試驗結(jié)果

測定了甲醇粗提物（1 000 μg·mL-1）、化合物33（500 μg·mL-1）以及9個柱層析組分（500 μg·mL-1）對供試病原菌的生物活性，結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，龍須藤粗提物對部分供試病原菌有一定的抑制效果，對水稻稻瘟病菌的抑制效果最佳，抑制率達(dá)到（40.84±1.00）%；將提取物按照極性從小到大分成的9個組分中，4號組分對所有的供試病原菌都有一定的抑制活性，對水稻紋枯病菌和水稻稻瘟病菌的抑制效果最佳，分別達(dá)到（36.26±0.76）%和（44.19±0.76）%，可初步確定有殺菌活性的成分集中在該組分。

2.4 除草活性試驗結(jié)果

用種子生物測定法將供試種子催芽后挑選發(fā)芽勢相同的種子進(jìn)行除草活性測定，測量其根、芽生長指標(biāo)，計算相對抑制率，結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，龍須藤粗提物對所有供試種子根長都有抑制效果，對稗草根的抑制效果最佳，抑制率達(dá)到（49.18±2.33）%， 2號和3號組分對稗草根的抑制效果最好，抑制率分別達(dá)到（88.92±1.31）%和（90.99±1.45）%；3號和6號組分對馬齒莧根抑制效果最好，抑制率分別達(dá)到（72.06±1.31）% 和（89.92±1.73）%?？沙醪酱_定具有除草活性的成分主要集中在2號、3號和6號組分中。

3討論與結(jié)論

龍須藤具有廣泛的醫(yī)藥活性，目前主要集中在抗細(xì)菌（洪振豐等，2007）、抗炎鎮(zhèn)痛（易荊麗等，2012； Xu et al， 2013； Cai et al， 2013； 林麗微等，2014）、抗腫瘤（葉蕻芝等，2011）、消除自由基（高杰等，2011； 林煒鑫，2013）和抗凝血（夏俊偉等，2016）等方面研究，在抗真菌和除草活性方面的研究卻鮮有報道。本研究首次對龍須藤葉粗提物進(jìn)行常見作物病原真菌和除草活性測定，結(jié)果表明龍須藤葉粗提物對水稻稻瘟病菌菌絲生長和稗草萌芽都具有良好的抑制效果。為進(jìn)一步鎖定粗提物的活性成分，對龍須藤葉粗提物進(jìn)行了柱層析分離純化，根據(jù)洗脫溶劑極性分段收集，經(jīng)TLC檢識和碘缸顯色熏蒸后整合得到9個組分和1個純化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析與molbase庫對照，鑒定該化合物為（1R，2S，3S，4S，5S，6S）-6-甲氧基-1，2，3，4，5-環(huán)己烷五醇，該化合物是一種重要的工業(yè)原料。通過對分段收集的9個組分抗真菌和除草活性測定，結(jié)果表明所有組分均具有殺菌活性，其中 4號組分對水稻稻瘟病菌的抑制效果最好，說明具有最佳殺菌活性的化合物集中在該組分，推測該化合物對水稻稻瘟病菌所在屬的其他致病菌可能也有相當(dāng)?shù)囊种谱饔?，有待進(jìn)一步研究。2號和3號組分對稗草根的抑制效果最好，具有開發(fā)成針對單子葉雜草除草劑的潛能；3號組分對馬齒莧根同樣表現(xiàn)出良好的抑制效果，說明3號組分對單子葉植物和雙子葉植物雜草均具有良好的抑制效果，具有開發(fā)成廣譜性除草劑的潛能；6號組分對馬齒莧根的抑制效果最好，具有開發(fā)成針對雙子葉雜草除草劑的潛能。

本研究初步鎖定了高活性化合物所在組分，結(jié)果表明龍須藤葉提取物對水稻稻瘟病菌、稗草根和馬齒莧根有良好的抑制效果，后期工作可對2號、3號、4號和6號三個組分進(jìn)一步分離純化，并通過結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性測定獲得高活性的單體化合物，研究結(jié)果可為龍須藤作為新植物源農(nóng)藥的進(jìn)一步研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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