基于ITS的貴州省30個(gè)樹(shù)種的DNA條形碼研究成 宇 蔡莎莎 舒劍鋒 袁 昊 伍 穎 凃 翠 楊 鵬 趙 財(cái)

摘?要：本文對(duì)貴州省19科26屬30種林木樹(shù)種植物ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，用MEGA 5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析序列信息，用最近距離法計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，供試樹(shù)種的DNA總長(zhǎng)度為506～684 bp，其中平均G+C含量為64%，種內(nèi)平均遺傳距離為0.013，種間平均遺傳距離為0.236;基于ITS序列構(gòu)建的聚類樹(shù)顯示，對(duì)30種林木樹(shù)種的鑒定成功率為83%，因此，推薦ITS序列作為林木樹(shù)種DNA條形碼的候選序列。

關(guān)鍵詞：林木樹(shù)種;DNA條形碼;ITS;鑒定

中圖分類號(hào)：R282

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）06-0031-05?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.006

核糖體DNA（nrDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）是位于18S與5.8S間、5.8S與26S間的基因間區(qū)，稱為ITS1和ITS2區(qū)[1-2]。因?yàn)槠溥M(jìn)化速度快、序列變異豐富、提供豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，而被廣泛用于屬間、種間、不同居群間等較低分類階元上的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化研究，能為植物系統(tǒng)分類及鑒定提供參考依據(jù)[3]。

DNA條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)[4-5]，該技術(shù)由加拿大圭爾夫大學(xué)（University of Guelph） 教授Hebert等[6]于2003年首次提出，近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注，已成為生物分類和鑒定的熱點(diǎn)[7]。當(dāng)前，線粒體COI 基因序列已作為通用條形碼在動(dòng)物物種鑒定得到廣泛認(rèn)可[8]，而在植物領(lǐng)域，科學(xué)家分別提出了ITS2[9]和psbA-trnH[10]、rbcL[11]、matK[12]、trnL[13]等序列片段，以及不同序列組合作為植物DNA條形碼序列，但由于自然界植物種群的復(fù)雜性，仍沒(méi)有找到一種適用于所有類群最理想的DNA通用條形碼[14]。

目前，有關(guān)植物條形碼研究主要集中在中藥材等草本植物及真菌類藥用植物的鑒定，涉及林木樹(shù)種的研究較少。自2010年以來(lái)，Chen等[9]對(duì)4800種6600份藥用植物樣本的psbA-trnH、matK、rbcL、rpoC1、ycf5、ITS2及ITS等 7個(gè)序列，進(jìn)行DNA條形碼序列篩選，首次提出了ITS2作為藥用植物DNA條形碼的候選序列;張嘉麗等[15]對(duì)真菌類藥材馬勃（Lasiosphaeracalvatia）及其混偽品的DNA條形碼研究表明，基于ITS序列的條形碼技術(shù)可以將馬勃藥材及其混偽品有效進(jìn)行鑒別;Tripathi等[16]通過(guò)對(duì)印度熱帶樹(shù)種的DNA條形碼篩選研究表明，ITS序列對(duì)熱帶樹(shù)種的鑒定成功率為24.4%～74.3%;Fladung等[17]對(duì)墨西哥桉屬（Eucalyptus）植物的DNA條形碼研究表明，ITS序列較葉綠體序列能更好的鑒定桉屬植物。為了把DNA條形碼技術(shù)更好的利用在木本植物分類及鑒定中，本文基于ITS序列對(duì)貴州省30種林木樹(shù)種進(jìn)行分類鑒定，30種林木樹(shù)種材料的選取為貴州地區(qū)社會(huì)價(jià)值較高或?yàn)l危物種，旨在為林木樹(shù)種的鑒定及瀕危樹(shù)種的保護(hù)提供分子理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試林木樹(shù)種植物名稱及來(lái)源見(jiàn)表1，30種林木樹(shù)種植物包括 19 科 26 屬。取植株新鮮的葉片作為材料，葉片采下后立刻裝入硅膠干燥，每個(gè)樣品均采集3株以上的植物葉片作為平行樣品且單株間隔在50 m以上。

1.2?DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

基因組DNA的提取參照Doyle等[18]CTAB法并稍作改動(dòng)，ITS序列擴(kuò)增引物參照Wendel等[19]設(shè)計(jì)的通用引物P1：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，P2：5′-TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR擴(kuò)增試劑采用Tiangen公司的2*Taq PCR MasterMix，PCR擴(kuò)增具體程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4 min;94°C變性1 min;53.6°C退火45 s，72°C延伸1min;36個(gè)循環(huán)，72°C延伸7 min，4°C保存。測(cè)序采用雙向測(cè)序，由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

1.3?序列分析及系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

用DNAstar軟件對(duì)正反向序列拼接并手工矯正錯(cuò)誤堿基，用MEGA 5.0軟件對(duì)拼接后的序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建矩陣，并采用最近距離法（K2P nearest distance）計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，用Excel繪制種內(nèi)及種間的遺傳距離頻率分布圖。用MEGA 6.0軟件采用鄰接法（Neighbor Joining，NJ）對(duì)序列構(gòu)建NJ樹(shù)，序列矩陣中所有的堿基同等加權(quán)，空位采用缺失處理，自舉法（Bootstrap）重復(fù)1000次檢驗(yàn)可信度，各分支上的樹(shù)值代表自展支持率。

2?結(jié)果與分析

2.1?PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析

部分林木樹(shù)種PCR擴(kuò)增電泳，PCR產(chǎn)物條帶清晰，擴(kuò)增成功率較好，產(chǎn)物符合ITS序列長(zhǎng)度（600～800 bp）。用MEGA 5.0軟件對(duì)序列分析表明，30種林木樹(shù)種ITS序列總長(zhǎng)度為506～684 bp，有593個(gè)變異位點(diǎn)，555個(gè)信息位點(diǎn)，包括堿基之間的轉(zhuǎn)換和顛換，堿基轉(zhuǎn)換與顛換比為1.11，其中平均G+C含量為64%，由此可見(jiàn)，30種林木樹(shù)種堿基的變異較大。

2.2?種內(nèi)及種間遺傳距離分析

用MEGA 5.0軟件采用K2P模型對(duì)30種林木樹(shù)種的種內(nèi)及種間的遺傳距離分析，結(jié)果表明，種內(nèi)平均遺傳距離為0.013，其中垂柳的種內(nèi)遺傳距離最大（0.199）;種間平均遺傳距離為0.236，其中馬纓杜鵑與露珠杜鵑及大白杜鵑、露珠杜鵑與大白杜鵑、華中櫻與櫻桃之間的遺傳距離均為0，垂柳與女貞之間的遺傳距離最大（0.51）。由此可見(jiàn)，ITS序列在種內(nèi)的遺傳距離都較小，種間的遺傳距離均較大，滿足理想DNA條形碼的要求。

2.3?序列的barcoding gap評(píng)估

通過(guò)對(duì)ITS序列遺傳距離的Barcoding Gap圖可以看出，nrITS序列的Barcoding Gap位置在0.1～0.2之間，種內(nèi)遺傳距離大部分集中在0.02以下區(qū)域，而種間遺傳距離多集中于0.2～0.4之間，種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離存在部分重疊現(xiàn)象，但重疊部分中，兩者所占的比例都不高，由此可見(jiàn)，種內(nèi)與種間的遺傳距離頻率分布差異明顯，滿足理想的DNA條形碼中種內(nèi)遺傳距離小、種間遺傳距離大等特點(diǎn)。

2.4?系統(tǒng)聚類分析

基于nrITS序列對(duì)30種林木樹(shù)種的聚類分析結(jié)果表明，不同種的林木植物總體上能較好的區(qū)分開(kāi)，且同一種林木樹(shù)種的三個(gè)平行都能較好的聚為一支，且自展支持率均高于70%，但杜鵑屬中的馬纓杜鵑、大白杜鵑、羊踟躕以及露珠杜鵑中的部分種混合聚合3支，櫻屬中的華中櫻桃和櫻桃共同聚為一支，不能較好的分開(kāi)，表明基于ITS對(duì)30種林木樹(shù)種的鑒定成功率為83%。

3?結(jié)論與討論

DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是用短的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)[20]，該技術(shù)作為一種分子診斷已被普遍應(yīng)用到物種鑒定[21-22]，其結(jié)果客觀性強(qiáng)且操作較簡(jiǎn)便，大大提高了非專業(yè)人員進(jìn)行物種鑒定的效率和準(zhǔn)確性，成為分類學(xué)家非常有力的工具[23]。理想的條形碼基因片段應(yīng)該滿足以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）種間變異明顯大于種內(nèi)變異;（2）一個(gè)或少數(shù)基因片段即可準(zhǔn)確鑒定物種;（3）重復(fù)性好;（4）穩(wěn)定性高;（5）操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化;（6）有統(tǒng)一的管理平臺(tái)等[24-25]。本研究結(jié)果表明，核糖體ITS序列擴(kuò)增及測(cè)序成功率都高，序列在Genbank中Blast比對(duì)時(shí)對(duì)物種的鑒定成功率較好，且NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能區(qū)分大部分物種，滿足理想的DNA條形碼要求，故推薦ITS序列作為林木樹(shù)種的DNA條形碼候選序列之一。

就遺傳距離而言，本研究中的30種物種的種內(nèi)遺傳距離均很小，種間的遺傳距離總體上都很大，表明ITS在林木樹(shù)種植物的進(jìn)化速率符合種內(nèi)進(jìn)化小、種間進(jìn)化大的要求。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，在杜鵑屬的5種植物中，僅有百合花杜鵑能獨(dú)立聚為一支，而其他4種杜鵑植物共同聚為3支，且種間平行樣本出現(xiàn)交叉現(xiàn)象;同時(shí)在薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus）的華中櫻（Cerasusconradinae）和櫻桃（Cerasuspseudocerasus）兩種植物共同聚為一支，不能區(qū)分開(kāi)，存在的原因可能與物種的鑒定及nrITS基因在該種植物中進(jìn)化速率存在一定的關(guān)系[26]。同時(shí)在30種林木樹(shù)種中同一科的不同植物聚為一支，如木犀科（Oleaceae）的女貞（Ligustrumlucidum）和木犀（Osmanthusfragrans），薔薇科（Rosaceae）中的杏（Armeniaca vulgaris）、枇杷（Eriobotrya japonica）及桃（Amygdaluspersica），槭樹(shù)科（Aceraceae）的三角槭（Acer buergerisnum）和貴州槭（Acer guizhoueuse）都分別聚為一支，支持率均大于90%，表明ITS 序列對(duì)屬級(jí)以上的林木樹(shù)種具有較高的分辨率，且對(duì)物種的系統(tǒng)發(fā)育具有一定的參考價(jià)值。

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