劉李玟韜 楊潔 陳秉樸

〔摘要〕 目的 以高尿酸血癥模型小鼠為研究對(duì)象，探討血清尿酸水平與腎臟組織中鋅-α2-糖蛋白（ZAG）的相關(guān)性，以尋求防治高尿酸血癥的新靶點(diǎn)。方法 將20只SPF級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為模型組和空白對(duì)照組，97%氧嗪酸鉀鹽按0.5 g/（kg·d）腹腔注射，建立高尿酸血癥小鼠模型，造模7 d后，尾靜脈采血檢測(cè)血清尿酸（SUA）水平確定模型建立成功，利用Western Blotting及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腎臟中ZAG mRNA及蛋白水平。結(jié)果 與空白組相比，模型組小鼠腎臟組織ZAG mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 血清尿酸可能影響腎臟ZAG的水平，但是ZAG與尿酸互相影響的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

〔關(guān)鍵詞〕 鋅-α2-糖蛋白；高尿酸血癥；腎臟；小鼠

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R259；R589.7 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.005

〔Abstract〕 Objective To explore the correlation between serum uric acid and kidney zinc-α2-glycoprotein（ZAG） in hyperuricemia mice model， in order to seek a new potential target for prevention and treatment of hyperuricemia. Methods 20 SPF Kunming mice were randomly divided into hyperuricemia model group and control group， 97 % sylvite acid potassium salt of 0.5 g/（kg·d） was injected into the abdominal cavity. The hyperuricemia mice model was confirmed by the serum uric acid （SUA） level 7 days later. The levels of ZAG mRNA and protein were detected by Western blotting and real-time fluorescence quantitative. Results Compared with the blank group， the levels of ZAG mRNA and protein in the kidney tissue in the model group increased， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Serum uric acid may affect the level of ZAG， and the correlation mechanism between ZAG and uric acid needs to be further explored.

〔Keywords〕 zinc-α2-glycoprotein； hyperuricemia； kidney； mice

血液中尿酸（uricemia，UA）濃度超出正常范圍的病態(tài)改變稱(chēng)高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）。正常情況下，血尿酸鹽飽和度為6.7 mg/dL，國(guó)際上HUA診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清尿酸（Serum uric acid，SUA）水平男>420 μmol/L（7 mg/dL），女>357 μmol/L（6 mg/dL））。目前，美國(guó)HUA患病率21%[1]，中國(guó)患病率13%至25%[2]。HUA在許多人類(lèi)疾病如痛風(fēng)、心血管疾病、糖尿病和腎臟疾病的病理生理過(guò)程中起著重要的作用，HUA的防治能控制多種代謝性疾病的發(fā)生。本課題組前期研究結(jié)果表明鋅-α2-糖蛋白（zinc alpha-2 glycoprotein，ZAG）的表達(dá)變化與SUA水平密切相關(guān)[3-4]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討ZAG在HUA模型小鼠腎臟中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種雄性小鼠30只，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量（25±2） g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)證號(hào)：SCXK桂2017-0003，使用證SYXK桂-0004。

1.1.2 試劑與儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司：FastKing RT kit（With gDNASE， Lot#Q5607）、 Buffer RZ（Lot#Q5208）、 Super Real Premix Plus（STBR GREEN， Lot#P5219）、RNAsimple Total RNA Kit（Lot#Q5414）；購(gòu)置Santa Cruz ZAG蛋白一抗（Lot#G1006）：購(gòu)自Santa Cruz小鼠抗β-Actin（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)16AV0212）、山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：127655）；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)L530（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)1-15PK（SIGMR公司），超微量紫外分光光度計(jì)P360，熒光定量PCR儀LightCycler 96，全自動(dòng)酶標(biāo)儀Multiskam MK3（美國(guó)Thermo公司），PRC儀（美國(guó)伯樂(lè)PTC-200），全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司JS-680B）。

1.1.3 動(dòng)物模型復(fù)制方法 20只SPF級(jí)昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（normal uric acid，NUA）、HUA模型組，每組10只。用97%氧嗪酸鉀鹽（尿酸酶抑制劑）按0.5 g/（kg·d）腹腔注射建立HUA小鼠模型[4]，每日1次，連續(xù)7 d。第7天通過(guò)尾靜脈采血檢測(cè)SUA及血脂水平評(píng)判造模是否成功，空白對(duì)照組用等體積生理鹽水腹腔注射。

1.1.4 標(biāo)本采集 造模成功后，采用斷頸法處死各組小鼠，腹部正中切口取腎臟組織，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 在NCBI 上搜索相關(guān)基因，上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成ZAG及GAPDH內(nèi)參引物。ZAG上游引物序列：5'-GTG ACA ACT ACC AGC CGT GT-3'，下游引物序列： 5'-TTG TTG GCC TTG TTC CAG TG-3'，大小107 bp；內(nèi)參基因上游引物序列： 5'-GGT TGT CTC CTG CGA CTT CA-3'，下游引物序列： 5'-TGG TCC AGG GTT TCT TAC TCC-3'，大小138 bp。

1.2.2 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取室溫平衡-80 ℃保存的100 mg小鼠腎臟組織樣本置于研缽中，加入液氮充分研磨至粉末，加1 mL Buffer RZ在15～30 ℃放置5 min分離核蛋白與核酸，低溫離心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無(wú)RNase的離心管中，加氯仿震蕩混勻，室溫靜置5 min，4 ℃離心，取上水相液轉(zhuǎn)移到新管中，然后緩慢加入0.5倍體積無(wú)水乙醇，將得到溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，4 ℃離心，棄廢液，加入500 μL去蛋白液RD低溫離心，棄廢液，加入500 μL漂洗液RW離心，棄廢液（重復(fù)1次），吸附柱放入2 mL收集管中去除殘余液體，充分晾干。于冰上加入適量的RNase-free水溶解4 ℃離心。立刻用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)其mRNA濃度及OD260/OD280比值。取RNA濃度<1 μg/mL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。方法參照天根試劑公司說(shuō)明書(shū)。合成的cDNA置于-20 ℃低溫保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取小鼠腎臟組織總RNA，測(cè)定濃度后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒于熒光定量PCR儀上檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)量。PCR擴(kuò)增后選擇基線(xiàn)，以正常組小鼠為校正對(duì)象，根據(jù)Ct值依次計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，采用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。反應(yīng)體系20 μL，內(nèi)含2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，10 μM 的上下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，其余加無(wú)酶水補(bǔ)足。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 min，變性95 ℃10 s，退火/延伸60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)（熒光定量PCR儀擴(kuò)增）。

1.2.4 Western Blotting技術(shù)檢測(cè)ZAG表達(dá) 碾磨組織，提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度調(diào)整上樣濃度，之后將蛋白變性保存?zhèn)溆?。然后制備SDS-PAGE膠，蛋白上樣，在110V恒壓下進(jìn)行電泳，條帶均勻出現(xiàn)后在300 mA恒流下進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，約1 h。封閉液封閉后4 ℃搖床孵育一抗（濃度1∶500）過(guò)夜，洗膜，加二抗（濃度1∶5 000）室溫孵育1.5 h，再次洗膜后暗室曝光，凝膠圖像系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白灰度值，樣本蛋白含量以目的條帶與內(nèi)參條帶的積分吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“x±s”表示。方差齊時(shí)組間比較采用t檢驗(yàn) ，方差不齊用多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis法，即H值檢驗(yàn)），以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

HUA模型組甘油三酯（TG）及SUA水平明顯高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），HUA模型組總膽固醇（TC）、肌酐（CREA）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）無(wú)明顯升高（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 HUA模型小鼠腎臟ZAG蛋白水平檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟組織ZAG蛋白水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2和圖1。

2.3 HUA模型小鼠腎臟ZAG mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟組織ZAG mRNA水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 高尿酸腎損傷機(jī)制

尿酸是嘌呤衍生物，低級(jí)動(dòng)物體內(nèi)的尿酸氧化酶將尿酸分解為溶于水的尿囊素以排出體外，但人類(lèi)在進(jìn)化過(guò)程中，因尿酸氧化酶基因發(fā)生突變而失活，不能生成尿囊素，只能以尿酸排出體外。人體內(nèi)尿酸2/3經(jīng)腎臟排出，1/3通過(guò)糞便和汗液排出。SUA水平取決于腎小管功能的完整性和腎小管上皮細(xì)胞中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。尿酸通過(guò)直接和間接的方式造成體內(nèi)的各種損傷，同時(shí)有抗氧化和促氧化作用，在肥胖狀態(tài)下則為促氧化作用，可促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）氧化酶的活性及ROS的產(chǎn)生，且尿酸可激活脂肪細(xì)胞的局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Angiotensin-System，RAS）產(chǎn)生活性氧簇（ROS），ROS的產(chǎn)生及尿酸直接或間接使得機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。而細(xì)胞線(xiàn)粒體ROS合成增多，膜電位下降，線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白prohibitin表達(dá)下調(diào)，激活線(xiàn)粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]，同時(shí)也可引起炎癥因子釋放進(jìn)一步增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重。尿酸過(guò)多會(huì)導(dǎo)致一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）降低，抑制一氧化氮釋放[6]，影響血管內(nèi)皮功能。尿酸可導(dǎo)致細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失衡從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。在尿酸產(chǎn)生過(guò)程中，因黃嘌呤氧化酶作用，產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基（O2-），啟動(dòng)自由基生成連鎖反應(yīng)，進(jìn)一步造成組織損傷。這些炎癥因子和炎癥反應(yīng)都可損害腎臟。大量的研究表明，在高尿酸環(huán)境下，尿酸結(jié)晶可通過(guò)阻塞腎小管引發(fā)炎癥反應(yīng)、影響血糖代謝、升高血壓及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等造成腎臟血管、腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)及功能異常[8]。

3.2 模型選擇

靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與人有相似的尿酸代謝途徑，但因價(jià)格昂貴而失去實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)，故現(xiàn)階段常用造模動(dòng)物是嚙齒類(lèi)大鼠、小鼠。♀鼠個(gè)體之間血UA值波動(dòng)較大，考慮與♀鼠激素分泌波動(dòng)有關(guān)。HUA模型復(fù)制主要是干擾嘌呤和尿酸代謝，但直接補(bǔ)充尿酸造模與人原發(fā)性HUA發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制大相徑庭。增加UA前體物質(zhì)雖可使SUA升高，但人類(lèi)因內(nèi)源性嘌呤產(chǎn)生過(guò)多所致的HUA僅占10%～15%，人HUA以腎臟排泄尿酸減少型為主。在造模過(guò)程中，長(zhǎng)時(shí)間SUA升高可反饋性地引起尿酸酶表達(dá)增多與活性升高，連續(xù)給藥一段時(shí)間后SUA不升反降。且長(zhǎng)時(shí)間和大劑量使用抑制UA排泄劑和模型SUA水平顯著升高時(shí)腎損害更加明顯，腎損害既有屬于造模藥物的副反應(yīng)者，也有屬于高尿酸血癥導(dǎo)致的并發(fā)癥，這對(duì)考察造模效果和判斷肯定因素或否定因素存在一定困難[9]。故本實(shí)驗(yàn)以♂小鼠為模型動(dòng)物，采用抑制尿酸排泄法連續(xù)造模7天，造模成功后小鼠腎臟沒(méi)有明顯損害。

3.3 ZAG與高尿酸血癥

脂肪組織可分泌瘦素（Leptin）、脂聯(lián)素（Adiponectin）、血管緊張素原（Angiotensinogen）、抵抗素（Resistin）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（Plasminogen activator inhibitor-1）、白介素-6（Interleukin-6）等，這些統(tǒng)稱(chēng)為脂肪因子，通過(guò)多種途徑參與復(fù)雜的代謝過(guò)程，在HUA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[10]。

1961年，Burgi等[11]最先從人血清中分離得到的一種 43 u的可溶性的能被鋅鹽沉淀并與血漿α2球蛋白的電泳遷移率相似的糖蛋白，故名ZAG。人與小鼠的ZAG在氨基酸序列方面，具有59%的同源性，在與脂代謝密切相關(guān)的特殊區(qū)域有100%的同源性[12]。ZAG大量分布于人和小鼠具有分泌功能的正常上皮細(xì)胞胞漿的白色及棕色脂肪組織中[13]。HUA與代謝綜合征（metabolicsyndrome）的許多因素如肥胖、脂代謝異常、高血壓及胰島素抵抗等密切相關(guān)，常與肥胖、高脂血癥及高血壓病等合并存在[14]。ZAG既然已經(jīng)被確認(rèn)為脂肪細(xì)胞分泌的一種新型脂質(zhì)動(dòng)員因子，必然與脂代謝相關(guān)，研究表明，ZAG mRNA水平與肥胖度和胰島素抵抗參數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與脂聯(lián)素含量呈正相關(guān)，與瘦素mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，重組ZAG能促進(jìn)脂聯(lián)素從人脂肪細(xì)胞釋放[15]。外源性TNF-A和IL-6均能抑制分化成熟的脂肪細(xì)胞中ZAG基因的表達(dá)[16-17]。據(jù)此推測(cè)，ZAG通過(guò)協(xié)調(diào)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和其他脂肪細(xì)胞因子，參與代謝的調(diào)控，影響HUA發(fā)生，也就是說(shuō)HUA狀態(tài)下ZAG的表達(dá)發(fā)生改變。于是，我們開(kāi)展了ZAG和HUA相關(guān)性研究，結(jié)果證實(shí)了HUA小鼠血清ZAG濃度升高， SUA值與ZAG呈正相關(guān)，同時(shí)脂代謝紊亂[3-4]。

3.4 ZAG在腎臟中的表達(dá)

ZAG既然大量存在于具有分泌功能的上皮細(xì)胞組織中，那么腎小管的上皮細(xì)胞組織中同樣會(huì)存在ZAG，當(dāng)腎發(fā)生損害時(shí)，腎臟中的ZAG表達(dá)也會(huì)發(fā)生改變。Gohda等[18]的研究證實(shí)，肥胖糖尿病小鼠模型KK/Ta小鼠肝臟和腎臟組織中ZAG mRNA的表達(dá)比正常BALB/c小鼠增高，比較第8周和第20周時(shí)KK/Ta小鼠腎臟組織中ZAGm RNA水平發(fā)現(xiàn)，隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，ZAG水平進(jìn)一步增高?；贖UA和ZAG都與肥胖糖尿病、脂代謝紊亂相關(guān)，并且高尿酸損害腎臟。因此，有理由推測(cè)在HUA與ZAG相關(guān)及HUA模型腎臟中的ZAG表達(dá)發(fā)生改變。于是，我們前期開(kāi)展了ZAG和HUA相關(guān)性研究，在證實(shí)HUA小鼠血清ZAG濃度升高，SUA值與ZAG呈正相關(guān)[3-4]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展HUA模型小鼠腎臟中表達(dá)變化的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HUA模型組小鼠與空白對(duì)照組小鼠ZAG條帶灰度值對(duì)比，發(fā)現(xiàn)高尿酸小鼠模型腎臟的ZAG是上升的，RT-PCR結(jié)果也表明HUA模型組小鼠腎臟ZAG mRNA水平高于空白對(duì)照組小鼠，表明腎臟細(xì)胞分泌ZAG。可以推測(cè)，腎臟分泌ZAG，同時(shí)在7 d模型小鼠中ZAG表達(dá)上高，且脂代謝代謝紊亂，尤以甘油三酯明顯，表明尿酸可能通過(guò)影響甘油三酯的代謝引起ZAG蛋白的變化，但是ZAG與尿酸互相影響的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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