宋志忠 許建蘭 張斌斌 俞明亮 馬瑞娟

摘要：以霞脆桃為材料，研究了葉面噴施鉀肥對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響及果實(shí)發(fā)育中K+動(dòng)態(tài)平衡與KUP家族基因表達(dá)水平之間的聯(lián)系。結(jié)果表明：噴施鉀肥顯著增加了霞脆桃的鮮質(zhì)量和體積大小，改善了果皮著色指標(biāo)，提高了果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖含量，有效提升了桃果實(shí)品質(zhì)，并有效增強(qiáng)了果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期果肉的鉀素營(yíng)養(yǎng)狀況;桃KT/HAK/KUP家族基因在桃果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平存在差異，Ppe KUP1基因在霞脆桃整個(gè)果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)水平最高，其次是PpeKUP5和PpeKUP3，而PpeKUP14～PpeKUP16在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期均沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)量;PpeKUP1、Ppe KUP2和PpeK UP7在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)噴施鉀肥處理最為敏感，其表達(dá)水平與對(duì)照相比，在第2次果實(shí)膨大期（75 DAFB）至達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（95 DAFB）均顯著增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：桃;果實(shí)發(fā)育;鉀肥;葉面噴施;KT/HAK/KUP家族;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S662.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018） 05-1107-06

鉀是植物細(xì)胞中含量最為豐富的金屬元素之一，在維持細(xì)胞電荷平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，參與光合作用和蒸騰作用等多種生命過(guò)程中起重要作用，是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素。土壤缺鉀影響植物光合作用與葉綠素合成，缺鉀嚴(yán)重將引起植物組織萎縮。果園中，鉀肥施用與花的開(kāi)放、桃果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量及果實(shí)采后貯藏品質(zhì)密切相關(guān)。缺鉀土壤中施用適量鉀肥，能顯著提高果實(shí)可溶性固形物含量，改善糖酸比，提升果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)，并能增加果實(shí)單果質(zhì)量，改善著色指數(shù)以及果頂形狀，提高果實(shí)外觀品質(zhì)。此外，施用鉀肥可顯著改善果實(shí)的抗裂果特性和貯藏運(yùn)輸特性。然而，諸多研究主要集中在生理生化層面，鉀素營(yíng)養(yǎng)與果樹(shù)生長(zhǎng)及果實(shí)發(fā)育過(guò)程中K+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究報(bào)道鮮少。

KT/HAK/KUP家族基因編碼高親和的K+轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，介導(dǎo)植物對(duì)K+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配，維持植物體內(nèi)鉀素營(yíng)養(yǎng)平衡。然而，該家族成員的功能尚未完全清楚，個(gè)別基因的研究多見(jiàn)于模式植物擬南芥。吸收動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明擬南芥AtK UP1介導(dǎo)根部細(xì)胞吸收外界K+，既具有低親和吸附系統(tǒng)（IAS）的特征，又具有高親和吸附系統(tǒng)（HAS）的特征。表觀遺傳學(xué)研究結(jié)果表明AtKUP2、AtKUP4和AtHAK5主要控制根毛區(qū)延長(zhǎng)和細(xì)胞擴(kuò)張，介導(dǎo)根部吸收的K+向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)或分配;AtKUP7介導(dǎo)根部K+的吸收并將吸收的K+運(yùn)輸?shù)侥举|(zhì)部，特別是缺鉀條件下，其將K+從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)作用更顯著。借助生物信息學(xué)分析方法，宋志忠等從葡萄和桃中分別鑒定出18和16個(gè)KUP基因成員。然而，多年生木本植物（尤其是果樹(shù)作物）KT/HA K/K UP家族成員的功能依然未知。

桃[Prunus persica（L.）Batsch]是一種全球重要的水果，隨著基因組序列的公布，迅速成為最具研究潛力的園藝作物之一。本研究分析了鉀肥施用對(duì)霞脆桃生長(zhǎng)指標(biāo)及果實(shí)品質(zhì)的影響，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了果實(shí)發(fā)育中K+動(dòng)態(tài)平衡與KUP家族基因表達(dá)水平之間的聯(lián)系，從分子層面探討鉀肥施用、鉀素營(yíng)養(yǎng)狀況與果實(shí)發(fā)育及品質(zhì)之間的密切關(guān)系，為果樹(shù)施用鉀肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及取樣

供試材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃試驗(yàn)園中的7年生早中熟桃品種霞脆，試驗(yàn)于2015和2016年重復(fù)開(kāi)展，重復(fù)性驗(yàn)證一致，本文展示數(shù)據(jù)源自2015年試驗(yàn)。鉀肥施用處理參照宋志忠等和李靖等報(bào)道的方法。選擇同一田地的2行桃樹(shù)（各6棵，行株距為5mx3m），其中一行為對(duì)照，另一排行進(jìn)行葉片噴施處理。盛花后45d（5月上旬），即桃幼果已成形并將進(jìn)入第1次快速膨大期，對(duì)選定的桃樹(shù)噴施3%（本研究室前期鉀肥預(yù)試驗(yàn)所得的最佳噴施量）的KH2P04溶液，以滴液為度，試驗(yàn)植株按常規(guī)栽培措施管理。果實(shí)樣品采集：從盛花后35d（4月下旬，30DAFB）起，每隔20d取一次樣，至果實(shí)達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（6月底，95 DAFB），共采樣4次，用于基因表達(dá)分析，達(dá)到商業(yè)成熟度的果實(shí)用于果實(shí)品質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 桃果實(shí)生理指標(biāo)測(cè)定

用分析天平測(cè)定果實(shí)單果質(zhì)量，并用游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)的縱徑、橫徑和側(cè)徑。在果實(shí)縫合線兩側(cè)中部用TA.XT.Plus型質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定帶皮果肉硬度，探頭直徑8mm，測(cè)試深度5mm，貫人速度lmm/s。

參照馬瑞娟等的方法，用Color Quest XE色差計(jì)測(cè)定果實(shí)顏色指標(biāo)。其中L4表示顏色的亮度，取值范圍為[1，100];α*、b*表示顏色組分，取值范圍為，α*值為紅綠色差指標(biāo)，b*值為黃藍(lán)色差指標(biāo)。a*/b*值反映果實(shí)的真實(shí)色澤，負(fù)值時(shí)果實(shí)為綠色，零值時(shí)表示果實(shí)顏色由綠色轉(zhuǎn)為黃色或橙紅色，正值時(shí)表示果實(shí)色澤為黃色或橙紅色。

果實(shí)硬度測(cè)定完成后，取測(cè)定硬度的2個(gè)點(diǎn)處果肉的汁液用便攜數(shù)顯折光儀PAL-1測(cè)定果實(shí)的可溶性固形物含量，取2個(gè)點(diǎn)的平均值作為每個(gè)果實(shí)的實(shí)際可溶性固形物含量。果肉勻漿后以702 SM Titrino自動(dòng)電位滴定儀測(cè)定可滴定酸含量，用斐林試劑滴定法測(cè)定可溶性糖含量。

鉀離子含量測(cè)定參照Song等的方法：樣品在105℃中殺青30min.并在65℃烘箱烘烤48h，均勻粉碎后用HNO3-HC104消化過(guò)夜，并通過(guò)石墨高溫消解儀消煮4.5h，定容后用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES）測(cè)定。

1.3 果肉總RNA的提取和熒光定量PCR

利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKa-Ra公司產(chǎn)品）提取果實(shí)樣品的總RNA，并通過(guò)Pri—meScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）合成第一鏈cDNA作為模板，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過(guò)NCBI/Primer-BLAST在線服務(wù)器設(shè)計(jì)桃PpeKUP基因的特異性表達(dá)引物，分別以桃Ubiquitin，基因（GenBank No.KJ598788）和Actin，基因（GenBank No.KP690196）為內(nèi)參，所用引物序列參照Song等的報(bào)道，通過(guò)ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)桃PpeKUP基因在桃花不同開(kāi)放時(shí)期的表達(dá)特征。熒光染料為SYBR Green（TaKaRa公司產(chǎn)品），反應(yīng)體系參照商品說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s：95℃變性5s，58℃退火34s（40個(gè)循環(huán)）;最后72℃延伸10s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析，在鉀肥處理與對(duì)照2個(gè)獨(dú)立桃果實(shí)樣品間進(jìn)行￡檢驗(yàn)（P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平）。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施鉀肥對(duì)桃果實(shí)外觀的影響

桃果實(shí)鮮質(zhì)量隨果實(shí)的發(fā)育而逐漸積累（表1），在盛花后75d（6月上旬，75DAFB）出現(xiàn)第2次果實(shí)膨脹期，在達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（6月底，95DAFB），霞脆桃平均單果質(zhì)量達(dá)到最高（157.76g）。噴施KH2PO4鉀肥顯著提高了不同發(fā)育時(shí)期的桃果實(shí)單果質(zhì)量，在經(jīng)濟(jì)采收期（95DAFB）達(dá)到了178.42g，即顯著提高了15%（表1和圖1）。

桃果實(shí)體積隨著果實(shí)的發(fā)育而逐漸增加，在經(jīng)濟(jì)采收期，霞脆桃果實(shí)的平均縱徑、橫徑和側(cè)徑分別達(dá)到最大值（表1）。與對(duì)照相比，噴施鉀肥顯著提高了不同檢測(cè)時(shí)期平均縱徑和側(cè)徑的長(zhǎng)度（P<0.05），在經(jīng)濟(jì)采收期（95 DAFB）縱徑和側(cè)徑分別提高了11.36%和12.65%，而橫徑?jīng)]有顯著變化（表1和圖1）。

霞脆屬于易著色桃品種，在桃果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中，果皮顏色由綠色逐漸轉(zhuǎn)為紅色。在達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（95 DAFB），桃果實(shí)α*和α*/b*達(dá)到峰值。與對(duì)照相比，噴施KH2PO4鉀肥顯著增強(qiáng)了桃果實(shí)的α*和α*/b*，分別提高了20.97%和15.20%.而對(duì)桃果實(shí)L*值沒(méi)有顯著影響（表2），說(shuō)明噴施鉀肥可能通過(guò)提高果實(shí)的α*和α*/b*值改善果皮色澤和外觀。

2.2 噴施鉀肥對(duì)桃果實(shí)品質(zhì)的影響

果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量和可滴定酸含量等都是影響果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)。在達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（95 DAFB），噴施鉀肥的桃果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖含量相比于對(duì)照分別提高了15.81%和15.20%，而果實(shí)硬度和可滴定酸含量沒(méi)有顯著差異（表3）。

霞脆桃果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期果肉中K+含量存在差異，隨著桃果實(shí)的不斷發(fā)育而逐漸增加，在第2次果實(shí)膨大期（75 DAFB）至達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（95DAFB），K+含量達(dá)到峰值（表4）。在盛花后55d、75d和95d，噴施鉀肥的果肉K+含量與對(duì)照相比分別上升20.26%、16.51%和21.00%。

2.3 桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中KT/HAK/KUP家族基因的表達(dá)特征

在前期研究中，筆者從桃基因組中鑒定并克隆了16個(gè)KUP家族基因。熒光定量PCR分析結(jié)果表明：PpeKUPl～PpeKUP13基因在霞脆果實(shí)中均能檢測(cè)到，且表達(dá)水平差異較大，其中，PpeKUPI基因的表達(dá)水平最高，其次是PpeKUP5和PpeKUP3，其他基因的表達(dá)量相對(duì)較低，而PpeKUP14～Ppe-KUP16基因在霞脆果實(shí)中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)量（圖2）。此外，PpeKUPl～PpeKUP13基因在試驗(yàn)的4個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)類似，均在第1次果實(shí)膨大期（35DAFB）和硬核期（55DAFB）的表達(dá)水平較高，并隨著果實(shí)的不斷發(fā)育和成熟而逐漸降低。其中，PpeKUP1基因在硬核期（55DAFB）最為突出，其表達(dá)水平約為其他PpeKUP基因的5—20倍，說(shuō)明其在果實(shí)發(fā)育初期是尤為重要的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（圖2）。

2.4桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程KT/HAK/KUP家族基因?qū)娛┾浄实捻憫?yīng)

熒光定量PCR結(jié)果表明，PpeKUP1、PpeKUP2和PpeKUP7在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)噴施鉀肥處理較為敏感，PpeKUI的表達(dá)水平在噴施鉀肥后的3次不同檢測(cè)點(diǎn)均顯著上升，而PpeKUP2和PpeKUP7的表達(dá)水平在第2次果實(shí)膨大期（75DAFB）至達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)均顯著增強(qiáng)（圖3），其他基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)水平不受噴施鉀肥影響。

3 討論

K+是植物細(xì)胞中含量最為豐富的陽(yáng)離子之一，鉀是植物正常生長(zhǎng)和發(fā)育必不可缺的品質(zhì)元素，與花的開(kāi)放、果實(shí)發(fā)育、品質(zhì)形成及產(chǎn)量密切相關(guān)。本研究從生理層面分析了噴施鉀肥對(duì)霞脆桃果實(shí)品質(zhì)的影響，結(jié)果表明噴施鉀肥顯著提高了霞脆桃果實(shí)鮮質(zhì)量和果實(shí)大小，改善了果皮著色指標(biāo)，并提高了果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖的含量，提升了果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)。這些結(jié)果與鉀肥施放改善番茄、蘋果、檸檬、獼猴桃、龍眼、蟠桃、油桃和普通桃等果實(shí)品質(zhì)的諸多報(bào)道是一致的。而且噴施鉀肥有效改善了桃果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期果肉的鉀素營(yíng)養(yǎng)狀況，推測(cè)鉀素營(yíng)養(yǎng)狀況的改善，促進(jìn)了果實(shí)縱徑和側(cè)徑發(fā)育，可能是桃果實(shí)鮮質(zhì)量增加的直接因素，也可能是桃果實(shí)品質(zhì)得以改善的因素之一。

果樹(shù)研究中，有關(guān)鉀肥控釋促進(jìn)果實(shí)發(fā)育及其鉀素營(yíng)養(yǎng)的分子基礎(chǔ)研究鮮少。本研究從轉(zhuǎn)錄水平分析桃鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KT/HAK/KUP家族基因在霞脆桃果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)特征及其對(duì)噴施鉀肥的差異響應(yīng)。結(jié)果表明，KT/HA K/KUP家族基因在果實(shí)發(fā)育與成熟不同時(shí)期的表達(dá)水平差異明顯，均在第1次果實(shí)膨大期（35DAFB）和硬核期（55DAFB）的表達(dá)水平較高，表明在桃幼果形成和硬核形成時(shí)期需要更多的KUP轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮作用，以便富集較多的K+參與果實(shí)發(fā)育初期細(xì)胞內(nèi)各種依賴K+的生理過(guò)程，也可能為第2次果實(shí)膨大（75 DAFB）和果實(shí)成熟儲(chǔ)備充足的K+驅(qū)動(dòng)力。伴隨著桃果實(shí)的不斷發(fā)育和成熟，KT/HAK/KUP家族基因的表達(dá)水平逐漸降低，說(shuō)明桃果實(shí)發(fā)育成熟后這些轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能下降。桃果實(shí)發(fā)育成熟后，體內(nèi)K+有可能向其他組織（例如一年生枝條的韌皮部或樹(shù)干）轉(zhuǎn)移，但依然維持在較高的鉀素營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，維持并保障采收后果實(shí)的基本形態(tài)和鮮質(zhì)量。

Song等研究結(jié)果表明PpeKUPI基因在桃幼苗的根、莖和葉中均有表達(dá)，且在根部易受外界非生物脅迫的調(diào)控。宋志忠等發(fā)現(xiàn)PpeKUPL基因在桃花中的表達(dá)量相對(duì)較低，遠(yuǎn)低于該家族其他成員基因。本研究結(jié)果表明PpeKUP1基因在霞脆桃果實(shí)發(fā)育初期至硬核期（55 DAFB）的表達(dá)量極高，約為其他PpeKUP基因表達(dá)水平的5～20倍，且在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)噴施鉀肥非常敏感，其表達(dá)水平從硬核期（55DAFB）至達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（95DAFB）是持續(xù)被誘導(dǎo)的，提示PpeKUPl是果實(shí)發(fā)育過(guò)程中（特別是幼果形成及發(fā)育初期）重要的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，在維持果肉鉀素營(yíng)養(yǎng)方面發(fā)揮較大作用。盡管Ppe-KUP5基因是桃幼苗（特別是根部）KT/HA K/KUP家族基因中表達(dá)量最高的，但在桃花中的表達(dá)量是極低的。本研究中，PpeKUP5在桃果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)水平僅次于PpeKUPI，且在霞脆桃果實(shí)發(fā)育早期（35～55DAFB）的表達(dá)量較高，但對(duì)噴施鉀肥不敏感。雖然PpeKUP7基因在桃幼苗和桃花中表達(dá)量相對(duì)較低，在霞脆桃果實(shí)中表達(dá)量也是極低的，但對(duì)噴施鉀肥較為敏感，在第2次果實(shí)膨大期（75DAFB）至達(dá)到商業(yè)成熟度時(shí)（95DAFB）其表達(dá)均顯著增強(qiáng)，表明其與PpeKUOI和PpeKUP5在桃果實(shí)發(fā)育與成熟過(guò)程中，是響應(yīng)和增強(qiáng)果肉鉀素營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)所不可或缺的。同時(shí)，在果實(shí)發(fā)育成形并不斷成熟時(shí)，一年生枝條韌皮部和樹(shù)葉也逐漸生長(zhǎng)和發(fā)育，這3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因也有可能在將果實(shí)內(nèi)K+向一年生枝條韌皮部、樹(shù)葉或樹(shù)干的轉(zhuǎn)移和分配中發(fā)揮一定的作用。此外，PpeKUP14～PpeKUP16基因在幼苗根、莖和葉中均有表達(dá)（低于PpeKUP5），但在桃花開(kāi)放后不同時(shí)期均不表達(dá)，PpeKUP14～PpeKUP16在霞脆桃果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期亦檢測(cè)不到，且對(duì)外界鉀肥施用沒(méi)有響應(yīng)，充分表明這3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體可能在桃花開(kāi)放和果實(shí)形成及發(fā)育過(guò)程中不發(fā)揮作用，而可能參與其他生命過(guò)程。