黃嵐珍　楊飛城　陽晶　蔣曉山

摘要： 為進一步探討莪術(shù)醇的誘導細胞衰老的機制，該研究采用熒光定量PCR技術(shù)對莪術(shù)醇處理后細胞中 81 個細胞衰老相關(guān)基因差異表達譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP53及其下游基因p16Ink4a、p21Waf1/Cip1和p27Kip1等的表達水平顯著升高，伴隨ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等多個衰老信號通路啟動與效應(yīng)關(guān)聯(lián)基因的轉(zhuǎn)錄顯著增強，而Cyclin A2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等細胞周期進程與衰老信號通路的負性調(diào)控基因的表達水平則顯著降低。Western印跡檢測結(jié)果顯示，p53及其下游周期素依賴性蛋白激酶抑制物（CKI）分子p21WAF1和p16INK4水平升高，Cyclin A2水平降低，與PCR結(jié)果一致，并伴野生型p53-誘導的蛋白磷酸酶1（Wip1）水平顯著增高，提示莪術(shù)醇可能通過激活p53信號通路誘導HepG2細胞衰老。該研究進一步發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇能夠誘導HepG2細胞發(fā)生衰老表型改變，伴G0/G1期周期阻滯。

關(guān)鍵詞： 莪術(shù)醇， 腫瘤細胞早衰， HepG2細胞， 肝癌， 細胞周期阻滯

中圖分類號： Q946文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0894-09

Abstract： In order to further study the antitumor mechanism of curcumol and its potential clinical application， a SYBR Green real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） method was used to analyze the differential expression profiles of 81 human senescence-related genes in human hepatocarcinoma HepG2 cells treated with curcumol. The results showed that the expression of TP53 and its downstream genes p16Ink4a， p21Waf1 / Cip1 and p27Kip1 were significantly up-regulated， accompanied by transactivation of other senescence signaling pathway related genes or senescence response genes such as ABL1， ALDH1A3， CHEK2， HRAS， PTEN， etc.， while the expression of Cyclin A2， IGFBP3， SIRT1 and TERT， the genes which negatively regulated cell cycle progression and senescence signaling， were significantly down-regulated. Western blotting verified that protein levels of p53 and its downstream CKIs， p21WAF1 and p16INK4 increased while Cyclin A2 decreased， consistent with the findings in PCR results. The level of wild-type p53-induced protein phosphatase 1 （Wip1） was also found significantly increased， suggesting that the induction of senescence in HepG2 cells by curcumol might be through activation of p53 signaling pathway. The present study further demonstrates that curcumol is capable of inducing cellular senescent phenotype in HepG2， accompanying with cell cycle G0 / G1 phase arrest.

Key words： curcumol， premature senescence of tumor cells， HepG2 cells， liver cancer， cell cycle arrest

細胞衰老是指細胞從活躍增殖進入生長停滯狀態(tài)的不可逆轉(zhuǎn)過程。衰老的細胞仍具有基本的代謝活動，但失去了DNA合成能力和對有絲分裂原刺激反應(yīng)，細胞脂褐素沉積增加、體積變大扁平、細胞器變形、膜脆性增加、核膜內(nèi)陷、表達在pH6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶。過去，因其無限制增殖的特性，腫瘤細胞被認為失去了衰老的能力。近十多年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在小劑量的化療藥物處理或射線照射等一定條件下可以被誘導進入衰老狀態(tài)，這種誘導性衰老有別于復(fù)制性衰老，被稱為早熟衰老（早衰）（premature/accelerated senescence）（Nardella et al，2011）。尋找誘導腫瘤細胞進入衰老狀態(tài)的藥物或分子靶點，以恢復(fù)與激活腫瘤細胞的衰老通路作為腫瘤治療新策略的研究日益受到重視（Nardella et al，2011；Schosserer et al， 2017）。

莪術(shù)醇（C15H24O2，Curcumol），又名姜黃環(huán)奧醇，是自中藥莪術(shù)中分離得到的單體化合物，對多種人腫瘤細胞增殖具有抑制作用（王耀霞和徐立春，2009； Lu et al， 2012； Huang et al，2017）。我們曾經(jīng)報道，莪術(shù)醇能夠抑制人肝癌HepG2細胞增殖，并顯著影響細胞周期及其相關(guān)調(diào)控基因的表達（黃嵐珍等，2013）。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，較低劑量莪術(shù)醇能夠誘導HepG2細胞發(fā)生衰老表型改變，并對 81 個細胞衰老相關(guān)基因差異表達譜及主要啟動調(diào)控分子表達水平進行了初步觀察，為進一步探討莪術(shù)醇抗腫瘤作用機制及其潛在的臨床應(yīng)用提供了有價值的信息。

1材料

1.1 主要試劑與儀器

試劑：莪術(shù)醇（純度≥98%，上海艾匯生物科技公司，生產(chǎn)批號 P02-03）50 mg·mL-1溶于無水乙醇貯存；碘化丙啶（PI） （Sigma）；二甲基亞砜（DMSO） （美國Sigma）；四氮唑藍（MTT） （美國Amresco）；兔抗人 p53多抗及鼠抗人 p16、Wip1、p21及 β-actin 單抗（美國Santa Cruz）。儀器：FACSAriaⅢ流式細胞儀（美國BD）；iMark 型酶標儀（美國Bio-Rad）；CO2 細胞培養(yǎng)箱（美國NBS）。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院細胞所（上海）細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清（美國HyClone）的DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone）含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，每 3～4 d 換液傳代。

2方法

2.1 MTT 比色法檢測細胞增殖

將人肝癌HepG2細胞以每孔4×103個接種于 96 孔板，培養(yǎng)過夜。更換成含不同濃度莪術(shù)醇的培養(yǎng)液[均含等體積乙醇（vehicle）]每孔100 μL，于預(yù)定時間每孔加入MTT 10 μL，37 ℃孵育 4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，避光振蕩 20 min，酶標儀測定OD490 值（A），實驗重復(fù) 3 次。細胞生長抑制率計算：抑制率（%）= [1-（A 實驗組/A對照組）]×100。IC50值由SPSS （version 20.0）軟件計算得出。

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

HepG2細胞于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 5 d，使大部分細胞停留在G1期。取經(jīng)細胞周期同步化的細胞，以 每個皿5×105 個接種于 Ф 60 mm 培養(yǎng)皿中，20 h 后更換成含不同濃度莪術(shù)醇的培養(yǎng)液（均含等體積乙醇）；分別于 16、24、32 h常規(guī)消化收集細胞，70% 乙醇固定， 1% RNA酶處理、PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期分布（DNA 含量）情況。實驗重復(fù) 3 次。

2.3 細胞衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性檢測

細胞種于 6 孔板，莪術(shù)醇處理24 h，分別于第 7天和第10 天棄培養(yǎng)液。先用PBS洗 1 次， 用0.2% 戊二醛固定 5 min；再用PBS洗 3 次，加入X-gal染液[150 mmol·L-1 NaCl，1 mg·mL-1 X-gal， 5 mmol·L-1 K3Fe（CN）6，2 mmol·L-1 MgCl2， 40 mmol·L-1 NaPi， pH 6.0，5 mmol·L-1 K4Fe（CN）6]，37 ℃孵育 6～24 h。在顯微鏡下，隨機視野計數(shù)藍染的陽性細胞。

2.4 實時熒光定量 PCR 檢測細胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達

委托美國Invitrogen （上海）公司參照SABiosciences公司人類細胞衰老相關(guān)基因的 PCR 陣列中的 84 個基因名錄（http：//www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/HTML/PAHS-050Z.html），設(shè)計、合成基因特異的定量PCR引物。實時熒光定量 PCR（SYBR Green染料法）檢測基因表達水平，參考楊飛城等（2015）的方法，結(jié)果根據(jù)標準曲線由軟件自動計算后得出，共 82 個基因獲得有效擴增（基因名稱與引物序列見表1），GAPDH和ACTB基因用于擴增內(nèi)參及定量標化。

2.5 Western 印跡

收集細胞，RIPA裂解緩沖液 （0.5% 脫氧膽酸鈉，1.0% NP-40，150 mmol·L-1 氯化納， 0.1% SDS，50 mmol·L-1 Tris-pH 8.0， 0.2 mg·L-1 抑肽酶，1 mmol·L-1 苯甲基磺酰氟， 0.5 mg·L-1 亮抑蛋白肽酶）冰上裂解， 離心取上清；加入上樣緩沖液， 煮沸 5 min， 經(jīng)SDS-PAGE電泳后半干電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h ，一抗4 ℃ 過夜孵育，TBS-T 洗 3 次，HRP標記的相應(yīng)二抗室溫孵育 1 h，ECL化學發(fā)光法檢測特異蛋白條帶。

2.6 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，重復(fù)測量資料方差分析，樣本兩兩比較進行 LSD-t 檢驗。

3結(jié)果與分析

3.1 莪術(shù)醇對HepG2細胞增殖及細胞周期的影響

用不同濃度（0～1 000.0 mg·L-1）的莪術(shù)醇分別處理人肝癌HepG2細胞 48 h 及 72 h，用MTT法檢測細胞活力并計算莪術(shù)醇的IC50。如圖1：A所示，莪術(shù)醇對HepG2細胞增殖活性具有顯著抑制作用，呈時間和劑量依賴性，48 h 及 72 h 的IC50分別為529.5 mg·L-1 和 173.5 mg·L-1。 為進一步觀察莪術(shù)醇對HepG2細胞增殖的長時間影響，先以無血清培養(yǎng)液同步化HepG2細胞，然后采用 25 mg·L-1 莪術(shù)醇處理 24 h，更換不含莪術(shù)醇的培養(yǎng)基并于第3天細胞長至 80% 融合時稀釋（1∶4）傳代。分別收集經(jīng)莪術(shù)醇處理 24、72及 120 h 的細胞，乙醇固定、 碘化丙啶（PI ）染色上流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，結(jié)果見圖1：B和圖1：C。與對照組相比，莪術(shù)醇處理 24 h 和 72 h 后G0/G1期細胞分別由 （62.88 ± 4.71）% 和 （66.13 ± 0.83）% 增加到 （69.17 ± 4.44）% 和 （84.31 ± 2.15）%，而S期和G2期細胞相應(yīng)減少，在處理后 120 h 時G1/G0期細胞仍高達 （85.74 ± 5.30）%，對照組為 （65.76 ± 1.52）%，差異有統(tǒng)計學意義，提示較低劑量莪術(shù)醇能夠誘導HepG2細胞長時間的G0/G1期阻滯。

3.2 莪術(shù)醇對HepG2細胞的衰老誘導作用

長時間細胞周期阻滯可能是細胞的衰老反應(yīng)。衰老細胞體積變大扁平，核膜內(nèi)陷，細胞器變形，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶 （SA-β-gal）染色陽性。為檢測莪術(shù)醇處理后HepG2細胞是否發(fā)生衰老表型改變，在前述3.1 細胞周期實驗的基礎(chǔ)上，對莪術(shù)醇（25 mg·L-1）處理后的HepG2細胞分別于第7天和第10天進行SA-β-gal染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)藍染陽性細胞，見莪術(shù)醇處理后細胞呈現(xiàn)大而扁平的改變，7 d和10 d組藍染細胞數(shù)分別為（70.03±8.37）% 和 （87.23±6.89）%； 空白對照組細胞形態(tài)無明顯變化，細胞SA-β-gal檢測藍染率為（2.28 ± 0.73）%～（4.40 ± 1.26）%， 兩組間差異檢驗有統(tǒng)計學意義（P<0.01， 圖2）。

3.3 莪術(shù)醇對 HepG2 細胞衰老相關(guān)基因表達譜的影響

為進一步探討莪術(shù)醇誘導細胞衰老的機制，我們采用SYBR Green實時熒光定量RT-PCR方法篩查莪術(shù)醇處理后HepG2細胞中81個衰老相關(guān)基因差異表達情況并以ACTB基因標化定量分析。結(jié)果顯示， 與對照組（vehicle處理）比較，25 mg·L-1 莪術(shù)醇處理 24 h 后，HepG2細胞中 20 個基因：ABL1、ALDH1A3、ATM、B2M、CALR、Cyclin D1、CD44、CDK2、p21-Cip1、p27-Kip1、p16-Ink4a、p19-Ink4D、TP53、COL3A1、ETS1、HRAS、IFNG、PRLP0、PTEN，表達水平顯著上調(diào)；8 個基因：Cyclin A2、GADD45A、HPRT1、IGFBP3、MORC3、SIRT1、TERT、THBS1，表達水平顯著下調(diào)（圖3，表2）。

3.4 Western 印跡檢測p53蛋白功能

采用 Western 印跡技術(shù)對p53及其下游主要周期素依賴性蛋白激酶抑制物（CKIs）分子的表達水平進行驗證。結(jié)果顯示，經(jīng)莪術(shù)醇處理，HepG2細胞的p53、p21WAF1和p16INK4蛋白水平較對照組顯著升高，Cyclin A2水平顯著降低，與前述PCR實驗檢測該基因mRNA水平下調(diào)的結(jié)果一致。此外，檢測發(fā)現(xiàn)野生型p53-誘導的蛋白磷酸酶1（Wip1）水平顯著增高，結(jié)合p21WAF1的轉(zhuǎn)錄激活，表明p53功能被激活，（圖4）。

4討論與結(jié)論

莪術(shù)醇是從中藥莪術(shù)中分離得到的單體化合物，廣西是我國莪術(shù)的主產(chǎn)區(qū)之一。體外細胞培養(yǎng)和動物實驗表明，莪術(shù)醇能夠抑制肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌等多種腫瘤細胞的增殖與生長，其作用機理可能涉及誘導細胞周期阻滯與凋亡、 抑制細胞核酸代謝、 抑制腫瘤血管生成、 促進注： A. 莪術(shù)醇處理HepG2細胞后第7天和第10天分別行衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化及胞漿藍染 （×400）； B. 三次獨立SA-β-gal染色實驗藍染陽性細胞百分數(shù)的均值±標準差的細胞分化等諸多方面 （王耀霞和徐立春， 2009； Tang et al， 2015），目前對于莪術(shù)醇抗腫瘤的作用機理還缺乏深入研究。我們曾經(jīng)報道，莪術(shù)醇對人肝癌HepG2細胞的增殖具有明顯的抑制作用，該效應(yīng)呈時間和劑量依賴性，與激活p53/pRB通路，抑制Cyclin A基因表達和上調(diào)p21WAF1、p27KIP1、CDK8等基因水平有關(guān)（黃嵐珍等， 2013）。此外，莪術(shù)醇還能夠通過激活p73-PUMA信號通路，誘導p53突變型三陰性乳腺癌MDA-MB 231細胞凋亡（Huang et al， 2017）。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)較低劑量（25 mg·L-1）莪術(shù)醇處理HepG2細胞，誘導G0/G1期周期阻滯，伴細胞體積變大扁平、表達在pH6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶等細胞衰老表型改變，表明莪術(shù)醇具有誘導HepG2細胞早衰的生物學效應(yīng)。

衰老細胞表現(xiàn)為不可逆地細胞周期停滯特征。在哺乳動物中，細胞周期進程存在G1/S期、G2/M期及紡錘體裝配期3個檢查點（check point） ，受到周期素（cyclins）、周期素依賴性蛋白激酶（CDK）和周期素依賴性蛋白激酶抑制物（CKI）的嚴格調(diào)控。CDK通過與相應(yīng)Cyclin形成復(fù)合物而被激活，驅(qū)動細胞周期進程。如Cyclin A1可與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，敲除Cyclin A1基因?qū)е翯1期細胞周期阻滯，Cyclin A2則可以在S期結(jié)合CDK1或CDK2參與G2/M期轉(zhuǎn)換的調(diào)控（Pagano et al， 1992）。Wu et al（2009）研究發(fā)現(xiàn)，植物娃兒藤提取物Tylophorine通過抑制Cyclin A2基因水平誘導HepG2細胞G0/G1期周期阻滯，而Cyclin A2基因過表達則能夠逆轉(zhuǎn)Tylophorine誘導的這一周期阻滯效應(yīng)。另一方面，Cyclin-CDK復(fù)合物的作用受CKI直接控制。CKI分為INK4和CIP / KIP家族兩類。前者主要通過隔離CDK，阻止CDK與Cyclin形成復(fù)合物；后者則可以直接與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，通過抑制CDK的活性對細胞周期進程負向調(diào)節(jié)。本研究采用高通量熒光定量PCR技術(shù)對莪術(shù)醇處理后的HepG2細胞中 81 個衰老相關(guān)基因進行了差異表達譜分析，結(jié)果表明TP53及其下游基因p16 Ink4a、p21 Waf1/Cip1和p27 Kip1等的表達水平顯著升高，伴隨ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等衰老信號通路啟動與效應(yīng)關(guān)聯(lián)基因的轉(zhuǎn)錄顯著增強，而Cyclin A2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等細胞周期進程與衰老信號通路的負性調(diào)控基因的表達水平則顯著降低。通常認為，當細胞內(nèi)DNA受損時，p53即被激活，通過p21或/和p27抑制CDK2和CDK3活性，或激活p16以阻斷CDK4和CDK6與Cyclin的結(jié)合，抑制RB信號通路，阻滯細胞周期于G1/G0期或G2/M期（Terzi et al， 2016； Gire & Dulic，2015）。衰老相關(guān)基因表達譜篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)共計20個基因mRNA水平上調(diào)、8個基因水平下調(diào)，提示莪術(shù)醇誘導細胞衰老涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導機制。本研究中Western blot檢測結(jié)果除證實細胞p16水平升高和Cyclin A2水平降低以外，還顯示p53蛋白及其轉(zhuǎn)錄激活靶分子p21WAF1和野生型p53-誘導的蛋白磷酸酶1（Wip1）的水平顯著增高，提示p53激活可能是莪術(shù)醇誘導HepG2細胞衰老的重要原因，值得探討。

本研究表明，莪術(shù)醇能夠在體外誘導肝癌HepG2細胞早衰，其機制可能是通過活化抑癌基因p53，上調(diào)p21WAF1、p16INK4等CKI分子及PTEN的表達水平，一系列涉及衰老通路關(guān)聯(lián)分子參與，從而誘導細胞周期G0/G1期阻滯來實現(xiàn)的。本研究為進一步探討莪術(shù)醇的抗腫瘤作用機制及其潛在的臨床應(yīng)用提供了有價值的信息。

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